Summary
C57BL / 6 мышей были использованы для изучения патогенеза Нс и обеспечивают лучшую модель. Мы изучаем потенциальных выгод от гуморального иммунитета против этого грибка и порожденных нескольких моноклональных антител [к гистонов H2B и тепла 60kDa шока], что мы тестировали их защитной эффективности после внутрибрюшинного введения.
Abstract
Цель использования данной методики является 1) для продвижения нашего потенциала для защиты лиц с антителами или вакцина для профилактики или лечения гистоплазмоз вызванные грибом Histoplasma capsulatum и 2) рассмотреть вопрос о роли факторов вирулентности, как мишени для терапии. Для создания моноклональных антител, мышей сделаны прививки, иммунные реакции оценивались с помощью твердофазного ИФА система, разработанная в нашей лаборатории, и лучший ответчик мышей, выбранных для изоляции спленоцитов для слияния с гибридомных клеток. C57BL / 6 мышей были широко использованы для изучения H. capsulatum патогенеза и обеспечить лучшую модель для получения данных, необходимых. Для того чтобы оценить роль моноклональных антител к инфекции, мышей внутрибрюшинно вводили либо МКА к H. capsulatum или изотипа контрольной МКА, а затем зараженные или внутривенно (IV), внутрибрюшинно (IP), или интраназально (в) маршруты. В научной литературе, эффективность моноклональных антител для грибковых инфекций у мышей зависит от смертности, как конечная точка, в сочетании с колонией Лазэр единиц (КОЕ) оценки на более ранних моментов времени. Выживание (время до смерти) исследования необходимы, поскольку они лучше всего представляют болезни человека. Таким образом, эффективность нашего вмешательства не будет адекватно быть установлено без кривых выживаемости. Это также верно для установления эффективности вакцины или тестирования мутантов для вирулентности. С гистоплазмоз, мышей часто идут от того, энергичными с мертвыми в течение нескольких часов. Мощностью вмешательства, например, администрация МКА может сначала защитить животное от болезни, но болезнь может рецидив, который не был бы реализован в короткие экспериментов КОЕ. В дополнение к выживанию и грибковых анализов бремя, мы исследуем воспалительный ответ на инфекцию (гистология, сотовые найма, цитокинов ответов). Для выживания / время, чтобы смерть экспериментов мышей инфицированных и мониторинг по крайней мере два раза в день за признаками заболеваемости. Для оценки грибковых бремени, гистопатология, и цитокинового ответа, мышей эвтаназии в разное время после заражения. Эксперименты на животных проводятся в соответствии с руководящими принципами, Института защиты животных Исследования Альберт Эйнштейн медицинский колледж.
Protocol
1. Рост H. Capsulatum
- Подготовка кабинета биологической безопасности для работы с грибом путем очистки шкафа с 10% гипохлоритом затем 20 облучении УФ мин. H. capsulatum в дрожжевой фазе требует уровня биобезопасности (BSL) II практики, в то время как плесень форма требует BSLIII. Использование дрожжей форме в следующих шагах.
- Следующая подготовить 15 мл коническую пробирку с 5 мл PBS. Урожай колония H. capsulatum (штамм АТСС G217B Нс) из агар BHI крови пластины [глюкозы 10 г / л, цистеин 0,1 г / л, пенициллин стрептомицин 1% и эритроцитов барана 50 мл / л (Колорадо сыворотки Ко, штат Колорадо, США) ] культивировали при 37 ° C или взять аликвоту из замороженных фондовом дрожжи при температуре -80 ° С и добавить его в PBS. Vortex клетки активно и центрифуги на 1100 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре. Осторожно удалите супернатант, не нарушая гранулы и добавить 10 мл свежего PBS. Повторите эту процедуру три раза. Приостановить клеток в 5 мл PBS и трансфер в 50 мл коническую трубку.
- Чтобы сорвать агрегированной клетки, проходят подвески дрожжевых клеток через 26 G1 / 2 иглы у петь 10 мл шприца 5 раз в кабинет биобезопасности (с использованием лицевой защиты). Для выделения небольших, равномерно размера дрожжи, центрифуги клетки при 55 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре, а затем снимите верхнюю 1 мл.
- Добавить клеточной суспензии в стерильной колбе Эрленмейера, содержащую 100 мл среды HAM F12 (GIBCO) с добавлением 16 г / л глюкозы, 1 г / л, глутаминовая кислота, 8.4mg / L цистин, 6 г / л глутаминовой кислоты, а затем выращивать клетки при 37 ° С в течение 48 ч в инкубаторе с 150rpm встряхивания.
2. Гибридома роста и очистки моноклональных антител
- Передача выбранного гибридом в DMEM среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10% NCTC, 1% без незаменимых аминокислот и 1% пенициллина-стрептомицина. Рост клеток в колбе культуры клеток (Becton Дикенсон) в течение 5-7 дней при температуре 37 ° C / 5% СО 2.
- Затем центрифугу среды при 1100 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре и собрать все супернатант, не нарушая гранул.
- Затем очистить бесклеточных супернатант использованием белка / G смолы FPLC.
- Концентрация МКА может быть рассчитана на захват ИФА (1) с контролем IgG изотипа в стандартной комплектации (рис. 1В).
3. Histoplasma посевной Capsulatum подготовка
- Возьмите 48 ч Histoplasma capsulatum (штамм АТСС G217B Нс) дрожжевой фазы культуры, выращенные в HAM F-12 среды.
- Центрифуга клетки при 1100 мкг в течение 10 мин. Удалите супернатант и добавить свежие PBS.
- Повторите процедуру 3,2 3 раза.
- Pass подвески дрожжевых клеток в 5 раз через 26G1 / 2 иглы с помощью шприца.
- Центрифуга подвески на 55 мкг в течение 1 мин для осаждения остаточного кластеров клеток. Передача супернатант, содержащий суспензии отдельных клеток в новую пробирку.
- Перечислять суспензии отдельных клеток с использованием гемоцитометр.
- Отрегулируйте концентрации клеток с целью достижения 1,25 х 10 7 дрожжей (выживания) или 5,0 х 10 6 (CFU, цитокины и гистологии) в приостановление <50 мкл (рис. 2).
4. Внутрибрюшинного введения МАТ
- Возьмите мышь за хвост и загривок (рис. 3А). Остановите мыши за шиворот шею как можно ближе к theears насколько это возможно (не забудьте взять вверх достаточно кожу так, что мышь cannotturn голову, чтобы укусить человека обращения с ним; Рис 3В и 3С).
- Стабилизировать хвост withthe мизинцем осторожно прижимают ладони (рис. 3D).
- Тампон укола 70% этанолом до размещения иглы для аспирации и искать крови перед инъекцией.
- Используйте 26G1 / 2 до piercethe кожи и abdominalmuscles придать решение мАт содержащие 500μg (PBS, изотип контроль антител или МКА должны быть протестированы, разведенного в 1 мл PBS) на левые thelower или правом нижнем квадранте брюшной (внутрибрюшинном полости), с животное в голову позицию, следя за тем, чтобы избежать диафрагмы andother внутренних органов (рис. 3Е).
- Подождите, незадолго до снятия needleto снизить вероятность утечки.
- Подождите не менее двух часов, прежде чем перейти к следующему шагу.
5. Анестезия мыши и Интраназально Инфекции
- Подготовка анестезии с использованием кетамина и ксилазина в дозе 100 мг / кг и 10 мг / кг, соответственно. Выполните внутрибрюшинного введения PBS, изотип контроль антител, антител или экспериментальные, как описано в прилагаемых письменных протоколов. Подождите, через два часа после инъекции обезболивающего мАт до мыши и приступить интраназального заражения.
Подготовка анестезии с использованием кетамина и ксилазина в дозе 100 мг / кг и 10 мг / кг соответственно (7). - Во время 2 часа ожидания, подготовки посевного Histoplasma capsulum, как описано в прилагаемых письменных протоколов.
- Действовать в соответствии с itens 5,1 до 5,5. Toe щепотку животных с пинцета и проверить отсутствие рефлексов и подтвердить, что анестезия работал. После обезболивания, мягко приостановить мыши по его передние зубы, чтобы нейлона или хлопка строки. Используйте 2 колонки стоит связывать строки для того, чтобы приостановить животных.
- Медленно управлять примерно 50 мкл посевного в наре использовании микропипетки время внимательно следит за частоты дыхания мыши. Разрешить мыши на отдых в этом положении в течение 2-5 мин после интраназального инфекции для облегчения осаждения дрожжей в легкие животного (рис. 3F).
- После мыши был заражен, поддерживать мышь в мониторинг, теплое помещение (температура от 25 до 37 ° С), тщательно использованием тепла лампы при необходимости, пока он не оправится от анестезии. Когда мышь просыпается, вернуть его в чистую клетку с вволю доступ к пище и воде. Клетки возвращаются в наше животное объекта и хранится в чистом помещении животного (BlsI).
6. Выживание исследований
- Оценка инфицированных и макет инфицированных животных клинически тахипноэ, вялость, obtundation, и потеря веса. Животные должны быть проверены два раза в день лабораторными членов и ежедневно по уходу за животными.
- С мышиной гистоплазмоз, почти до конца жизни, Есть правило, без очевидных признаков инфекции, кроме умеренное увеличение частоты дыхания. С прогрессирующим заболеванием, которое обычно бывает от 10-11 дней, мышей стали значительно tachypneic и уменьшилась активность. Как правило, они быстро становятся умирающей и истекает.
- Проблемные животные должны быть умерщвлены соответственно с CO 2 в специальной камере, умерших животных должны быть перечислены в день.
7. КОЕ исследований, гистологии и цитокины исследований
- Подготовка 15 мл конические пробирки с 10 мл PBS для каждого органа должны быть собраны.
- Эвтаназии животных 7 и 14 дней после заражения сублетальных inuculum (5,0 х 10 6), как было показано ранее и снять легкое, селезенка и печень немедленно.
- Удалите часть органа должно быть оценено и выполнять фиксацию в формалине в одночасье. Разделах будут рассмотрены под микроскопом для патологических оценки.
- Подготовка 50 мл конические пробирки с 5 мл PBS, увенчанный 70 мкм фильтры ячейки для каждого органа для гомогенизации. Размочите каждой оставшейся части органов отдельно в 50 мл пробирки стерильные шприцы плунжеров 5 мл.
- Далее, серийно разбавленного орган гомогенатах (1:100, 1:1000 и 1:5000) и пластины 100 мкл каждого разведения на BHI-кровяной агар пластин (2).
- Добавить таблетки ингибитор протеазы в гомогенатах в соответствии с инструкцией завода-изготовителя (Roche, Германия).
- Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение 14 дней, и перечислить CFUs.
- Центрифуга орган гомогенатах на 4000xg в течение 10 минут и удалить орган супернатантах, свистеть будут использоваться в используемых в цитокинов анализы выполняются с помощью стандартных методов в зависимости от производителя.
8. Моноклональные антитела против защиты H. Capsulatum зависит от специфичности антитела и Изотип
- MAb изотипа имеет решающее значение для защиты от H. capsulatum, как мышей, получавших IgG1 IgG2a или моноклональных антител к Hsp60 значительно увеличивает выживаемость по сравнению с контролем мышей, получавших IgG2b МКА к Hsp60 или любой изотип управления МКА или PBS (рис. 4).
- Кроме того, у мышей, получавших защитные моноклональных антител, наблюдалось значительное уменьшение числа легких и селезенки КОЕ на 7 день и уменьшается в 2 и 2,5 журнале единиц дрожжей номера в легких на 14 день (рис. 5).
Рисунок 1: Рост H. capsulatum и гибридом. () Жидкие HAM F-12 культура препарат из одной колонии получил от H. capsulatum выросли на BHI-кровяные пластинки агара. (B) Гибридома роста в клеточной культуре колб и МАБ очистки белка / г смолы методом афинной cromatography.
Рисунок 2: H. capsulatum посевной подготовки для интраназального заражения. Клеточной суспензии, полученной после H. capsulatum нарушение агрегатов с помощью шприца и центрифугирования перечисляется путем подсчета в гемоцитометре. Сотовые концентрация регулируется до 1,25 х 10 7 (выживание экспериментов) или 5 х 10 6 (CFUs, цитокины и гистологии) в <50 мкл.
upload/2532/2532fig3.jpg "ALT =" Рисунок 3 "/>
Рисунок 3: обработка событий мыши во время МКА администрации. () Мышь поднял за хвост и (В и С) иммобилизованных путем проведения загривок его шею как можно ближе к theears. (D) Хвост, который состоялся между мизинцем и ладонью. (Е) решение мАт вводится использованием 26G1 / 2 иглы. (F) H. capsulatum посевной интраназально, осторожно пипеткой клеточной суспензии в наре.
Рисунок 4: МКА к Hsp60 может изменить патогенезе гистоплазмоз. ф инъекций по 500 мкг IgG1, IgG2a или МАТ 2 ч до инфекция значительно увеличивает выживаемость (р <0,05 по сравнению с контрольной группой), но IgG2b МАБ.
Рисунок 5: КОЕ определений в легких на 7 и 14 дней после сублетальных интраназального проблема с 5x10 6 дрожжей Нс мышей ф с выбранными моноклональных антител к Hsp60 или не имеют отношения мАт продемонстрировало снижение бремени для грибковых IgG1 и IgG2a моноклональных антител у подопытных животных. Черные полосы представляют CFUs на 7 день и белых полос 14 дней после заражения (* р <0,001 в течение 7 дней и ** р <0,001 на 14 дней после инфекции).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, представленные здесь, показывает, что МКА к H. capsulatum может изменить ход экспериментальной мышиной гистоплазмоз. МАТ к поверхности клеток антигенов возбудителей может изменить сложную динамику, которые происходят во взаимодействии между хозяином и патогеном. Это исследование устанавливает, что моноклональные антитела посредником защиты в мышиной модели смертельной гистоплазмоз при введении внутрибрюшинно, и это предполагает, кандидат белков для разработки вакцины, такие как H2B, М антиген (поверхностный каталазы) (3) и Hsp60. В естественных условиях, введение защитных моноклональных антител к Нс Hsp60 и H2B снижается орган грибковых бремени и воспаление и увеличивает выживаемость зараженных мышей.
Хотя разработки вакцины для H. capsulatum это захватывающая область исследования, вакцинация не может быть эффективным у иммунокомпрометированных лиц, так как они не всегда могут организовать immunoresponse. Таким образом, ясно, что это население может принести пользу в основном из пассивной терапии с МКА к H. capsulatum антигенов. Наши данные позволяют предположить, что моноклональные антитела, особенно для Hsp60 или в комбинации с другими моноклональных антител к антигенам на поверхности клеток, может улучшить лечение больных с гистоплазмоз (4, 6). Кроме того, сочетание МКА к H. capsulatum с противогрибковой терапии препарат может быть синергетический эффект и более эффективным в защитной эффективности. Амфотерицин В является препаратом выбора и обычно используется для начального лечения гистоплазмоз. Следовательно, добавление МКА к противогрибковым лекарственной терапии следует учитывать в будущих исследованиях. На самом деле, мы уже показали синергетический эффект моноклональные антитела к H2B и суб-ингибирующие концентрации амфотерицина В в нашей животной модели (5). Кроме того, моноклональные антитела могут быть введены с профилактической целью в вспышками гистоплазмоз, особенно высокого риска, таких как люди с иммунодефицита человека вирусной инфекции или больных, получающих ФНО-α ингибиторов. Будущие исследования защитных МКА может выявить дополнительные важные сведения о патогенезе гистоплазмоз и антитела против H. функции capsulatum и, возможно, других внутриклеточных патогенов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet (BSL2) | |||
| 15 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| HAM F-12 medium | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 37°C shaker | |||
| Vortex | |||
| 50 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| 26G1/2 needle | BD Biosciences | ||
| 10 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 250 mL flasks | |||
| FPLC (Fast protein liquid chromatography) system | GE Healthcare | ||
| ELISA reader | BioTek | ||
| Anesthesia (ketamine and Xylazine) | |||
| Column stands | |||
| Nylon string | |||
| Heat lamp | |||
| 70μm cell strainers | Falcon BD | ||
| BHI agar plates | GIBCO, by Life Technologies |
References
- Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide. J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).
- Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77. , 1357-1367 (2009).
- Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum. PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).
- Nosanchuk, J. D. Protective antibodies and endemic dimorphic fungi. Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).
- Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. eepe, &, G. S., Casadevall, A. Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum. J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).
- Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S. Jr, ,, Casadevall, A. Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum. J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).
- Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab Anim. 27, 30-39 (1993).
