Summary
C57BL / 6 muizen werden gebruikt om Hc pathogenese bestuderen en het beste model te bieden. We zijn het verkennen van de potentiële voordelen van humorale immuniteit tegen deze schimmel en genereerde verschillende mAb's [om histon H2B en een heat shock protein 60kDa] die we getest op hun beschermende werking na intraperitoneale toediening.
Abstract
Het doel van het gebruik van deze methodiek is 1) om onze capaciteit verder te gaan naar personen met een antilichaam of vaccin voor het voorkomen of behandelen histoplasmose veroorzaakt door de schimmel Histoplasma capsulatum en 2) de rol van virulentiefactoren te onderzoeken als doelwit voor de therapie te beschermen. Voor het genereren van mAb's, muizen geïmmuniseerd, worden de immuunreacties beoordeeld met behulp van een vaste fase ELISA-systeem ontwikkeld in ons laboratorium, en de beste responder muizen zijn geselecteerd voor het isoleren van splenocyten voor de fusie met hybridoma cellen. C57BL / 6 muizen zijn uitgebreid gebruikt om de H. studie capsulatum pathogenese en bieden het beste model voor het verkrijgen van de vereiste gegevens. Om de rol van de mAbs in infectie te beoordelen, muizen intraperitoneaal toegediend met mAb aan H. capsulatum of isotype gematchte controle mAb en vervolgens geïnfecteerd door een intraveneuze (iv), intraperitoneale (ip) of intranasaal (in) routes. In de wetenschappelijke literatuur, werkzaamheid van mAbs voor schimmelinfecties in muizen is gebaseerd op de sterfte als een eindpunt, in combinatie met kolonie formin eenheden (CFU) taxaties op eerdere tijdstippen. Overleving (tijd tot overlijden) studies zijn nodig omdat zij het best vertegenwoordigen menselijke ziekten. Zo zou doeltreffendheid van onze interventie niet afdoende worden vastgesteld zonder overlevingscurven. Dit geldt ook voor het vaststellen van de werkzaamheid van het vaccin of het testen van de mutanten voor de virulentie. Met histoplasmose, de muizen gaan vaak van die energieke om dode gedurende een aantal uren. De capaciteit van een interventie, zoals het toedienen van een mAb kan een dier in eerste instantie te beschermen tegen ziekte, maar de ziekte kan terugvallen, die niet zou worden gerealiseerd op korte CFU experimenten. In aanvulling op de overleving en schimmels last testen, onderzoeken we de inflammatoire respons op infectie (histologie, cellulair werving en selectie, cytokine responsen). Om te overleven / tijd om dood experimenten, zijn de muizen geïnfecteerd en gecontroleerd minstens tweemaal per dag op tekenen van ziekelijkheid. Voor de beoordeling van schimmel last, histopathologie, en cytokine respons, zijn de muizen gedood op verschillende tijdstippen na infectie. Dierproeven worden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Institute for Animal Studies van de Albert Einstein College of Medicine.
Protocol
1. Groei van H. Capsulatum
- Bereid een bioveiligheid kast voor het werken met de schimmel door het schoonmaken van de kast met 10% bleekmiddel, gevolgd door 20 minuten UV-straling. H. capsulatum in de gist fase vereist Biosafety level (BSL) II praktijken, terwijl de schimmel vorm vereist BSLIII. Gebruik van gist vorm in de volgende stappen.
- Volgende bereiden een 15 ml conische buis met 5 ml PBS. Oogst een kolonie van H. capsulatum (stam Hc ATCC G217B) van een BHI bloed agar plaat [glucose 10 g / L, cysteïne 0,1 g / L, penicilline-streptomycine 1% en schapen rode bloedcellen 50 ml / L (Colorado Serum Co, Colorado, USA) ] gekweekt bij 37 ° C of nemen een hoeveelheid van ingevroren gist voorraad bij -80 ° C en voeg deze toe aan het PBS. Vortex de cellen krachtig en centrifugeer voor 1100 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig het supernatans af zonder de pellet te verstoren en voeg 10 ml verse PBS. Herhaal deze procedure drie keer. Hang de cellen in 5 ml PBS en overdragen aan een 50 ml conische buis.
- Te verstoren geaggregeerde cellen, passeren de gist celsuspensie door middel van een 26 G1 / 2 naald u zingen een 10 ml injectiespuit 5 keer in een bioveiligheid kast (met behulp van het gezicht bescherming). Te isoleren kleine, uniform-en kleinbedrijf gist, centrifuge de cellen bij 55 xg gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en verwijder vervolgens de top 1 ml.
- Voeg de celsuspensie om een steriele erlenmeyer met 100 ml van HAM F12 medium (GIBCO), aangevuld met 16g / L glucose, 1 g / L glutaminezuur, 8.4mg / L cystine, 6g / L glutaminezuur en dan groeien de cellen op 37 ° C gedurende 48 uur in een incubator met 150rpm schudden.
2. Hybridoma Groei en zuivering van monoklonale antilichamen
- Overdracht van de geselecteerde hybridoma's te DMEM medium met 10% foetaal kalf serum, 10% NCTC, 1% niet-essentiële aminozuren en 1% penicilline-streptomycine. Groeien de cellen in een celkweek kolf (Becton Dickenson) voor 5-7 dagen bij 37 ° C / 5% CO 2.
- Centrifugeer het medium op 1100 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur en het verzamelen van alle bovenstaande vloeistof zonder verstoring van de pellets.
- Vervolgens zuiveren de cel vrij supernatant met behulp van een proteïne A / G hars door de FPLC.
- De mAb concentratie kan dan worden berekend door een capture ELISA (1) met behulp van een IgG isotype controle als standaard (Figuur 1B).
3. Histoplasma capsulatum Inoculum Voorbereiding
- Neem een 48 uur Histoplasma capsulatum (stam Hc ATCC G217B) gist fase cultuur gekweekt in HAM F-12 medium.
- Centrifugeer de cellen bij 1100 xg gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant en voeg verse PBS.
- Herhaal de procedure 3.2 3 keer.
- Passeren de gist celsuspensie 5 keer door middel van een 26G1 / 2 naald met behulp van een injectiespuit.
- Centrifugeer de suspensie bij 55 xg gedurende 1 minuut tot pellet resterende cel clusters. Breng de bovenstaande met de enkele celsuspensie naar een nieuwe buis.
- Inventariseer de enkele celsuspensie met behulp van een hematocytometer.
- Pas de cel concentratie om 1.25 x 10 7 gist (overleving) of 5,0 x 10 6 (CFU, cytokines en histologie) in een suspention van <50 il (figuur 2) te bereiken.
4. Intraperitoneale toediening van de MAbs
- Pak de muis bij zijn staart en het nekvel (afb. 3A). Immobiliseren de muis door het nekvel van zijn nek zo dicht mogelijk bij theears mogelijk (zorg ervoor dat tot het nemen van voldoende huid, zodat de muis zijn hoofd cannotturn aan de persoon die behandeling het bijten, Figuur 3B en 3C).
- Het stabiliseren van de staart metde pink voorzichtig gedrukt tegen de palm van de hand (Figuur 3D).
- Wattenstaafje de injectieplaats met 70% ethanol voor het plaatsen van de naald en te zuigen om voor bloed te kijken alvorens te injecteren.
- Gebruik de 26G1 / 2 tot en met huid en abdominalmuscles piercethe de mAb oplossing die 500μg (PBS, isotype controle antilichaam mAb of het te testen, verdund in 1 ml PBS) in thelower naar links of rechts onderaan de buik kwadrant (intraperitoneaal holte) injecteren, met het dier in het hoofd omlaag, en zorg ervoor dat het diafragma andother interne organen (figuur 3E) te vermijden.
- Wacht even voor intrekking van de needleto verkleinen de kans op lekkage.
- Wacht een minimum van twee uur voordat u verder gaat met de volgende stap.
5. Muis Anesthesie en Intranasale Infecties
- De voorbereiding van de anesthesie met ketamine en xylazine bij 100 mg / kg en 10 mg / kg, respectievelijk. Voer intraperitoneale toediening van PBS, isotype controle antilichaam, of experimenteel antilichaam zoals beschreven in de bijgevoegde geschreven protocol. Wacht twee uur na mAb injectie voor verlamming van de muis en verder gaat met de intranasale infectie.
Bereid anesthesie met behulp van ketamine en xylazine bij 100 mg / kg en 10 mg / kg respectievelijk (7). - Tijdens de 2h wachttijd, de voorbereiding van de Histoplasma capsulum inoculum, zoals beschreven in de bijbehorende geschreven protocol.
- Ga verder volgens de Itens 5,1 tot 5,5. Toe knijpen de dieren met een pincet en de afwezigheid van reflex te controleren en te bevestigen dat de verdoving werkte. Na anaesthetization, zachtjes de muis te schorten door haar voortanden naar een nylon of katoenen touw. Gebruik 2 kolom staat de snaren binden, om de dieren op te schorten.
- Langzaam toedienen van ongeveer 50 ul inoculum in een nare met behulp van een micropipet terwijl nauwlettend de muis ademhaling. Laat de muis om in deze positie rust voor 2-5 min na intranasale infectie aan de afzetting van de gist te vergemakkelijken in de longen van het dier (figuur 3F).
- Nadat de muis is geïnfecteerd, blijven de muis in een gecontroleerde, warme omgeving (temperatuur tussen 25 en 37 ° C), zorgvuldig gebruik te maken van een warmtelamp, indien nodig, totdat hij herstelt van de narcose. Wanneer de muis wakker, terug te sturen naar een schone kooi met ad libitum toegang tot voedsel en water. De kooien worden terug gestuurd naar onze dierlijke faciliteit en bewaard in een schone dier kamer (BLSI).
6. Survival Studies
- Klinisch beoordelen geïnfecteerde en mock-besmette dieren voor tachypneu, lethargie, verdoving, en gewichtsverlies. Moeten de dieren twee keer per dag worden gecontroleerd door het laboratorium van de leden en dagelijks door de dierverzorgers.
- Met muizen histoplasmose, tot vlak voor het einde van het leven, zijn er meestal geen duidelijke tekenen van de infectie anders dan een lichte verhoging van de ademhaling. Met gevorderde ziekte, die meestal gebeurt vanuit 10-11 dagen, de muizen beduidend tachypneic en hebben verminderde activiteit. Typisch ze in korte tijd uitgegroeid stervende en vervallen.
- Verontruste dieren moeten adequaat worden gedood met CO 2 in een speciale kamer, moet Overleden dieren dagelijks worden opgesomd.
7. CFU Studies, Histologie en cytokinen Studies
- Bereid 15 ml conische buizen met 10 ml PBS voor elk orgaan te worden verzameld.
- Euthanaseren dieren 7 en 14 dagen na infectie met een subletale inuculum (5,0 x 10 6), zoals eerder aangegeven en verwijder onmiddellijk de longen, milt en lever.
- Verwijder een stuk van het orgel te evalueren en uit te voeren de fixatie in formaline 's nachts. De secties worden onderzocht onder de microscoop voor pathologische evaluatie.
- Bereid 50 ml conische buizen met 5 ml PBS afgewerkt met 70 micrometer cel zeven voor elk orgaan te worden gehomogeniseerd. Afzonderlijk maceraat elke resterende deel van de organen in de 50 ml buizen met behulp van steriele spuit 5 ml plunjers.
- Volgende, in serie verdunnen orgel homogenaten (1:100, 1:1000 en 1:5000) en de plaat 100μL van elke verdunning op BHI-bloed agar platen (2).
- Voeg protease-remmer tabletten om de homogenaten volgens de fabricage van de instructies (Roche, Duitsland).
- Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende maximaal 14 dagen en sommen CFU's.
- Centrifugeer het orgel homogenaten op 4000xg gedurende 10 minuten en verwijder orgel supernatant, zal wens worden gebruikt in gebruikt in de cytokine testen uitgevoerd door standaard methoden volgens de fabrikant.
8. Monoklonale antilichaam Bescherming tegen H. Capsulatum is afhankelijk van antilichaamspecificiteit en isotype
- MAb isotype is van cruciaal belang in de bescherming tegen H. capsulatum, zoals muizen behandeld met IgG1 of IgG2a mAbs te HSP60 zijn aanzienlijk verlengde overleving in vergelijking met muizen die een IgG2b mAb aan HSP60 of een van een isotype controle mAb of PBS (figuur 4) te controleren.
- Verder, in muizen die beschermende mAb's ontvangen, was er een significante vermindering van het aantal pulmonaire en milt CFU op dag 7 en de afname van 2 en 2,5 log-eenheden van gist nummers in de longen op dag 14 (figuur 5).
Figuur 1: Groei van H. capsulatum en hybridoma's. (A) Liquid HAM F-12 de bereiding van een enkele kolonie afkomstig van H. capsulatum gekweekt op een BHI-bloed agar platen. (B) Hybridoma groei in celkweek kolven en mAb zuivering door proteïne A / G hars met behulp van affiniteit cromatography.
Figuur 2: H. capsulatum inoculum voorbereiding voor intranasale infectie. Celsuspensie verkregen na H. capsulatum aggregaten verstoring door de spuit en centrifugeren wordt geïnventariseerd door het tellen in een hemocytometer. Celconcentratie wordt aangepast aan 1,25 x 10 7 (overleving experimenten) of 5 x 10 6 (CFU's, cytokines en histologie) in <50 uL.
upload/2532/2532fig3.jpg "alt =" Figuur 3 "/>
Figuur 3: Muis behandeling tijdens mAb administratie. (A) De muis wordt opgepikt door de staart en (B en C) geïmmobiliseerd door die de nekvel van zijn nek zo dicht mogelijk bij theears. (D) De staart is gehouden tussen de pink en de handpalm. (E) De mAb oplossing wordt geïnjecteerd met behulp van een 26G1 / 2 naald. (F) De H. capsulatum inoculum wordt intranasaal toegediend door voorzichtig pipetteren de celsuspensie in een nare.
Figuur 4: MAbs tot HSP60 kunnen de pathogenese van histoplasmose veranderen. ip injecties met 500 ug van IgG1, of IgG2a mAbs twee uur voorafgaand aan de infectie significant langere overleving (p <0,05, in vergelijking met controles), maar een IgG2b mAb.
Figuur 5: CFU bepalingen in de longen op 7 en 14 dagen na een subletale intranasale uitdaging met 5x10 6 Hc gisten van muizen behandeld ip met geselecteerde mAbs te HSP60 of irrelevante mAb toonde aan vermindering van de lasten voor de schimmel IgG1 en IgG2a mAb's behandelde dieren. Zwarte balken geven CFU's op dag 7 en witte balken 14 dagen na de infectie (* p <0,001 na 7 dagen en ** p <0,001 na 14 dagen na besmetting).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier gepresenteerde laat zien dat mAb's te H. capsulatum kunt de loop van de experimentele muizen histoplasmose. MAbs aan het celoppervlak antigenen van ziekteverwekkers kunt de complexe dynamiek die zich voordoen tijdens het samenspel tussen een host en een ziekteverwekker. Deze studie stelt vast dat mAbs bescherming in een muizenmodel van dodelijke histoplasmose bemiddelen bij het intraperitoneaal geïnjecteerd, en het suggereert de kandidaat-eiwitten voor de ontwikkeling van vaccins, zoals H2B, M antigeen (oppervlakte catalase) (3) en HSP60. In vivo toediening van beschermende mAbs te Hc HSP60 en H2B minder orgel schimmel lasten en ontsteking en verlengde de overleving van geïnfecteerde muizen.
Hoewel de ontwikkeling van een vaccin voor H. capsulatum is een spannend gebied van onderzoek, kan vaccinatie niet effectief zijn in immuungecompromitteerde personen, omdat ze niet per se orkestreren een immuunrespons. Daarom is het duidelijk dat deze groep vooral kunnen profiteren van de passieve behandeling met mAb aan H. capsulatum antigenen. Onze gegevens suggereren dat mAbs, vooral om HSP60 of in combinatie met andere mAbs naar cel oppervlakte-antigenen, kan de behandeling van patiënten met histoplasmose (4, 6) te verbeteren. Bovendien, een combinatie van een mAb aan H. capsulatum met antifungale behandeling met medicijnen kan worden synergetische en meer effectief in het beschermende effect. Amfotericine B is het middel van keuze en meestal gebruikt voor de initiële behandeling van histoplasmose. Vandaar dat de toevoeging van mAb aan antifungale therapie worden overwogen in toekomstige studies. In feite hebben we eerder een synergistisch effect aangetoond van mAbs te H2B en sub-remmende concentraties van amfotericine B in ons diermodel (5). Bovendien kan mAb's profylactisch toegediend worden in het uitbreken van histoplasmose, in het bijzonder hoog-risico individuen, zoals personen met het humaan immunodeficiëntie virus infectie of patiënten die TNF-α-remmers. Toekomstige onderzoeken van beschermende mAb kan nog meer belangrijke inzichten in de pathogenese van histoplasmose en antilichaam-functie tegen H. capsulatum en, misschien, voor andere intracellulaire pathogenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet (BSL2) | |||
| 15 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| HAM F-12 medium | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 37°C shaker | |||
| Vortex | |||
| 50 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| 26G1/2 needle | BD Biosciences | ||
| 10 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 250 mL flasks | |||
| FPLC (Fast protein liquid chromatography) system | GE Healthcare | ||
| ELISA reader | BioTek | ||
| Anesthesia (ketamine and Xylazine) | |||
| Column stands | |||
| Nylon string | |||
| Heat lamp | |||
| 70μm cell strainers | Falcon BD | ||
| BHI agar plates | GIBCO, by Life Technologies |
References
- Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide. J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).
- Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77. , 1357-1367 (2009).
- Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum. PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).
- Nosanchuk, J. D. Protective antibodies and endemic dimorphic fungi. Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).
- Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. eepe, &, G. S., Casadevall, A. Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum. J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).
- Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S. Jr, ,, Casadevall, A. Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum. J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).
- Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab Anim. 27, 30-39 (1993).
