Summary
C57BL / 6 farelerinde Hc patogenezinde çalışma ve en iyi model sağlamak için kullanılmaktadır. Biz bu mantara karşı sıvısal bağışıklığın potansiyel yararları keşfetmek ve histon H2B ve ısı şoku proteini 60kDa] üretilen çeşitli mAbs intraperitoneal uygulamadan sonra koruyucu etkinlik için test ettiğim.
Abstract
Bu metodoloji kullanım amacı bireyleri korumak için mantar Histoplasma capsulatum ve 2) tedavi için hedef olarak virülans faktörleri rol incelemek için neden histoplazmozis önlemek veya tedavi etmek için antikor ya da aşı ile kapasitesini ilerletmek için 1). MAb oluşturmak için, fareler aşı, bağışıklık yanıtlarını laboratuvarda geliştirilen bir katı faz ELISA sistemi kullanılarak değerlendirilir ve en iyi cevaplayıcı fareler hibridoma hücreleri ile füzyon için splenositlerin izolasyonu için seçilir. C57BL / 6 farelerin yoğun H. incelemek için kullanılan capsulatum patogenezi ve gerekli verileri elde etmek için en iyi modeli sağlamak. Enfeksiyon mAbs rolünü değerlendirmek amacıyla, fareler H. mAb ya intraperitoneal yolla capsulatum veya izotip ya intravenöz (iv), intraperitoneal (ip), ya da burun içi (in) yolları kontrolü mAb eşlemeli ve daha sonra enfekte . Bilimsel literatürde, farelerde mantar enfeksiyonları için mAbs etkinliği önceki zaman noktalarında koloni formin birim (CFU) değerlendirmeler ile birlikte, bir uç nokta olarak mortalite üzerine dayanır. En iyi insan hastalığı temsil Survival (ölüm) çalışmaları gereklidir. Böylece, bizim müdahale etkinliği yeterince sağkalım eğrileri olmadan kurulacak olmaz. Bu aşının etkinliği veya virülans için mutantlar test kurulması için de geçerlidir. Histoplazmozis, fareler genellikle birkaç saat içinde ölü enerjik olmak gidin. MAb idaresi gibi bir müdahale kapasitesi başlangıçta bir hayvan hastalığı korumak olabilir, ancak hastalığın nüks kısa CFU deneyler gerçekleştirilecek olmaz hangi. Hayatta kalma ve fungal yük testleri yanı sıra, enfeksiyon (histoloji, hücresel işe alım, sitokin yanıtları) inflamatuar yanıtları inceleyin. Farelerin hayatta kalma / ölüm deneylere zaman için, morbidite belirtileri için günde en az iki kez enfekte olan ve takip edilmektedir. Fungal yükü, histopatoloji ve sitokin yanıtları değerlendirmek için, farelerin enfeksiyondan sonra çeşitli zamanlarda ötenazi. Hayvan deneyleri Albert Einstein College of Medicine Hayvan Araştırmaları Enstitüsü'nün kurallarına göre yapılır.
Protocol
1. H. Büyüme Capsulatum
- 20 dakika UV ışını ile% 10 çamaşır suyu ile temizlik kabine mantar ile çalışmak için bir biyogüvenlik kabini hazırlayın. H. maya aşamasında kalıp formu BSLIII gerektirir capsulatum, Biyogüvenlik düzeyi (BSL) II uygulamaları gerektirir. Maya formu aşağıdaki adımları kullanın.
- Sonraki 5 ml PBS ile 15 ml konik tüp hazırlamak. Hasat bir koloni H. capsulatum BHI kan agar plaka [şekeri 10 g / L sistein 0,1 g / L, penisilin-streptomisin,% 1 ve koyun kırmızı kan hücreleri 50 ml / L (Colorado Serum Co, Colorado, ABD) (suşu Hc ATCC G217B ) 37 ° C'de ekili veya -80 ° C'de dondurulmuş maya stoku bir kısım almak ve PBS ekleyin. Vorteks şiddetle hücreleri ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1100 xg santrifüj. Pellet bozmadan süpernatantı dikkatlice çıkarın ve taze PBS 10 ml ekleyin. Bu işlemi üç kez tekrarlayın. PBS ve tranfer 50 ml konik tüp 5ml hücrelerin askıya alınması.
- Toplu hücreleri bozmak için, 10 ml şırınga bir Biyogüvenlik kabini (yüz koruması kullanarak) 5 kez şarkı yoluyla maya hücre süspansiyonu 26 G1 / 2 iğne u geçmektedir. Küçük, düzgün ölçekli maya izole etmek için, oda sıcaklığında 1 dakika süreyle 55 xg'de hücreler santrifüj ve sonra 1 ml kaldırmak.
- 16g / L glikoz, 1g / L glutamik asit 8.4mg / L, sistin 6g / L, glutamik asit ve daha sonra 37 ° hücrelerin büyümesi ile desteklenmiş HAM F12 orta 100 ml (Gibco) içeren bir steril erlen hücre süspansiyonu ° C de 48 saat ile bir kuluçka 150rpm sallayarak.
2. Monoklonal Antikorlar Hibridoma Büyüme ve Arıtma
- % 10 fetal buzağı serumu,% 10 NCTC,% 1 non-esansiyel amino asitler ve% 1 Penisilin-Streptomisin içeren DMEM orta seçilen hybridomas aktarın. 37 5-7 gün için bir hücre kültürü şişesi (Becton Dickenson) hücrelerin büyümesine ° C /% 5 CO 2.
- Daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika için 1100 xg'de santrifüj ve orta Peletlerin bozmadan tüm süpernatantı toplamak.
- Sonra, bir protein FPLC A / G reçine kullanılarak hücre süpernatant arındırmak.
- MAb konsantrasyonu sonra standart olarak IgG izotip kontrol (Şekil 1B) kullanarak bir yakalama ELISA (1) ile hesaplanabilir.
3 Histoplasma capsulatum İnokulum Hazırlık
- HAM F-12 orta yetişen 48 saat Histoplasma capsulatum (suşu Hc ATCC G217B) maya faz kültür atın.
- 10 dakika 1100 xg'de hücreleri santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve taze PBS ekleyin.
- 3.2 işlemi 3 kez tekrarlayın.
- Maya hücre süspansiyonu 5 kez bir şırınga kullanarak 26G1 / 2 iğne yoluyla iletin.
- Süspansiyon pelet kalan hücre kümeleri için 1 dakika için 55 xg'de santrifüjleyin. Yeni bir tüp tek hücre süspansiyonu içeren süpernatant aktarın.
- Hematocytometer kullanarak tek bir hücre süspansiyonu numaralandırılamıyor.
- 1.25 x 10 7 maya (hayatta kalma) veya 5.0 x 10 6 (CFU, sitokinler ve histoloji) suspention <50 mcL (Şekil 2) elde etmek için hücre konsantrasyonu ayarlayın.
4. Mablar intraperitoneal İdaresi
- Fare kuyruğu ve boynun ense (Şekil 3A) Pick up. Ense, boyun, mümkün olduğunca theears (Şekil 3B ve 3C fare işleme kişi ısırmaya başını cannotturn böylece yeterli cilt aldığınızdan emin olun) yakın olarak fare hareketsiz.
- (Şekil 3B) elin avuç içi hafifçe bastırılır kuyruk withthe küçük parmak sabitleyin.
- Swab, iğne ve enjekte önce kan aramak için aspire yerleştirmeden önce% 70 etanol ile enjeksiyon alanında.
- 26G1 / 2 kullanın, mAb çözüm 500μg (PBS, izotip kontrol antikor veya mAb 1 mL PBS içinde seyreltilmesi, test edilmesi) içeren thelower sol veya sağ alt karın kadranda (intraperitoneal kavite) içine enjekte etmek için cilt ve abdominalmuscles piercethe konum aşağı baş hayvan, iç organlar diyafram andother (Şekil 3E) özen.
- Needleto sızıntı olasılığını azaltmak çekilme öncesinde kısa bir süre bekleyin.
- Bir sonraki adıma geçmeden önce en az bir iki saat bekleyin.
5. Fare Anestezi ve intranazal Enfeksiyonlar
- 100 mg / Kg ve 10 mg / kg, sırasıyla anestezi ketamin ve ksilizin kullanarak hazırlayın. Intraperitoneal PBS yönetim, izotip kontrol antikoru, ya da eşlik eden yazılı bir protokol açıklandığı gibi deneysel antikor gerçekleştirin. MAb enjeksiyondan sonra fare anestezi ve intranazal enfeksiyon geçmeden önce iki saat bekleyin.
100 mg / Kg ve 10 mg / Kg, sırasıyla (7) anestezi ile ketamin ve ksilizin hazırlayın. - 2 saat bekleme süresi sırasında, eşlik eden yazılı bir protokol açıklandığı gibi Histoplasma capsulum inokulum hazırlamak.
- 5.5, itens 5.1 göre devam edin. Toe ve refleks yokluğu doğrulamak ve anestezi çalıştı onaylamak için bir cımbız ile hayvanların tutam Anestezi sonra, bir naylon veya pamuk dize hafifçe ön dişleri fare askıya. Hayvanlar askıya almak için dizeleri bağlamak için 2 sütun standları kullanın.
- Mikropipet kullanarak bir farenin solunum hızı yakından izlerken nve içine yavaşça yaklaşık 50 ul inokulum yönetmek. Fare hayvan akciğerlerine (Şekil 3F) maya birikimi kolaylaştırmak için intranazal enfeksiyondan sonra 2-5 dakika bu pozisyonda kalan izin verin.
- Fare enfekte edildikten sonra, gerekirse anestezi kurtarır kadar dikkatle izlenen, sıcak bir ortam (25 ve 37 ° C arasındaki sıcaklık), bir ısı lambası kullanarak, fare korumak. Fare uyanır, yiyecek ve su ad libitum erişim ile temiz bir kafes dönün. Kafeslerde hayvan tesis döndü ve temiz bir hayvan odası (BLSI) tutulur.
6. Survival Çalışmaları
- , Taşipne, letarji, obtundation, kilo kaybı için, klinik olarak enfekte ve enfekte sahte hayvanların değerlendirin. Hayvanlar laboratuar üyeleri ve Hayvan Bakıcılar tarafından günlük olarak günde iki kez kontrol edilmelidir.
- Fare histoplasmosis, ömrünün sonuna yakın kadar, solunum hızı hafif bir artış dışında enfeksiyon genellikle hiçbir belirgin belirtileri vardır. Ilerlemiş hastalık, genellikle 10-11 gün olur, farelerin, belirgin tachypneic hale gelir ve azalmış aktivite var . Tipik olarak hızla can çekişmekte ve sona erecek.
- Sıkıntılı hayvanlar, özel bir odasında CO 2 uygun ötenazi olmalı, Merhum hayvanların günlük numaralandırılan olmalıdır .
7. CFU Çalışmalar, Histoloji ve Sitokinler Çalışmaları
- 15 ml konik tüpler tahsil edilecek her organ için 10 ml PBS ile hazırlayın.
- Daha önce gösterildiği gibi bir subletal inuculum (5.0 x 10 6) ile 7 ve 14 gün sonra enfeksiyon hayvanlar Euthanize ve akciğer, dalak ve karaciğer hemen çıkarın.
- Değerlendirilmek üzere organın bir parçasını çıkarın ve formalin gecede fiksasyonu gerçekleştirmek. Bölümleri patolojik değerlendirme için mikroskop altında incelenecektir.
- 5ml PBS ile 50 ml konik tüpler hazırlayın homojenize edilecek her organ için 70 mikron hücre süzgeçler ile tepesinde. Steril 5 ml'lik şırınga pistonunu kullanarak 50 ml tüpler içine organların her biri ayrı ayrı kalan kısmını ıslatarak yumuşatmak.
- Sonraki seri BHI kan agar plakları (2) organ homojenatlarında (1:100, 1:1000 ve 1:5000) ve her seyreltme plaka 100μL sulandırmak.
- (Roche, Almanya) üreticinin talimatlarına göre homojenatlarında proteaz inhibitörü tabletleri ekleyin.
- , ° C - 14 gün ve numaralandırmak CFU kadar 37 ° plakaları inkübe edin.
- 10 dakika 4000xg organ homojenatlarında Santrifüj ve organı süpernatantlar kaldırmak, whish üreticiye göre standart yöntemlerle yapılan sitokin tayinlerde kullanılan kullanılır.
8. H. Karşı Monoklonal Antikor Koruma Capsulatum Antikor Özgünlük ve İzotip Bağımlı.
- MAb izotip H. karşı koruma kritik capsulatum, Hsp60 için IgG1 veya IgG2a mAb ile tedavi edilen farelerde IgG2b mAb Hsp60 için bir alan fareler veya izotip kontrol mAb veya PBS (Şekil 4) kontrole göre önemli ölçüde uzun süreli sağkalım var.
- Ayrıca, koruyucu mAbs alan farelerde, akciğer ve dalak CFU 7 gün sayısında anlamlı bir azalma vardı ve günde 14 (Şekil 5) akciğerlerde maya sayılar 2 ve 2,5 günlük birimlerinin azalır.
Şekil 1: H. Büyüme capsulatum ve hybridomas. H. elde edilen tek bir koloni (A) Sıvı HAM F-12 kültür hazırlama capsulatum bir BHI kanlı agar plakaları üzerinde büyüdü. (B), hücre kültürü şişeleri ve protein A / G reçine kullanılarak afinite kromatografisi mAb arıtma Hibridoma büyüme.
Şekil 2: H. intranazal enfeksiyon capsulatum inokulum hazırlanması. H. sonra elde edilen hücre süspansiyonu şırınga ve santrifüj capsulatum agrega bozulması bir hemasitometre sayarak numaralandırılmış. Hücre konsantrasyonu 1.25 ayarlanır x 10 7 (hayatta kalma deneyler) veya 5 x 10 <50 mcL 6 (CFU, sitokinler ve histoloji).
upload/2532/2532fig3.jpg "alt =" Şekil 3 "/>
Şekil 3: mAb yönetimi sırasında Fare taşıma. (A) fare kuyruğu tarafından aldı ve (B ve C) theears için yakın, boynun ense tutarak immobilize. (D) kuyruk küçük parmak ve avuç arasında yapılır. (E) mAb çözüm 26G1 / 2 iğne ile enjekte edilir. (F) H. capsulatum inokulum nve içine yavaşça hücre süspansiyonu pipetleme intranazal yönetilmektedir.
Şekil 4: Hsp60 için Mablar histoplazmozis patogenezinde değiştirebilir. IgG1 500 mg, ya da IgG2a mAbs 2 saat önce enfeksiyon önemli ölçüde uzun süreli sağkalım (kontrol grubu ile karşılaştırıldığında p <0.05), ancak bir IgG2b mAb ip enjeksiyonları.
Şekil 5: farelerin 5x10 6 Hc maya seçilen Hsp60 mAbs veya ilgisiz mAb hayvanların tedavi mAbs IgG1 ve IgG2a mantar yükünde azalma gösterdi tedavi ip ile subletal intranazal meydan sonra CFU 7 akciğerlerde tespitler ve 14 gün. Siyah çubuklar gün 7 CFU ve beyaz çubukları temsil eden 14 gün sonrası enfeksiyon (p <0.001 ve 7 gün 14 gün enfeksiyonu ** p <0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokol mAb H. olduğunu gösteriyor capsulatum deneysel fare histoplazmozis değiştirebilirsiniz. Patojenlerin hücre yüzey antijenleri Mablar bir ana ve bir patojen arasındaki etkileşimi sırasında meydana gelen karmaşık dinamiklerini değiştirebilir. Bu çalışmada, intraperitoneal olarak enjekte görünüz mAbs ölümcül histoplazmozis bir fare modeli koruma arabuluculuk kurar ve aşı geliştirilmesi için aday proteinler, H2B, M antijeni (katalaz yüzey) (3) ve Hsp60 olarak önerir. In vivo olarak, Hc Hsp60 ve H2B koruyucu mAbs yönetim organı fungal yükü ve inflamasyon ve enfekte olmuş fareler uzun süreli sağkalım azalttı.
Her ne kadar H. için aşı geliştirme onlar mutlaka bir immunoresponse orkestra olamaz beri capsulatum heyecan verici bir araştırma alanıdır, aşılama, immün sistemi baskılanmış kişilerde etkili olduğu olmayabilir. Bu nedenle, bu nüfus H. mAb pasif tedavi çoğunlukla yararlı olabilir capsulatum antijenleri. Bizim verilerimiz, özellikle Hsp60 veya diğer mAb ile birlikte hücre yüzey antijenleri mAb, histoplazmozis (4, 6) ile hastaların tedavisinde ıslah edebileceğini düşündürmektedir. H. mAb Ayrıca, kombinasyon antifungal ilaç tedavisi ile capsulatum sinerjik ve koruyucu etkinlik daha etkili olabilir. Amfoterisin B tercih edilen ilaç ve genellikle başlangıç tedavisi histoplazmozis için kullanılır. Bu nedenle, mAb antifungal ilaç tedavisi yanı sıra, gelecekteki çalışmalarda dikkate alınmalıdır. Aslında, biz daha önce H2B ve hayvan modeli (5), amfoterisin B alt inhibitör konsantrasyonları mAbs sinerjik bir etki göstermiştir. Ayrıca, mAbs özellikle yüksek risk taşıyan bireyler, insan immün yetmezlik virüsü enfeksiyonu veya TNF-α inhibitörleri alan hastalarda bireyler gibi, histoplazmozis salgınları profilaktik olarak uygulanmıştır olabilir. Gelecekteki araştırmalar koruyucu mAb H. karşı histoplazmozis ve antikor fonksiyonu patogenezinde içine ek önemli bilgiler ortaya belki capsulatum ve diğer hücre içi patojenlerin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet (BSL2) | |||
| 15 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| HAM F-12 medium | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 37°C shaker | |||
| Vortex | |||
| 50 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| 26G1/2 needle | BD Biosciences | ||
| 10 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 250 mL flasks | |||
| FPLC (Fast protein liquid chromatography) system | GE Healthcare | ||
| ELISA reader | BioTek | ||
| Anesthesia (ketamine and Xylazine) | |||
| Column stands | |||
| Nylon string | |||
| Heat lamp | |||
| 70μm cell strainers | Falcon BD | ||
| BHI agar plates | GIBCO, by Life Technologies |
References
- Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide. J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).
- Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77. , 1357-1367 (2009).
- Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum. PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).
- Nosanchuk, J. D. Protective antibodies and endemic dimorphic fungi. Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).
- Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. eepe, &, G. S., Casadevall, A. Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum. J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).
- Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S. Jr, ,, Casadevall, A. Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum. J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).
- Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab Anim. 27, 30-39 (1993).
