Summary
C57BL / 6 마우스는 HC의 pathogenesis을 연구하고 최상의 모델을 제공하는 데 사용되었습니다. 우리는이 곰팡이에 대한 체액성 면역의 가능성 혜택을 탐구하고 [히스톤 H2B와 열 충격 단백질 60kDa로] 여러 mAbs를 생성 우리가 intraperitoneal 행정부 이후에 그들의 보호 효능에 대한 테스트 것을.
Abstract
이 방법론의 사용 목적은 항체 또는 균류 Histoplasma capsulatum 2) 치료 대상으로 독성 요소의 역할을 검토로 인한 히스토플라스마증을 예방하거나 치료를위한 백신과 개인을 보호하기 위해 우리의 역량을 발전) 1입니다. mAbs를 생성하려면, 마우스가 예방 접종되고 면역 반응은 우리의 연구실에서 개발한 고체 위상 엘리사 시스템을 사용 평가하고 있으며, 최고의 응답의 마우스는 하이 브리 도마 세포와 융합을위한 splenocytes의 격리를 위해 선택됩니다. C57BL / 6 생쥐는 광범위 H. 연구하는 데 사용되었습니다 capsulatum pathogenesis하고 필요한 데이터를 얻기위한 최상의 모델을 제공합니다. 감염에 mAbs의 역할을 평가하기 위해서는, 마우스는 H.에 mAb 중과 관리 intraperitoneally 아르 capsulatum 또는 isotype도 정맥 주사 (IV), intraperitoneal (IP) 또는 비강 (인) 노선에 의해 제어 mAb와 일치하고 감염. 과학 문학, 마우스에 곰팡이 감염 mAbs의 효능은 이전 시간 지점에서 콜로니 formin 단위 (CFU) 평가와 함께, 끝점으로 사망률에 의존합니다. 그들은 최고의 인간의 질병을 대표로 생존 (사망 시간) 연구가 필요합니다. 따라서, 우리의 개입의 효능은 충분히 생존 곡선없이 설정할 수 없습니다 것입니다. 이것은 백신이나 독성에 대한 돌연변이 검사의 효능을 수립에도 적용됩니다. 히스토플라스마증와 생쥐는 종종 몇 시간 동안 죽은 활기찬되는 이동합니다. 이러한 mAb의 행정으로 개입의 용량은 처음에는 질병으로부터 동물을 보호 수 있지만, 질병은 짧은 CFU 실험의 재발을 실현 않을 수있는. 생존과 곰팡이 부담 assays 이외에, 우리는 감염 (조직학, 세포 채용, 시토킨 응답)로 염증 반응을 검사합니다. 생존 / 사망 실험 시간은 생쥐는 병적 상태의 흔적에 대해 최소한 회 감염 감시하고 있습니다. 곰팡이 부담, 조직 병리학, 그리고 시토킨 반응을 평가하기 위해, 생쥐는 감염 후 여러 시간에 euthanized 있습니다. 동물 실험은 의학의 알버트 아인슈타인 대학 동물 연구소의 지침에 따라 수행됩니다.
Protocol
1. H.의 성장 Capsulatum
- 20 분 자외선 조사에 의해 다음 10 % 표백제와 캐비닛을 청소하여 곰팡이와 함께 일을 biosafety 캐비닛을 준비합니다. H.이 금형 양식 BSLIII을 필요로하는 동안 효모 단계에 capsulatum은 Biosafety 레벨 (BSL) II 관행이 필요합니다. 다음 단계에서 효모 양식을 사용하십시오.
- 다음 PBS 5 ML과 15 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. H.의 식민지를 수확 BHI 혈액 한천 플레이트 [포도당 10g / L, 시스테인 0.1 g / L, 페니실린 - 스트렙토 마이신 1퍼센트 및 양 적혈구 50 ML / L (콜로라도 세럼 (주), 콜로라도, 미국)에서 capsulatum (변형 HC ATCC G217B) ] 37 ° C에서 재배 또는 -80 ° C에서 냉동 효모 주식에서 나누어지는을하고 PBS에 추가합니다. 적극적으로 소용돌이 세포를하고 실온에서 10 분 1,100 XG를위한 원심 분리기. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는를 제거하고 신선한 PBS의 10mL를 추가합니다. 이 절차를 세 번 반복합니다. 50 ML 원뿔 관에 PBS 및 tranfer의 5mL에있는 세포를 일시 중지합니다.
- 집계 세포를 중단하려면, 10mL 주사기에게 biosafety 캐비닛 (안면 보호를 사용하여)에서 5 번 노래 26 G1 / 2 바늘 U를 통해 효모 세포 현탁액을 전달합니다. 작은 균일 크기의 효모를 분리, 상온에서 1 분 55 XG에있는 세포를 원심 후 상위 1 ML를 제거합니다.
- 16g / L 포도당, 1g / L 글루탐산, 8.4mg / L 시스틴, 6g / L 글루탐산 후 37 세포의 성장과 함께 보충 햄 F12 매체의 100 ML (GIBCO)를 포함하는 멸균 erlenmeyer 플라스크에 세포 현탁액을 추가 ° 150rpm 잡고 인큐베이터에서 48 H를위한 C.
2. 단클론 항체의 하이 브리 도마 성장과 정제
- 10% 태아 송아지 혈청, 10 % NCTC, 1 %가 아닌 필수 아미노산, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신을 포함한 DMEM 매체로 선택한 hybridomas을 전송합니다. 37 5~7일위한 세포 배양 플라스크 (백톤 디컨슨)에 세포를 성장 ° C / 5 % CO 2.
- 그런 다음 실온에서 10 분 1,100 XG에서 매체를 원심과 알약을 중단하지 않고 모든 표면에 뜨는를 수집합니다.
- 다음 단백질 FPLC로 A / G 수지를 사용하여 셀 무료 뜨는 정화.
- mAb 농도는 다음 표준으로 IgG의 isotype 제어 (그림 1B)를 사용하여 캡처 엘리사 (1)로 계산하실 수 있습니다.
3. Histoplasma Capsulatum의 Inoculum 준비
- 햄 F - 12 중간에서 자란 48 H Histoplasma capsulatum (변형 HC ATCC G217B) 효모 위상 문화를 가져가라.
- 10 분 1,100 XG에서 세포를 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 신선한 PBS를 추가합니다.
- 3.2 프로 시저에게 3 번 반복합니다.
- 주사기를 사용하여 26G1 / 2 바늘을 통해 효모 세포 현탁액에게 5 번 패스.
- 펠렛 잔여 세포 클러스터 1 분 55 XG의 현탁액을 원심 분리기. 새로운 튜브로 단일 세포 현탁액을 포함하고있는 뜨는을 전송합니다.
- hematocytometer를 사용하여 단일 세포 현탁액을 열거합니다.
- 1.25 X 10 7 효모 (서바이벌) 또는 5.0 × 10 6 (CFU, 크린 시토킨 및 조직학) <50 μL (그림 2)의 suspention에 달성하기 위해 세포 농도를 조정합니다.
4. MAbs의 Intraperitoneal 관리
- 꼬리와 목의 아저씨 (그림 3A)에서 마우스를 선택하십시오. 가능한 theears (; 그림 3B와 3C 마우스 그것을 취급하는 사람을 물려고 머리를 cannotturn 있도록 충분히 피부를 차지해야합니다)에 가까운로서 목의 아저씨로 마우스를 고정.
- 부드럽게 손 (그림 3D)의 손바닥에 대해 누르면 꼬리 withthe 작은 손가락을 안정.
- 면봉 바늘과 주입하기 전에 혈액을 찾아 대기음로 배치하기 전에 70 %의 에탄올로 분사 영역입니다.
- 함께 thelower의 왼쪽이나 오른쪽 아래 복부 사분면 (intraperitoneal 구멍)에 500μg을 (PBS, isotype 제어 항체 또는 mAb 1 ML PBS에 희석, 테스트)를 포함하는 mAb 솔루션을 주입하기 위해 피부와 abdominalmuscles을 piercethe하는 26G1 / 2를 사용하여 격막 andother 내장 (그림 3E)을 피하기 위해 돌보는 위치 아래 머리에 동물.
- needleto가 누출의 가능성을 줄일 수 철수하기 전에 잠시 만요.
- 다음 단계로 진행하기 전에 2 시간 최소 기다립니다.
5. 마우스 마취과와 비강 감염
- 100 MG / kg, 10 MG / kg, 각각의 마취제와 xylazine을 사용하여 마취를 준비합니다. intraperitoneal PBS의 행정, isotype 제어 항체 또는 동행하는 서면 프로토콜에서 설명한대로 실험 항체를 수행합니다. 마우스를 anesthetizing과 비강 감염하기 전에 mAb 주입 후 두 시간 기다려.
100 MG / kg, 10 MG / kg, 각각 (7)에서 사용하는 마취 마취제와 xylazine를 준비합니다. - 2 시간 대기 기간 동안 같이 동행하는 서면 프로토콜에 설명되어있는 Histoplasma capsulum의 inoculum을 준비합니다.
- 5.5 itens 5.1에 따라 진행합니다. 트위터와 함께 동물을 공략 발가락과 반사의 부재를 확인하고 마취가 작동 확인합니다. anaesthetization 후, 부드럽게 나일론이나 목화 문자열하기 위해 앞니로 마우스를 일시 중지합니다. 동물을 중지하기 위해 문자열을 묶어 2 열 스탠드를 사용하십시오.
- 천천히 밀접하게 마우스의 호흡 속도를 모니터링하면서 micropipette를 사용하여 nare로 약 50 μl inoculum을 관리할 수 있습니다. 마우스 동물의 폐 (그림 3 층)에 효모의 증착을 촉진하기 위하여 비강 감염 후 2-5 분이 자리에서 휴식을 허용합니다.
- 마우스가 감염된 후, 필요한 경우는 마취에서 회복까지 신중하게, 가열 램프를 활용, 모니터, 따뜻한 환경 (25 37 ° C 사이의 온도)에 마우스를 유지합니다. 때 마우스 깨우고, 음식과 물이 광고 libitum 접속 깨끗한 케이지로 돌아갑니다. 케이지는 우리 동물 시설에 반환하고 깨끗한 동물 방 (BLSI)에 보관됩니다.
6. 서바이벌 연구
- tachypnea, 혼수, obtundation 및 체중 감량에 대한 임상 감염 모의 - 감염된 동물을 평가합니다. 동물 실험실 회원 및 동물 관리 인에 의해 매일에 의해 두 번 매일 확인하여야한다.
- murine 히스토플라스마증로 삶의 끝에 닫을 때까지, 호흡 속도에 가벼운 증가 이외의 감염에 대한 명백한 신호는 일반적으로 없습니다. 보통 10~11일에서 일어나는 고급 질환으로, 마우스는 상당히 tachypneic되어 감소 활동을했습니다. 일반적으로 그들은 신속하게 죽어가는되어 만료됩니다.
- 고민 동물 전용 실내의 CO 2와 적절한 euthanized해야 죽은 동물은 매일 열거해야합니다.
7. CFU 연구, 조직학 및 크린 시토킨 연구
- 수집하는 각 기관에 대한 10mL PBS로 15 ML 원뿔 튜브를 준비합니다.
- 로 이전에 표시된 sublethal inuculum (5.0 × 10 6)과 동물 7 감염 후 14 일 안락사 즉시 폐, 비장과 간장을 제거하십시오.
- 평가할 수있는 기관의 조각을 제거하고 포르말린 하룻밤에 고정을 수행합니다. 섹션은 병리 평가를 위해 현미경으로 검사됩니다.
- 5mL PBS로 50 ML 원뿔 튜브 준비는 균질하는 각 기관은 70 μm의 세포 strainers 얹은. 무균 5mL 주사기의 plungers를 사용하여 50 ML 튜브에 별도로 장기 각각의 나머지 부분을 물에 담가서 부드럽게.
- 다음 순차적으로 BHI - 혈액 한천 플레이트 (2) 장기 homogenates (1:100, 1:1000 1:5000과) 및 각 희석의 접시 100μL를 희석.
- 제조의 지침 (로체, 독일)에 따라 homogenates에 테아제 억제제의 위패를 추가합니다.
- ° C 십사일 및 열거 CFUs에 최대 37 번호판을 품어.
- 10 분 4000xg에서 장기 homogenates을 원심 분리기 및 장기 supernatants 제거 위시는 제조 업체에 따라 표준 방법으로 수행 시토킨 assays에 사용에 사용됩니다.
8. H. 반대 단클론 항체 보호 Capsulatum는 항체 특이성 및 Isotype에 따라 달라집니다
- MAb isotype은 H.에 대한 보호에 매우 중요합니다 capsulatum은 Hsp60에 IgG1 또는 IgG2a mAbs 취급 생쥐로 Hsp60에 IgG2b mAb를받는 생쥐 또는 어느 컨트롤 isotype mAb 또는 PBS (그림 4) 제어에 비해 상당히 장기간 생존 있습니다.
- 또한, 보호 mAbs를받은 생쥐에 일 7 폐동맥과 지라 CFU의 수를 크게 감소가되었으며 일 14 (그림 5)에서 폐 효모 숫자 2와 2.5 로그 단위의 감소.
그림 1 : H.의 성장 capsulatum 및 hybridomas. H.에서 얻은 하나의 식민지에서 (A) 액체 햄 F - 12 문화 준비 capsulatum는 BHI - 혈액 한천 플레이트에서 성장. 세포 배양 및 단백질 flasks A / G 수지를 사용 친화 cromatography에 의해 mAb 정화의 (B) 하이 브리 도마 성장.
그림 2 : H. 비강 감염 capsulatum의 inoculum 준비. H. 후 얻은 세포 현탁액 주사기와 원심 분리에 의해 capsulatum 합산 장애는 hemocytometer에서 계수에 의해 열거됩니다. 세포 농도가 1.25 조정됩니다 × 10 7 (생존 실험) 또는 5 <50 μL에서 X 10 6 (CFUs, 크린 시토킨 및 조직학).
upload/2532/2532fig3.jpg "고도 ="그림 3 "/>
그림 3 : mAb 관리하는 동안 마우스 처리. (A) 마우스는 꼬리가 데리러와 (B 및 C) theears에 가까운로서 목의 아저씨를 개최하여 움직일 수 있습니다. (D) 꼬리는 작은 손가락과 손바닥 사이에 개최됩니다. (E) mAb 솔루션 26G1 / 2 바늘을 사용하여 주입합니다. (F) H. capsulatum inoculum는 부드럽게 nare에 세포 현탁액을 pipetting하여 intranasally 관리합니다.
그림 4 : Hsp60을 MAbs가 히스토플라스마증의 pathogenesis을 변경할 수 있습니다. 500 IgG1의 μg, 또는 이전에 감염이 크게 연장 생존 (컨트롤에 비해 P는 <0.05)에 IgG2a mAbs 2 H 있지만, IgG2b mAb와 IP 주사.
그림 5 : 마우스 5x10 6 HC의 효모를 선택 Hsp60에 mAbs 또는없는 mAb 동물을 치료 mAbs IgG1과 IgG2a에 대한 곰팡이 부담의 감소를 보여주 취급 IP와 sublethal 비강 도전 후 CFU 7에서 폐에 결정 14 일. 블랙 바 일 7시 CFUs과 흰색 막대를 나타냅니다 십사일 후 감염 (* P 칠일에 <0.001, 14 일 게시물 감염에 ** P <0.001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에 제시 프로토콜 mAb는 H.하는 걸 보여줍니다 capsulatum는 실험 murine 히스토플라스마증의 과정을 수정할 수 있습니다. 병원균의 세포 표면 항원에 MAbs는 호스트와 병원체 사이 상호 작용하는 동안 발생하는 복잡한 역학을 수정할 수 있습니다. 이 연구 intraperitoneally을 주입했을 때 mAbs는 치명적인 히스토플라스마증의 murine 모델의 보호를 중재 것을 수립하고는 H2B, M의 항원 (카탈 라 아제 표면) (3)와 Hsp60와 같은 백신 개발을위한 후보 단백질을 제안합니다. 생체내에서, HC Hsp60 및 H2B에 보호 mAbs의 행정 기관 곰팡이 부담과 염증과 감염된 생쥐의 장기 생존을 감소.
하지만 H.에 대한 백신 개발 그들은 반드시 면역 반응을 조정 수 없기 때문에 capsulatum 연구의 흥미로운 지역이며, 예방 접종, immunocompromised 개인 효과적으로되지 않을 수 있습니다. 따라서, 이것이 인구 H.에 mAb와 수동 치료에서 주로 혜택을 수도 분명하다 capsulatum 항원. 우리의 데이터는 특히 Hsp60하거나 다른 mAbs와 함께 세포 표면 항원에 mAbs는, 히스토플라스마증 (4, 6) 환자의 치료를 향상시킬 수하는 것이 좋습니다. H.에 mAb의 또한 조합 antifungal 약물 치료와 함께 capsulatum는 시너지 및 보호 효능에 더 효과적일 수 있습니다. Amphotericin B는 선택의 약물이며, 일반적으로 히스토플라스마증의 초기 치료에 사용됩니다. 따라서, antifungal 약물 치료 mAb의 추가는 향후 연구에 고려되어야합니다. 사실, 우리는 이전에 H2B 및 동물 모델 (5)에서 amphotericin B의 하위 억제 농도에 mAbs의 시너지 효과를 증명하고있다. 또한, mAbs는 특히 인간 면역 결핍 바이러스 감염이나 TNF - α 억제제를받는 환자 개인으로서 위험이 높은 개인에, 히스토플라스마증의 발생에 prophylactically 관리 할 수 있습니다. 보호 mAb 미래의 조사는 H. 대한 히스토플라스마증 및 항체 기능의 pathogenesis에 추가 중요한 통찰력을 보여줄 수 있습니다 아마도 capsulatum 그리고 다른 세포내 병원균.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet (BSL2) | |||
| 15 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| HAM F-12 medium | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 37°C shaker | |||
| Vortex | |||
| 50 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| 26G1/2 needle | BD Biosciences | ||
| 10 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 250 mL flasks | |||
| FPLC (Fast protein liquid chromatography) system | GE Healthcare | ||
| ELISA reader | BioTek | ||
| Anesthesia (ketamine and Xylazine) | |||
| Column stands | |||
| Nylon string | |||
| Heat lamp | |||
| 70μm cell strainers | Falcon BD | ||
| BHI agar plates | GIBCO, by Life Technologies |
References
- Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide. J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).
- Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77. , 1357-1367 (2009).
- Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum. PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).
- Nosanchuk, J. D. Protective antibodies and endemic dimorphic fungi. Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).
- Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. eepe, &, G. S., Casadevall, A. Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum. J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).
- Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S. Jr, ,, Casadevall, A. Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum. J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).
- Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab Anim. 27, 30-39 (1993).
