Summary
C57BL / 6 Mäuse wurden verwendet, um Hc Pathogenese zu studieren und bieten das beste Modell. Wir erforschen die potenziellen Vorteile der humoralen Immunität gegen diesen Pilz erzeugt und mehrere mAbs [zum Histon H2B und ein heat shock protein 60kDa], dass wir für ihre Schutzwirkung nach intraperitonealer Verabreichung getestet.
Abstract
Der Zweck der Anwendung dieser Methodik ist 1) unsere Fähigkeit voraus, um Menschen mit Antikörper oder Impfstoff zur Vorbeugung oder Behandlung Histoplasmose durch den Pilz Histoplasma capsulatum und 2) die Rolle der Virulenzfaktoren als Ziel für eine Therapie zu untersuchen schützen. Zur Erzeugung von mAbs, Mäuse immunisiert sind, sind die Immunreaktionen anhand einer Festphasen-ELISA-System in unserem Labor entwickelt und die besten Responder-Mäuse sind für die Isolierung von Milzzellen für die Fusion mit Hybridomzellen ausgewählt. C57BL / 6 Mäuse wurden ausgiebig verwendet, um H.-Studie capsulatum Pathogenese und bieten das beste Modell für die Beschaffung der erforderlichen Daten. Um die Rolle der mAbs in Infektion zu beurteilen, werden Mäuse intraperitoneal entweder mit mAb an H. verabreicht capsulatum oder Isotyp Kontroll-mAb und dann infiziert entweder durch intravenöse (iv), intraperitoneal (ip) oder intranasal (in) Routen. In der wissenschaftlichen Literatur setzt Wirksamkeit von mAbs gegen Pilzinfektionen bei Mäusen auf die Mortalität als Endpunkt, in Verbindung mit Kolonie formin Einheiten (KBE) Einschätzungen zu früheren Zeitpunkten. Survival (Zeit bis zum Tod) Studien sind notwendig, da sie am besten repräsentieren menschliche Krankheiten. So würde die Wirksamkeit unserer Maßnahmen nicht ausreichend, ohne Überlebenskurven ermittelt werden. Dies gilt auch für die Errichtung Wirksamkeit des Impfstoffes oder Prüfung von Mutanten für die Virulenz wahr. Mit Histoplasmose, die Mäuse oft als energisch, um tote über mehrere Stunden gehen. Die Kapazität einer Intervention, wie die Verwaltung eines mAb kann anfänglich zu schützen ein Tier aus Krankheit, aber die Krankheit kann Rückfall, die nicht in kurzer CFU Experimente realisiert werden. Zusätzlich zu Überleben und Pilz-Belastung Assays, untersuchen wir die entzündliche Antwort auf eine Infektion (Histologie, zelluläre Rekrutierung, Zytokin-Antworten). Für das Überleben / Zeit bis zum Tod Experimente werden die Mäuse infiziert und beobachtet mindestens zweimal täglich auf Anzeichen von Morbidität. Um zu beurteilen, Pilz-Belastung, Histopathologie und Zytokinreaktionen werden die Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion eingeschläfert. Tierversuche sind nach den Richtlinien des Institute for Animal Studies der Albert Einstein College of Medicine durchgeführt.
Protocol
1. Wachstum von H. Capsulatum
- Bereiten Sie eine Biosicherheitswerkbank für die Arbeit mit dem Pilz durch die Reinigung der Schrank mit 10% Bleichmittel durch 20 min UV-Bestrahlung gefolgt. H. capsulatum in der Hefe Phase erfordert Biosafety Level (BSL) II Praktiken, während die Form Form erfordert BSLIII. Verwenden Sie Hefe Form in den folgenden Schritten.
- Nächste bereiten ein 15 ml konische Röhrchen mit 5 ml PBS. Ernte eine Kolonie von H. capsulatum (Stamm ATCC Hc G217B) aus einer BHI Blutagarplatte [Glucose 10 g / L, Cystein 0,1 g / L, Penicillin-Streptomycin 1% und rote Blutzellen von Schafen 50 ml / L (Colorado Serum Co., Colorado, USA) ] bei 37 ° C kultiviert oder einen aliquoten aus gefrorenen Hefe Lager bei -80 ° C und fügen Sie sie der PBS. Vortex die Zellen kräftig und Zentrifuge für 1100 xg für 10 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet und fügen 10 mL frisches PBS. Wiederholen Sie diese Prozedur dreimal. Die Zellen in 5 ml PBS und Transfer zu einem 50 mL konischen Rohr.
- Zu stören aggregierten Zellen, vorbei an der Hefezelle Suspension durch eine 26 G1 / 2 Nadel u singen ein 10 mL Spritze 5 Mal in einer Biosicherheitswerkbank (mit Gesichtsschutz). Zur Isolierung kleine, gleichmäßig Größe Hefe, Zentrifuge die Zellen bei 55 xg für 1 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie dann die Besten 1 ml.
- Fügen Sie die Zellsuspension auf eine sterile Erlenmeyerkolben mit 100 ml HAM F12-Medium (Gibco) mit 16g / l Glucose, 1 g / L Glutaminsäure, 8.4mg / L Cystin, 6g / L Glutaminsäure und dann wachsen die Zellen bei 37 ergänzt ° C für 48 h in einem Inkubator mit 150rpm geschüttelt.
2. Hybridoma Wachstum und Aufreinigung von monoklonalen Antikörpern
- Übertragen Sie die ausgewählten Hybridome auf DMEM-Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 10% NCTC, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren und 1% Penicillin-Streptomycin. Wachsen die Zellen in einer Zellkulturflasche (Becton Dickenson) für 5-7 Tage bei 37 ° C / 5% CO 2.
- Dann Zentrifuge das Medium bei 1100 xg für 10 min bei Raumtemperatur und sammeln Sie alle Überstand ohne Störung des Pellets.
- Anschließend reinigen die zellfreie Überstand mit einem Protein A / G Harz durch FPLC.
- Der mAk-Konzentration kann dann durch einen ELISA (1) mit einem IgG Isotyp-Kontrolle als Standard (Abbildung 1B) berechnet werden.
3. Histoplasma capsulatum Inokulum Vorbereitung
- Nehmen Sie einen 48 h Histoplasma capsulatum (Stamm ATCC Hc G217B) Hefephase Kultur in HAM F-12-Medium.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1100 xg für 10 min. Überstand verwerfen und fügen Sie frisches PBS.
- Wiederholen Sie die 3,2 Prozedur 3 mal.
- Pass the Hefezellensuspension 5 mal durch eine 26G1 / 2 Nadel mit einer Spritze.
- Die Suspension bei 55 xg für 1 min auf Pellet verbleibende Zellhaufen. Übertragen Sie den Überstand mit dem einzigen Zellsuspension in ein neues Röhrchen.
- Auflisten der einzelnen Zell-Suspension mit einer Zählkammer.
- Passen Sie die Zellkonzentration um 1,25 x 10 7 Hefe (Überleben) oder 5,0 x 10 6 (CFU, Zytokine und Histologie) in einer Aufschwemmung von <50 ul (Abbildung 2) zu erreichen.
4. Intraperitoneale Verabreichung der MAbs
- Pick-up mit der Maus am Schwanz und Kragen (Abb. 3A). Immobilisierung der Maus durch das Genick des Halses so nah wie möglich theears (achten Sie darauf, nehmen Sie genügend Haut, so dass die Maus den Kopf cannotturn auf der Bearbeiter beißen; 3B und 3C).
- Stabilisieren Sie den Schwanz withthe kleinen Finger leicht gegen die Handfläche (Abbildung 3D) gedrückt.
- Swab die Injektion mit 70% Ethanol, bevor Sie die Nadel und absaugen, um das Blut vor der Injektion zu suchen.
- Verwenden Sie die 26G1 / 2 auf Haut und abdominalmuscles piercethe der mAb-Lösung enthält 500μg (PBS, Isotypkontrollantikörper oder mAb zu prüfenden verdünnt in 1 mL PBS) in thelower linken oder unteren rechten Unterbauch (Bauchhöhle) zu injizieren, mit das Tier in den Kopf Position, kümmert sich um die Membran andother inneren Organe (Abbildung 3E) zu vermeiden.
- Warten Sie kurz vor dem Rückzug der needleto reduzieren die Wahrscheinlichkeit von Leckagen.
- Warten Sie mindestens zwei Stunden, bevor Sie den nächsten Schritt.
5. Maus Anästhesie und intranasale Infektionen
- Bereiten Sie die Betäubung mit Ketamin und Xylazin bei 100 mg / kg und 10 mg / kg. Führen intraperitoneale Verabreichung von PBS, Isotypkontrollantikörper oder experimentellen Antikörper wie in der beiliegenden schriftlichen Protokoll beschrieben. Warten Sie zwei Stunden nach der Injektion mAb vor betäuben die Maus und die Sie mit der intranasalen Infektion.
Bereiten Anästhesie mit Ketamin und Xylazin bei 100 mg / kg und 10 mg / kg (7). - Während der 2h Wartezeit, bereiten die Histoplasma capsulum Inokulum wie in den begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben.
- Gehen Sie nach der itens 5,1 bis 5,5. Toe Prise die Tiere mit einer Pinzette und das Fehlen des Reflexes überprüfen und zu bestätigen, dass die Anästhesie gearbeitet. Nach Betäubung, sanft setzt die Maus durch seine Vorderzähne zu einer Nylon oder Baumwolle String. Verwenden Sie 2-Säule steht, um die Saiten binden, um die Tiere auszusetzen.
- Langsam verwalten rund 50 ul Inokulum in eine nare mit einer Mikropipette, während eine sorgfältige Überwachung der Maus Atemfrequenz. Lassen Sie die Maus, um in dieser Position für 2-5 min nach intranasaler Infektion Rest der Abscheidung der Hefe in das Tier die Lunge (Abb. 3F) zu erleichtern.
- Nach der Maus infiziert wurde, halten Sie die Maustaste in einem überwachten, warme Umgebung (Temperatur zwischen 25 und 37 ° C), sorgfältig unter Verwendung einer Wärmelampe, wenn nötig, bis er aus der Narkose erholt. Wenn die Maus erwacht, schicken Sie es an einem sauberen Käfig mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser. Die Käfige sind für unsere Tier-Anlage zurück und hielt in einem sauberen Tierraum (BLSI).
6. Survival-Studies
- Beurteilen infiziert und mock-infizierten Tieren klinisch Tachypnoe, Lethargie, Abgestumpftheit, und Gewichtsverlust. Die Tiere sollten zweimal täglich im Labor Mitglieder und täglich von Tierpflegern überprüft werden.
- Mit der Maus Histoplasmose, bis nahe an das Ende des Lebens, gibt es normalerweise keine offensichtlichen Anzeichen der Infektion andere als ein leichter Anstieg in der Atemfrequenz. Mit fortgeschrittener Erkrankung, die in der Regel geschieht 10 bis 11 Tagen werden die Mäuse deutlich Tachypnoe und verminderte Aktivität. Typischerweise werden sie rasch zu moribund und verfallen.
- Distressed Tiere entsprechend sollte mit CO 2 in einem eigenen Raum eingeschläfert werden sollte Verstorbene Tiere täglich aufgezählt werden.
7. CFU Studies, Histologie und Zytokine Studies
- Bereiten Sie 15 ml konische Röhrchen mit 10 ml PBS für jedes Organ zu erheben.
- Euthanize Tieren 7 und 14 Tage nach der Infektion mit einem subletalen inuculum (5,0 x 10 6) wie zuvor dargestellt, und entfernen Sie die Lunge, Milz und Leber sofort.
- Nehmen Sie ein Stück von der Orgel zu bewerten und führen Sie die Fixierung in Formalin über Nacht. Die Abschnitte werden unter dem Mikroskop auf pathologische Auswertung untersucht werden.
- Bereiten Sie 50 ml konische Röhrchen mit 5 ml PBS belegt mit 70 um Zelle Siebe für jedes Organ, homogenisiert werden. Mazerat jeweils verbleibende Teil der Organe getrennt in den 50 ml Röhrchen mit sterilen 5 ml Spritze Kolben.
- Als nächstes seriell verdünnten Orgel Homogenaten (1:100, 1:1000 und 1:5000) und die Platte 100 &mgr; l jeder Verdünnung auf BHI-Blut-Agar-Platten (2).
- Add Protease-Inhibitor Tabletten, die Homogenate nach den Herstellerangaben (Roche, Deutschland).
- Die Platten bei 37 ° C für bis zu 14 Tage und aufzählen KBE.
- Centrifuge die Orgel Homogenate 4000xg für 10 min und entfernen Orgel Überstände werden whish in Verwendung in der Zytokin-Assays durch Standardverfahren nach Angaben des Herstellers durchgeführt werden.
8. Monoklonale Antikörper zum Schutz vor H. Capsulatum ist abhängig von Antikörper Spezifität und Isotyp
- MAb Isotyp ist von entscheidender Bedeutung beim Schutz gegen H. capsulatum, als Mäuse mit IgG1 oder IgG2a mAb an Hsp60 behandelt wurden, signifikant verlängertes Überleben im Vergleich zu Mäusen Erhalt einer IgG2b mAb an Hsp60 oder entweder ein Isotyp-Kontroll-mAb oder PBS (Abbildung 4) zu kontrollieren.
- Weitere, in Mäusen, die schützende mAbs erhielten, wurde eine signifikante Reduktion in der Anzahl der Lungen-und Milz-CFU am Tag 7 und sinkt von 2 und 2,5 log-Einheiten von Hefe-Nummern in der Lunge am Tag 14 (Abbildung 5).
Abbildung 1: Wachstum von H. capsulatum und Hybridome. (A) Liquid HAM F-12 Kultur-Präparation aus einer einzelnen Kolonie von H. erhalten capsulatum auf einer BHI-Agar-Platten kultiviert. (B) Hybridoma Wachstum in Zellkulturflaschen und mAb Reinigung durch Protein A / G Harz mit Affinität cromatography.
Abbildung 2: H. capsulatum Inokulum Vorbereitung für die intranasale Infektion. Zellsuspension nach H. erhalten capsulatum Aggregate Störung mit einer Spritze und Zentrifugation wird durch Zählen in einer Zählkammer gezählt. Zellkonzentration ist eingestellt auf 1,25 x 10 7 (Überlebens-Experimente) oder 5 x 10 6 (CFU, Zytokine und Histologie) in <50 ul.
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Abbildung 3: Maus Handhabung während mAb Verwaltung. (A) Die Maus wird durch den Schwanz hob und (B und C), indem das Genick seines Halses zu theears nahe immobilisiert. (D) Der Schwanz ist zwischen dem kleinen Finger und Handfläche. (E) Die mAb-Lösung injiziert wird mit einem 26G1 / 2 Nadel. (F) Der H. capsulatum Inokulum wird intranasal durch vorsichtiges Pipettieren der Zellsuspension in eine nare verwaltet.
Abbildung 4: MAbs zu Hsp60 kann der Pathogenese der Histoplasmose ändern. ip Injektionen mit 500 ug IgG1, IgG2a oder mAbs 2 h vor der Infektion signifikant verlängerten Überlebenszeit (p <0,05, im Vergleich zur Kontrollgruppe), sondern eine IgG2b mAb.
Abbildung 5: CFU-Bestimmungen in den Lungen bei 7 und 14 Tage nach einer subletalen intranasale Herausforderung mit 5x10 6 HC Hefen der behandelten Mäuse ip mit ausgewählten mAb an Hsp60 oder irrelevant mAb zeigte Reduzierung Pilz Belastung für IgG1 und IgG2a mAb behandelten Tieren. Schwarze Balken stellen KBE am Tag 7 und weißen Balken 14 Tage nach der Infektion (* p <0,001 bei 7 Tagen und ** p <0,001 bei 14 Tagen nach der Infektion).
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Discussion
Das Protokoll hier vorgestellten zeigt, dass mAb an H. ist capsulatum ändern können Laufe der experimentellen murinen Histoplasmose. MAbs zu Zelloberflächenantigene von Krankheitserregern können die komplexe Dynamik, die während des Zusammenspiels zwischen einem Host und einem Erreger auftreten. Diese Studie stellt fest, dass mAbs Schutz in einem Mausmodell der tödlichen Histoplasmose vermitteln, wenn intraperitoneal, und es schlägt Kandidaten-Proteine für die Entwicklung von Impfstoffen, wie H2B, M-Antigen (surface Katalase) (3) und Hsp60. In vivo, reduzierte Anwendung von Schutzmaßnahmen mAb an Hc Hsp60 und H2B Orgel Pilz Belastung und Entzündung und ein verlängertes Überleben der infizierten Mäuse.
Obwohl die Entwicklung von Impfstoffen für H. capsulatum ist ein spannendes Forschungsgebiet, kann eine Impfung nicht bei immungeschwächten Personen wirksam, da sie nicht unbedingt zu orchestrieren können eine Immunantwort. Daher ist es klar, dass dieser Population kann meist profitieren passive Therapie mit mAb zu H. capsulatum Antigene. Unsere Daten legen nahe, dass mAbs, besonders Hsp60 oder in Kombination mit anderen mAb an Zelloberflächen-Antigene, könnte die Behandlung von Patienten mit Histoplasmose (4, 6) zu verbessern. Zusätzlich Kombination aus einem mAb zu H. capsulatum mit Antimykotika medikamentöse Therapie kann synergistische und effektiver in die Wirksamkeit des Schutzes. Amphotericin B ist das Mittel der Wahl und in der Regel für die Erstbehandlung von Histoplasmose verwendet. Daher sollte die Zugabe von mAb auf antimykotische medikamentöse Therapie in zukünftigen Studien berücksichtigt werden. In der Tat haben wir bereits einen synergistischen Effekt von mAb an H2B und sub-hemmenden Konzentrationen von Amphotericin B in unserem Tiermodell (5) demonstriert. Darüber hinaus könnte mAbs prophylaktisch in Ausbrüche der Histoplasmose verabreicht werden, insbesondere zu Personen mit hohem Risiko, wie Individuen mit humanen Immundefizienz-Virus-Infektion oder Patienten, die TNF-α-Inhibitoren. Zukünftige Untersuchungen von Schutzmaßnahmen mAb können zusätzliche wichtige Einblicke in die Pathogenese der Histoplasmose und Antikörper-Funktion gegen H. enthüllen capsulatum und vielleicht andere intrazelluläre Erreger.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet (BSL2) | |||
| 15 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| HAM F-12 medium | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 37°C shaker | |||
| Vortex | |||
| 50 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| 26G1/2 needle | BD Biosciences | ||
| 10 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 250 mL flasks | |||
| FPLC (Fast protein liquid chromatography) system | GE Healthcare | ||
| ELISA reader | BioTek | ||
| Anesthesia (ketamine and Xylazine) | |||
| Column stands | |||
| Nylon string | |||
| Heat lamp | |||
| 70μm cell strainers | Falcon BD | ||
| BHI agar plates | GIBCO, by Life Technologies |
References
- Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide. J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).
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