Summary
Yetişkin hayvanlarda yenidoğan dentat granül hücrelerin entegrasyonu çalışma bir şekilde açıklanmıştır. Bu teknik, yeni doğan nöronlar, in vivo işlevsel entegrasyonu belirlemek için elektrofizyolojik kayıtlar takip etiketlemek için tasarlanmış bir retrovirüs kullanır.
Abstract
Nöron lateral ventrikülün alt-ventriküler zon (SVZ) ve hayatı boyunca hipokampal dentat girus alt granüler bölgesi (SGZ) yetişkin memelilerin beyinlerinde oluşur. Önceki raporlar, epilepsi, şizofreni, depresyon ve anksiyete (1) de dahil olmak üzere çeşitli beyin bozuklukları, yetişkin hipokampal nöron ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Normal ve anormal yetişkin doğumlu nöron entegrasyon süreci Deşifre bu hastalıkların etyolojisi ışık tutacak ve yeni tedavilerin geliştirilmesi bilgilendirebilir.
SGZ yetişkin nöron kaderi şartname, göç, sinaptik bütünleşme ve olgunlaşma aşamaları da dahil olmak üzere, embriyonik ve post-natal nöronal gelişim aynalar. Ancak, tam entegrasyon, 6 haftalık uzun bir süre içinde oluşur. İlk sinaptik giriş yetişkin doğumlu SGZ dentat granül hücreleri (KEGM), 14 gün (2) glutamaterjik girişi takiben, GABAerjik . Dentat girus yetişkin doğumlu nöronların devre oluşumunu düzenleyen özgü faktörler henüz bilinmemektedir.
Laboratuvarımız bu hızla çoğalan hücreleri floresan proteinleri ve hipotez düzenleyici genler teslim Moloney fare lösemi virüsü dayalı bir çoğaltma eksikliği retroviral vektör kullanır. Bu viral teknik hücre doğum tarihini, soy, morfoloji ve sinaptogenez analizi için yüksek özgüllük ve çözünürlük sağlar.
Tipik bir deney, genellikle benzersiz bir etiket, transgen, ve in vivo olarak istenen bir gelişim sürecinin tek hücreli analiz için organizatörü unsurları içeren iki ya da üç virüsler kullanmaktadır. Aşağıdaki protokol fonksiyonel yeni doğan nöron entegrasyonu tek bir yeşil (GFP) veya kırmızı (dTomato) floresan proteini retrovirüs ve yama klemp elektrofizyoloji kullanarak analiz etmek için bir yöntem açıklanır.
Protocol
1. Virüs Enjeksiyon
Yüksek titrede mühendislik retrovirüs (1 × 10 9 birim / ml) co-retroviral vektörlerin transfeksiyon tarafından üretilen ve viral süpernatant Ultrasantrifügasyon tarafından takip HEK293T hücreleri içine VSVG. Kaynakları ve üretim yöntemleri, mükemmel vallahi gösteri (3) bkz.
Not: Genç yetişkin (4-6 hafta) kadın C57BL / 6 fareler (Charles Nehri) standart şartlar altında muhafaza edilir. Tüm işlemler, Ulusal Araştırma Konseyi, Stony Brook Üniversitesi IACUC tarafından onaylanmış bir protokol kapsamında laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı Kılavuzu izleyin.
- Buz üzerinde hayvan başına dondurulmuş retrovirüs çözülme 2ul.
- Anesteziyoloji (100 mg ketamin + gram vücut ağırlığı başına 10 mg ksilizin) ve hayvan stereotaksik bir çerçeve (Steolting) monte edilir. Kafasına saç çıkarın ve% 70 etanol ile cilt silin.
- Açığa kafatası ve diş aşağıdaki koordinatları bir matkap kullanarak (0.6mm matkap ucu) dört sığ delik:
- anterioposterior = -2 mm bregma; yanal = ± 1.6 mm; ventral = 2.5 mm; anterioposterior bregma = -3 mm; yanal = ± 2.6 mm; ventral = 3.2 mm.
- anterioposterior = -2 mm bregma; yanal = ± 1.6 mm; ventral = 2.5 mm; anterioposterior bregma = -3 mm; yanal = ± 2.6 mm; ventral = 3.2 mm.
- Mount 1μl Hamilton, düz ucu şırınga ve sitenin yüzde 0,5 'ul retrovirüs 0.25 ul / dak hızında dentat girus içine enjekte edilir. Yavaş yavaş sıvı akışı önlemek için şırınga çekilmeden önce her enjeksiyondan sonra (ventral derinliği için yukarıdaki koordinatları bakınız.) Pause 2 dakika. Enjeksiyonlar arasındaki kısaca steril PBS ile şırınga ucu ve kan izlerini kaldırmak için bir aplikatör dış yüzeyi durulayın.
- , Steril cerrahi sütür malzeme ile yara (P-1 Tipi Boyutu 6-0) kapatın ve enjeksiyondan sonra istenilen zaman aşamalarına kadar standart konut koşulları hayvan .
2. Dilim Hazırlık
Erişkin farelerde yüksek kaliteli akut dilimler elde etmek için, (aşağıya bakın) dilim hazırlanması için modifiye edilmiş bir kesim çözüm.
- 0-4 ° C,% 95 ile buz ve kabarcık O 2 -5% CO 2 için en az 30 dakika ön-chill kesim çözüm .
- Anesteziyoloji ve buz gibi oksijen doymuş kesim çözüm ile bir hayvan transcardially serpmek.
- Hızlı soğuk, oksijenli kesim çözüm filtre kağıdı ile önceden ıslatılmış bir petri yemek beyin kaldırmak. Beyincik kesiniz ve en az 1mm anterior montaj yüzeyine (görünür) enjeksiyonu koordinatları dilim. Tutkal beyin üzerine bir vibrotome aşamada soğuk ve oksijenli kesim çözümü ile dolu kesme odasına monte.
- Koronal veya yatay dilim (300-350μm) hazırlayın ve oda sıcaklığında ACSF içeren bir kuluçka odasına, büyük çaplı bir pipet yardımıyla transfer% 95 O 2 /% 5 CO 2 ile kabarmış.
- Dilimleri, sürekli köpürme, 30-60 dakika süreyle 32 ° C'de inkübe edin. Kayıt süresi boyunca oda sıcaklığında odasına dönün.
3. Elektrofizyolojik deneyler
- 34 ° C - 32 ° C'de sürekli oksijen doymuş ACSF ile perfüze kayıt odasına Dilimleri aktarılır
- Bipolar tungsten stimülasyon elektrot, düşük bir büyütme mikroskop objektif (10X) kullanarak dentat girus moleküler tabaka yerleştirilir.
- Alt-granüler bölge / granüler hücre katmanı Yenidoğan KEGM GFP veya dTomato ifade tarafından tespit edilir. Tüm hücre patchclamp kayıt altında yeni doğmuş nöronlar yüksek büyütme (40X) yapılır.
- Kaydedilen hücreleri Ateşleme özellikleri akım kelepçe modunda altında akımların bir dizi enjeksiyon yoluyla elde edilir.
- Elektrik uyaranlara kayıt yazılımı tarafından kontrol edilen bir stimülasyon izolatör üzerinden uyarılması elektrot tarafından teslim ve kaydedilir yenidoğan KEGM postsinaptik akımların uyarılmış.
4. Veri Analizi
Yetişkin doğumlu nöronların farklı gelişim evreleri, uyarılmış postsinaptik yanıtlar genlikleri analiz edilmektedir.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Yukarıdaki protokolünü kullanarak, Şekil 1 'e benzer yenidoğan dentat girus nöronlarda GFP ifade yaygındır. Yeni doğan nöronlar kolayca görüntülenebilmekte ve hem dendrit ve aksonlar sağlam etiketli olduğunu unutmayın. Kalite ve virüs titresi, kullanılan organizatörü ve in vivo ifade uzunluğu, ince DGC aksonlar ve küçük dikenler İfade bağlıdır. Bizim ellerde, yenidoğan hücreleri ve alt hücresel organelleri genellikle enjeksiyonu takiben bir kaç gün içinde görünür ve omurga ifade gelişiminin erken aşamalarında takip edilebilir. Wfarklı zaman aşamasında yeni doğmuş nöronlar delik hücre kayıtları benzersiz yeni doğan hücre özelliklerini, örneğin aksiyon potansiyelleri (Şekil 2a), sinaptik entegrasyon sürecinin yanı sıra olgunlaşma (Şekil 2b) sırasında mevcut nöral devrelerin çalışma izin verir.
Şekil 1 yetişkin bir farenin yatay bir dentat girus bölümünde yeni doğan nöronlar 2 foton konfokal görüntü. Yeşil hücrelerin 21dpi (gün enjeksiyon) GFP ifade pUX-GFP retrovirüs ile etiketli yeni doğan KEGM.
Şekil 2) Aksiyon potansiyeli, 21, yeni doğan bir DGC özellikleri ateş dpi b) temsilcisi, 21 dpi çözünürlükte yeni doğmuş bir DGC kaydedilmiş eksitatör postsinaptik akımlar (EPSCs ) uyandırdı.
Discussion
Yetişkin memelilerin beyinlerinin hippocampus bölgesinde Sürekli nöron olgun beyindeki nöronal gelişim ve entegrasyon çalışmak için benzersiz bir deneysel model sistemi sağlar. Burada sunulan protokol retroviral etiketleme ve elektrofizyolojik yöntemler, yetişkin farelerin beyinlerinde yenidoğan dentat granül nöronların entegrasyonu çalışma birleştirir.
Deneylerde başarılı olmasını sağlamak için, prosedürün kritik adımlar sırasında aşağıdaki öneriyor:
Istenmeyen enfeksiyon ve inflamasyon önlemek için ameliyat öncesi tüm araçlar (otoklav, sterilizatör herhangi bir tür veya% 70 etanol) sterilize edilmelidir. Enjeksiyondan önce şırınga iğne ucu steril PBS yıkamak için kullanın.
Virüs enjeksiyon için, hayvanların iyi stereotaksik cihaz monte edilmesi gerekir ve enjeksiyon sırasında gereksiz hareketinin kaynakları minimize edilmelidir. Kafası iyi sabit ve sağlam olduğundan emin olun ve seviyesi bregma ve lambda hesaplanırken enjeksiyon koordinatları önce burun farenin konumunu ayarlamak. Oda sıcaklığında maruz kalma en aza indirmek için virüs hızla şırıngaya Extract - retrovirüsler özellikle ısıya duyarlı. Basınç hasarı en aza indirmek için tavsiye edilen oranda yavaş virüs enjekte edilir. Önerilen düz uçlu bir enjektör (vs ortak Eğimli ucu) eşit olarak dağıtılmış bir dentat girus enfeksiyon alan sağlayacaktır.
Hazırlamadan önce dilim, çözüm kesme ve ACSF kuluçka oksijen çözümleri doyurmak için izin vermek için en az 30 dakika süreyle% 95 O 2 -5% CO 2 ile kabarmış olmalıdır . Hayvanlar hızla perfüze ve doku soğuk, en iyi dilim kalitesi için oksijen doymuş çözüm sağlanmalıdır.
Postsinaptik bir yanıt gelene kadar kayıt için, yavaş yavaş uyaran yoğunluğunu artırır. Dentat girus moleküler katman içinde gerektiğinde uyarı elektrot yerini değiştirin.
Özet olarak, önerilen yaklaşım, aktif, olgun devresi içine erken evre entegrasyonu sırasında farklı özellikleri ve yetişkin doğumlu nöronların olası fonksiyonel rolleri keşfetmek için bir yol sunar.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NINDS ve S.Ge. Amerikan Kalp Derneği tarafından finanse edildi Bu yaklaşım başlangıçta Johns Hopkins Üniversitesi'nden Dr. Hongjun Song laboratuvarda yazar tarafından kurulmuş ve geliştirilmiştir. Dr Hongjun Song Biz onun rehberlik ve destek için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
|
References
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis. Cell. 132, 645-660 (2008).
- Ge, S., Goh, E. L., Sailor, K. A., Kitabatake, Y., Ming, G. L., Song, H. GABA regulates synaptic integration of newly generated neurons in the adult brain. Nature. 439, 589-593 (2006).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
