Summary
Topi C57BL / 6 sono stati utilizzati per studiare la patogenesi Hc e fornire il modello migliore. Stiamo esplorando i potenziali benefici dell'immunità umorale contro questo fungo e ha generato anticorpi monoclonali diversi [di istone H2B e 60kDa Heat Shock Protein] che abbiamo testato per la loro efficacia protettiva dopo la somministrazione intraperitoneale.
Abstract
Lo scopo l'uso di questa metodologia è 1) per avanzare la nostra capacità di proteggere le persone con anticorpi o vaccini per prevenire o curare l'istoplasmosi causata dal fungo Histoplasma capsulatum e 2) per esaminare il ruolo dei fattori di virulenza come bersaglio per la terapia. Per generare anticorpi monoclonali, i topi sono immunizzati, le risposte immunitarie sono valutati mediante un solido sistema di fase ELISA sviluppato nel nostro laboratorio, e la migliore topi risponditore vengono selezionati per l'isolamento di splenociti per la fusione con cellule ibridomi. Topi C57BL / 6 sono stati ampiamente utilizzati per studiare H. patogenesi capsulatum e fornire il miglior modello per ottenere i dati richiesti. Al fine di valutare il ruolo del mAbs in infezione, i topi sono intraperitoneale somministrato sia con mAb a H. capsulatum o isotipo controllo di pari mAb e poi infettato da entrambi per via endovenosa (ev), intraperitoneale (ip), o intranasale (in) percorsi. Nella letteratura scientifica, l'efficacia di anticorpi monoclonali per le infezioni fungine nei topi si basa sulla mortalità come un punto finale, in collaborazione con le unità Formin colonia (CFU) valutazioni in momenti precedenti. Sopravvivenza (tempo al decesso) studi sono necessari in quanto rappresentano al meglio la malattia umana. Quindi, l'efficacia del nostro intervento non sarebbe adeguatamente essere stabilito senza curve di sopravvivenza. Questo vale anche per stabilire l'efficacia del vaccino o test di mutanti per la virulenza. Con istoplasmosi, i topi vanno spesso ad essere energici per morto diverse ore. La capacità di un intervento, come la somministrazione di un mAb inizialmente può proteggere un animale dalla malattia, ma la malattia può ricaduta che non potrebbero essere realizzati in breve esperimenti CFU. Oltre a saggi di sopravvivenza e carica fungina, esaminiamo la risposta infiammatoria all'infezione (istologia, reclutamento cellulare, le risposte citochine). Per la sopravvivenza / ora per esperimenti di morte, i topi sono infettati e controllati almeno due volte al giorno per i segni di morbilità. Per valutare la carica fungina, istopatologia, e le risposte delle citochine, i topi sono l'eutanasia in vari momenti dopo l'infezione. Gli esperimenti sugli animali vengono eseguiti secondo le linee guida dell'Istituto per gli studi sugli animali dell'Albert Einstein College of Medicine.
Protocol
1. La crescita di H. Capsulatum
- Preparare un armadio di biosicurezza per lavorare con il fungo pulendo l'armadio con candeggina al 10% seguiti da 20 min irradiazione UV. H. capsulatum in fase di lievito richiede biosicurezza livello (BSL) pratiche II, mentre la forma dello stampo richiede BSLIII. Utilizza il form lievito nei seguenti passi.
- Avanti preparare un tubo da 15 ml con 5 ml di PBS. Raccolta una colonia di H. capsulatum (ceppo ATCC Hc G217B) da una piastra di agar sangue BHI [glucosio 10 g / L, cisteina 0,1 g / L, penicillina-streptomicina 1% e pecore globuli rossi 50 ml / L (Colorado Serum Co., Colorado, USA) ] coltivati a 37 ° C o prelevare un 'aliquota da stock lievito congelato a -80 ° C e aggiungere al PBS. Vortex le cellule vigorosamente e centrifugare per 1100 xg per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con attenzione il sopranatante senza disturbare il pellet e aggiungere 10 ml di PBS fresco. Ripetete questa procedura per tre volte. Sospendere le cellule in 5 ml di PBS e il trasferimento in una provetta da 50 ml.
- Per distruggere le cellule aggregate, passare la sospensione di cellule di lievito con un 26 G1 / 2 ago u cantare una siringa da 10 ml 5 volte in un armadio biosicurezza (con protezione del viso). Per isolare piccoli, lievito uniformemente dimensioni, centrifugare le cellule a 55 g per 1 minuto a temperatura ambiente e quindi rimuovere la parte superiore da 1 ml.
- Aggiungere la sospensione cellulare ad una beuta sterile contenente 100 ml di terreno HAM F12 (GIBCO) integrata con 16 g / L di glucosio, 1g / L di acido glutammico, 8.4mg / L cistina, 6 g / L acido glutammico e poi crescere le cellule a 37 ° C per 48 ore in un incubatore con agitazione 150rpm.
2. Ibridomi crescita e di purificazione degli anticorpi monoclonali
- Trasferire il ibridomi selezionati e medie DMEM contenente 10% siero fetale bovino, il 10% NCTC, 1% di aminoacidi non essenziali e 1% di penicillina-streptomicina. Crescere le cellule in un pallone di colture cellulari (Becton Dickinson) per 5-7 giorni a 37 ° C / 5% di CO 2.
- Centrifugare il supporto a 1100 xg per 10 minuti a temperatura ambiente e raccogliere tutte le sopranatante senza disturbare il pellet.
- Successivamente, purificare il supernatante libero da cellule usando una proteina A / G di resina FPLC.
- La concentrazione mAb può essere calcolato da una cattura ELISA (1) utilizzando un controllo isotipo IgG di serie (Figura 1B).
3. Histoplasma capsulatum Preparazione dell'inoculo
- Prendete un h 48 Histoplasma capsulatum (ceppo ATCC Hc G217B) cultura fase lievito coltivato in HAM F-12 di media.
- Centrifugare le cellule a 1100 xg per 10 min. Eliminare il supernatante e aggiungere PBS fresco.
- Ripetere la procedura di 3,2 3 volte.
- Passare la sospensione di cellule di lievito 5 volte attraverso un 26G1 / 2 aghi con una siringa.
- Centrifugare la sospensione a 55 g per 1 minuto a gruppi di cellule pellet residuo. Trasferire il surnatante contenente la sospensione singola cella in una nuova provetta.
- Enumerare la sospensione singola cella utilizzando un hematocytometer.
- Regolare la concentrazione delle cellule al fine di raggiungere 1,25 x 10 7 lievito (sopravvivenza) o 5,0 x 10 6 (CFU, citochine e istologia) in un suspention di <50 microlitri (Figura 2).
4. Somministrazione intraperitoneale del MAbs
- Sollevare il topo per la coda e la nuca del collo (Fig. 3A). Immobilizzare il mouse per la collottola del collo theears il più vicino possibile (assicurarsi di assumere abbastanza pelle in modo che il mouse cannotturn la testa a mordere la persona che gestisce esso; Figura 3B e 3C).
- Stabilizzare il dito withthe piccola coda leggermente premuto contro il palmo della mano (Fig. 3D).
- Tampone della zona di iniezione con etanolo al 70% prima di inserire l'ago e per aspirare a cercare il sangue prima di iniettare.
- Utilizzare il 26G1 / 2 a piercethe pelle e abdominalmuscles per iniettare la soluzione mAb contenente 500μg (PBS, il controllo degli anticorpi isotipo o il mAb da testare, diluito in 1 ml di PBS) nella sinistra thelower o il basso a destra dell'addome (cavità intraperitoneale), con l'animale nella posizione a testa in giù, avendo cura di evitare gli organi membrana interna andother (Figura 3E).
- Attendere brevemente prima di ritirare il needleto ridurre la probabilità di perdite.
- Attendere almeno due ore prima di procedere alla fase successiva.
5. Topo Anestesia e infezioni intranasale
- Preparare l'anestesia con ketamina e xilazina a 100 mg / kg e 10 mg / kg, rispettivamente. Eseguire la somministrazione intraperitoneale di PBS, il controllo degli anticorpi isotipo, o anticorpi sperimentali, come descritto nel protocollo di accompagnamento scritto. Attendere due ore dopo l'iniezione mAb prima anestetizzare il mouse e procedere con l'infezione intranasale.
Preparare ketamina anestesia utilizzando e xilazina a 100 mg / kg e 10 mg / Kg, rispettivamente (7). - Durante il periodo di 2 ore di attesa, preparare l'inoculo Histoplasma capsulum come descritto nel protocollo di accompagnamento scritto.
- Procedere secondo il itens 5,1-5,5. Toe pizzicare gli animali con una pinzetta e di verificare l'assenza di riflessi e confermare che l'anestesia ha funzionato. Dopo anestesia, delicatamente sospendere il mouse per i suoi denti davanti ad una stringa di nylon o cotone. Utilizzare 2 stand colonna di legare le corde al fine di sospendere gli animali.
- Lentamente amministrare circa 50 microlitri inoculo in un nare utilizzando una micropipetta, mentre segue con attenzione il tasso di respirazione del mouse. Lasciare che il mouse per riposare in questa posizione per 2-5 minuti dopo l'infezione intranasale per facilitare la deposizione del lievito nei polmoni dell'animale (Figura 3F).
- Dopo il mouse è stato infettato, mantenere il mouse in un monitorata, ambiente caldo (temperatura tra i 25 ei 37 ° C), con cura utilizzando una lampada di calore, se necessario, fino a che non recupera dalla anestesia. Quando la sveglia mouse, tornare a una gabbia pulita con accesso ad libitum a cibo e acqua. Le gabbie vengono restituiti al nostro impianto di animali e tenuti in una stanza pulita animale (BLSI).
6. Studi di sopravvivenza
- Valutare gli animali infetti e mock-infettate clinicamente per tachipnea, letargia, ottundimento, e perdita di peso. Gli animali devono essere controllate due volte al giorno da parte dei membri di laboratorio e ogni giorno da custodi degli animali.
- Con istoplasmosi murino, fino quasi alla fine della vita, ci sono di solito segni evidenti dell'infezione diverso da un lieve aumento della frequenza respiratoria. Con malattia avanzata, il che avviene di solito da 10-11 giorni, i topi diventano significativamente tachypneic e hanno diminuita attività. Di solito sono rapidamente diventati moribondo e scadenza.
- Gli animali in difficoltà dovrebbero essere opportunamente eutanasia con CO 2 in una camera dedicata, gli animali deceduti devono essere enumerati tutti i giorni.
7. CFU Studi, Istologia e citochine Studi
- Preparare provette da 15 ml con 10 ml PBS per ogni organo da raccogliere.
- Eutanasia degli animali 7 e 14 giorni dopo l'infezione con un inuculum subletale (5,0 x 10 6) come precedentemente indicato e rimuovere la, milza polmoni e fegato immediatamente.
- Rimuovere un pezzo di organo da valutare ed effettuare la fissazione in formalina durante la notte. Le sezioni saranno esaminate al microscopio per la valutazione patologica.
- Preparare 50 ml provette coniche con 5 ml di PBS superato con 70 filtri cellule micron per ogni organo deve essere omogeneizzato. Macerare ogni restante parte degli organi separatamente nel 50 ml provette sterili con pistoni siringa 5 ml.
- Poi, in serie diluire omogenati d'organo (1:100, 1:1000 e 1:5000) e 100μL piatto di ogni diluizione in BHI piastre di agar-sangue (2).
- Aggiungi compresse inibitore della proteasi per il omogenati in base alle istruzioni del produttore (Roche, Germania).
- Incubare le piastre a 37 ° C per un massimo di 14 giorni e CFU enumerare.
- Centrifugare omogenati d'organo a 4000xg per 10 minuti e rimuovere surnatanti organo, whish saranno utilizzati utilizzati nel test citochine effettuate secondo metodi standard secondo il produttore.
8. Anticorpo monoclonale di protezione contro H. Capsulatum dipende dalla specificità anticorpale e Isotipo
- MAb isotipo è fondamentale per la protezione contro H. capsulatum, come topi trattati con anticorpi monoclonali IgG1 o IgG2a di Hsp60 ha prolungato significativamente la sopravvivenza rispetto ai topi di controllo ricevere un mAb IgG2b di Hsp60 o sia un isotipo di controllo mAb o PBS (Figura 4).
- Inoltre, in topi che avevano ricevuto anticorpi monoclonali di protezione, c'è stata una riduzione significativa del numero di CFU polmonare e splenica al 7 ° giorno e diminuisce di 2 e 2,5 unità log di numeri lievito nei polmoni al giorno 14 (Figura 5).
Figura 1: Crescita di H. capsulatum e ibridomi. (A) HAM liquido preparazione F-12 la cultura da una singola colonia ottenuta da H. capsulatum coltivate su un BHI piastre di agar-sangue. (B) la crescita degli ibridomi in fiasche di coltura cellulare e purificazione mAb da proteina A / G cromatografia di affinità con resina.
Figura 2: H. capsulatum preparazione inoculo di infezione intranasale. Sospensione di cellule ottenute dopo H. capsulatum interruzione aggregati da siringa e centrifugazione viene enumerato contando, in un emocitometro. La concentrazione delle cellule è regolata a 1,25 x 10 7 (esperimenti di sopravvivenza) o 5 x 10 6 (CFU, citochine e istologia) a <50 microlitri.
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Figura 3: la gestione del mouse durante mAb amministrazione. (A) Il mouse è preso per la coda e (B e C) immobilizzato tenendo la nuca del suo collo il più vicino possibile theears. (D) La coda è tenuta tra il mignolo e il palmo. (E) La soluzione mAb viene iniettato tramite un 26G1 / 2 ago. (F) Il H. capsulatum inoculo è somministrato per via intranasale pipettando gentilmente la sospensione cellulare in un Nare.
Figura 4: MAbs di Hsp60 possono alterare la patogenesi di istoplasmosi. iniezioni ip con 500 mcg di IgG1, o IgG2a mAbs 2 ore prima di infezione prolungato significativamente la sopravvivenza (p <0,05, rispetto ai controlli), ma un IgG2b mAb.
Figura 5: CFU determinazioni nei polmoni a 7 e 14 giorni dopo una sfida subletale intranasale con 5x10 6 lieviti Hc ip di topi trattati con anticorpi monoclonali selezionati per Hsp60 o irrilevanti mAb ha mostrato una riduzione degli oneri fungine per IgG1 e IgG2a animali trattati con anticorpi monoclonali. Barre nere rappresentano CFU al giorno 7 e barre bianche 14 giorni dopo l'infezione (* p <0,001 a 7 giorni e ** p <0,001 a 14 giorni dall'infezione).
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Discussion
Il protocollo presentato qui dimostra che mAb di H. capsulatum può modificare il corso di sperimentale istoplasmosi murini. MAbs di antigeni di superficie di patogeni possono modificare le complesse dinamiche che si verificano durante l'interazione tra un host e un agente patogeno. Questo studio stabilisce che mAbs mediare protezione in un modello murino di istoplasmosi letale quando iniettato per via intraperitoneale, e suggerisce proteine candidate per lo sviluppo del vaccino, come H2B, antigene M (superficie catalasi) (3) e Hsp60. In vivo, la somministrazione di anticorpi monoclonali di protezione per Hc Hsp60 e H2B ridotta carica fungina organo e l'infiammazione e la prolungata sopravvivenza dei topi infettati.
Anche se lo sviluppo di vaccini per H. capsulatum è un'area interessante di ricerca, la vaccinazione può non essere efficace in soggetti immunocompromessi, poiché non possono necessariamente orchestrare una risposta immunitaria. Quindi, è chiaro che questa popolazione possono trarre beneficio dalla terapia per lo più passiva con mAb a H. antigeni capsulatum. I nostri dati suggeriscono che anticorpi monoclonali, in particolare di Hsp60 o in combinazione con altri anticorpi monoclonali per antigeni di superficie cellulare, potrebbe migliorare il trattamento dei pazienti con istoplasmosi (4, 6). Inoltre, la combinazione di un mAb a H. capsulatum con terapia farmacologica antimicotica può essere sinergico e più efficace in termini di efficacia protettiva. Amfotericina B è il farmaco di scelta e di solito utilizzato per il trattamento iniziale di istoplasmosi. Quindi, l'aggiunta di mAb alla terapia farmacologica antifungina deve essere considerato in studi futuri. In effetti, abbiamo precedentemente dimostrato un effetto sinergico di anticorpi monoclonali per H2B e sub-inibitoria concentrazioni di amfotericina B nel nostro modello animale (5). Inoltre, anticorpi monoclonali potrebbero essere somministrato come profilassi per i focolai di istoplasmosi, soprattutto per soggetti ad alto rischio, come le persone con infezione da virus dell'immunodeficienza o pazienti trattati con inibitori del TNF-α. Indagini futuro della protezione mAb possono rivelare ulteriori importanti conoscenze della patogenesi di istoplasmosi e la funzione di anticorpi contro H. capsulatum e, forse, altri patogeni intracellulari.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet (BSL2) | |||
| 15 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| HAM F-12 medium | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 37°C shaker | |||
| Vortex | |||
| 50 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| 26G1/2 needle | BD Biosciences | ||
| 10 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 250 mL flasks | |||
| FPLC (Fast protein liquid chromatography) system | GE Healthcare | ||
| ELISA reader | BioTek | ||
| Anesthesia (ketamine and Xylazine) | |||
| Column stands | |||
| Nylon string | |||
| Heat lamp | |||
| 70μm cell strainers | Falcon BD | ||
| BHI agar plates | GIBCO, by Life Technologies |
References
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