Summary
解剖一只老鼠眼的一个正式的示范，导致在整个视网膜色素上皮的坐骑。
Abstract
视网膜色素上皮（RPE）是哺乳动物的眼睛后面，刚下的视网膜神经元，其中包含的光感受器（杆和视锥细胞）。色素上皮是单层联营密切的正上方的神经视网膜色素立方细胞和。这种关联使视网膜色素上皮对视网膜疾病的研究极大兴趣。的RPE也是一个同源DNA修复， 联合国的 P检测体内检测站点。鼠标的眼睛是特别困难的解剖，由于其体积小（直径约3.5毫米）和球形形状。本文演示了详细的剥离导致眼睛在整个视网膜色素上皮安装程序。在此过程中，我们将展示如何工作对眼睛的球形结构，而不是的。简言之，结缔组织，肌肉，和视神经从眼球后部。然后，角膜和晶状体将被删除。下一步，战略裁员，在重大其余组织的扁平化的结果。最后，视网膜神经轻轻地升空，揭示了一个完整的视网膜色素上皮，这仍然是连接到底层脉络膜和巩膜。这整个挂载可用于执行联合国的 P检测或免疫组化或免疫视网膜色素上皮组织的评估。
Protocol
1。删除多余的组织，从外面的眼睛
- 一个35mm的培养皿的盖子，倒入1X PBS。水平应略低于盖子的唇。
- 直钳，转让眼（S）的存储管使用的35mm盘。眼睛被淹没在PBS的原因有两个：1。多余的组织将“漂浮”，从眼睛，这样你可以看到轻松删除它们，和2。在清扫，眼睛自然会保持球形，而处于悬浮状态，让您的工作而不是反对这种形状。
- 都对使用直角钳（45 °和15 °），轻轻取出尽可能多的肌肉和结缔组织，拉动对粮食的组织（即向着角膜）。一些结缔组织将保持不变。应作出努力，以尽可能少的挤压眼球。
- 春天剪刀贸易15 °钳。按住眼睛的稳定与45 °钳，使用弹簧剪刀剪去余下的肌肉和结缔组织，以及视神经。 *提示：使用外边缘的剪刀，以推动对粮食组织（朝corneo巩膜鸿沟），然后修剪。继续，直到所有多余的组织已经从眼睛中删除。
2。取下的角膜和晶状体
- 角膜朝上，使用45 °钳，捏在角膜中心的小褶皱。
- 使用Spring的剪刀，让一个小切口，在皮瓣的基础。让我们去的皮瓣。
- 控股的眼睛仍然与您的镊子，剪刀刀片插入较低的和垂直的切口，并削减向corneo巩膜鸿沟。尽量使你的下刀片，所以下的虹膜角膜和虹膜切开。不要削减一路corneo巩膜鸿沟。保持剪刀插在眼睛上。
- 使用45 °钳，小心地转动眼睛，使你的剪刀平行corneo巩膜鸿沟，使一小截。慢慢转动眼球360 °，使小切口周围所有的方式。再次，尽量保持较低的弹簧剪刀刀片，使下虹膜虹膜和角膜切开。电梯的虹膜和角膜离眼睛休息和丢弃。
- 在其一侧倾斜的眼睛和对眼睛的后半部轻轻下压，迫使镜头。丢弃的镜头。剩下的眼罩内两旁是由神经视网膜，这看起来应该光滑，不透明。
3。季眼罩，造成4 - “petaled”，花状结构
- 眼睛应定位眼罩开幕是你的身体垂直。使用45 °钳稳定和位置眼罩。
- 在你面前的弹簧剪刀，所以他们是垂直你的身体中，将其插入顶边开放眼罩弹簧剪刀的刀片。使用45 °钳，小心地将眼罩，使一个单一的，直切可走向视神经头corneo巩膜鸿沟。所有伤口应垂直corneo巩膜的鸿沟，除非指定的，应该没有到它切割尽可能靠近视神经头的。
- 眼罩180 °旋转，与你的身体保持垂直。在步骤3.2中使用的技术，进行第二次垂直切割。
- 旋转眼罩和重复3.2的技术，使两个多削减。所有四个削减应尽可能接近90 °尽可能。请记住，映入眼帘的是不完美的球形，因此会有一些变异。
4。切成两半的四个“花瓣”，在八个花瓣状结构
- 将驻扎眼罩，从35毫米盘到一个干净的幻灯片。朝上的眼罩，舀下45 °钳。小心地将其取出液体放在一个干净的幻灯片。
- 使用直角钳都对，轻轻打开了眼，神经视网膜朝上。不删除神经视网膜它有助于眼睛保持球形，这样你就不会反对。它还在以下过程中被意外损坏保护视网膜色素上皮。
- 旋转滑动，直到花瓣之一是你的身体垂直。
- 使用15 °钳，轻轻抓住花瓣的角落。花瓣的角落应角膜，神经视网膜或视网膜色素上皮。角落里轻轻抬起，允许它保留其曲率。
- 插入底部的刀片之间的花瓣和幻灯片的春天剪刀。行了你的剪刀等，可以从一个单一的，直线，垂直切割corneo巩膜鸿沟走向视神经头。削减非常接近，尽可能的withou视神经头吨削减到它。让花瓣，允许它在幻灯片上的谎言。
- 旋转滑动90 °，使未来的花瓣是你的身体垂直。重复步骤4.5。
- 重复步骤4.5和4.6两次以上。由此产生的结构应该看起来像一个八瓣花。
5。取出视网膜神经
- 移液器100-200μL的1X PBS到标本。这将防止从坚持为你的视网膜色素上皮剥离的视网膜神经。
- 视网膜神经通常是松散连接的RPE。但是，它采取的做法和技能，以去除神经视网膜的RPE。轻轻抓住直角钳一对视网膜神经花瓣，同时稳定（按住），直角钳的另一对眼睛休息。将视网膜神经远离眼睛休息。继续此过程，直到整个神经视网膜已被删除。 *提示：坚持到视神经头15 °钳尖锚眼睛。然后用45 °钳扫下方视网膜神经和抬离和距离。它通常是最好的解除神经视网膜视神经头走向corneo巩膜鸿沟。可以肯定的，绝尘而去的虹膜任何松动的残余。虹膜是很粘，否则可以卡住的RPE。
- 用1X PBS冲洗标本。移液器100-200μL的1X PBS标本和吸备份。丢弃的PBS。必要时重复来清除灰尘和碎片。
6。你在幻灯片装入标本（S）
- 吸取80-90μL，90％的甘油长方形到一个新的幻灯片。使用枪头方矩形均匀，甘油涂抹。 （这是一张幻灯片上安装两个视网膜色素上皮的过程。）
- 插入的下臂下的标本15 °钳。轻轻抬离标本解剖幻灯片。
- 缓慢地降低到甘油的标本。轻轻摆动的钳为你拉他们从下标本。
- 重复步骤6.1-6.3其它标本。
- 旋转滑动，使长边垂直于你的身体。按住玻璃盖在一个45度角到幻灯片，这是动人的幻灯片。走向甘油涂抹，直到他们接触。玻璃盖和幻灯片之间保持联系，慢慢地移动远离涂抹的玻璃盖，走向边缘的幻灯片。最多的幻灯片的长边和玻璃盖，使他们是平行的。握住你的拇指和食指之间的玻璃盖的四角。
- 在另一只手拿起15 °钳。摇篮上（免费）边在玻璃盖的臂弯。很慢，低的玻璃盖。当接触之间的玻璃盖和甘油，甘油迁移停止并等待。重复此降低，并等待，直到RPE整个坐骑完全覆盖。这是为了防止从捕捉气泡的高粘度的甘油。不推盖玻片 - 甘油会挤压下，使得附着力很差。
- 有了明确的指甲油，油漆各地的外围玻璃盖和幻灯片的满足。
- 放置在一个空架干之上的幻灯片。
7。代表性的成果：
此过程的结果应该是一个结构，看起来像一朵花，应该是相当对称。
图1。整个安装的RPE从一个野生型C67Bl/6J鼠标 ，从黑色或刺豚鼠动物的视网膜色素上皮应该是深褐色，并应具有光滑的表面。花瓣的地形起伏是正常的通知。对任何给定的标本的色素沉着可能会有所变化，由于变密度的RPE和底层脉络膜的色素沉着。白色箭头指向色素减退的“渠道” - 这是正常的是，由于眼睛的基本血管。蓝色箭头指向物理损坏的视网膜色素上皮和基本脉络。
图2。整装稀鼠标的RPE。收获稀动物标本的范围可以从几乎透明的颜色的Cafe au Lait和任何一个标本是想在它的可变性，在这里的黑色圆圈表示。在一般情况下，从年幼的动物收获的视网膜色素上皮的重量更轻，从年纪较大的动物收获是较深。黑色箭头指示的一些底层的血管，出现色素减退。
图3。鬼笔环肽染色可以用来检测身体损害的RPE。鬼笔环肽染色清晰地勾勒出的细胞膜，上皮六角形。 （一）例如，从一个黑色的鼠标。 （二）例如，从稀鼠标。
图4。从稀释的小鼠解剖不当的视网膜色素上皮 （A）括号表示角膜的边缘太宽，这可能会导致屈曲和/或折叠。在黑色圆圈中，你可以看到尚未从后面的眼睛中删除的多余组织的过度。他们尤为明显，因为样本是从稀动物。左下角的花瓣是部分折叠。 （b）本整装风车的外观。黑色箭头表示一些削减作了。 corneo巩膜鸿沟走向视神经头的削减，很多都不是直径。 （三）如何削减已取得的直径和垂直切线，黑色箭头表示。
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Discussion
视网膜色素上皮是联合国的 P检测的站点，在体内的同源性定向修复检测。 联合国的 p检测已用于研究不同的DNA损伤的影响 ，1,2和频率上的同源性定向修复DNA损伤信号和修复基因3,4,5。此实验是非常敏感的检测单细胞活动的RPE 1。它也可以检测到 6在开发过程中的同源性定向修复事件的时间差异。鼠眼径向向外发展视神经7，因此，从视神经头的事件的相对距离与它们发生在发展的时间。
感兴趣的那些研究视网膜发育或视网膜疾病的RPE。虽然可以培养的视网膜色素上皮细胞，有很大的局限性，这样做。成人视网膜色素上皮细胞分裂后7和可预见的不扩散以及在体外 。此外，那些文化不增长，显示了许多改变，包括但不限于色素沉着的变化，形态， 细胞交界处8 -的一些特点，是科学考察的重点。因此，一个整装的RPE准备是一种在体内研究的发展和眼疾的相关技术。
首先，这个小组织清扫术是非常棘手的。重要的是要放松和保持正确的姿势和定位，在这个视频文章所示。如果整个安装视网膜色素上皮看起来像一个风车，这是因为长期被削减直径线，即不垂直切线。这是最有可能发生剪刀时不举行的前面和垂直远离身体。的削减之间的剪刀刀片轻微撤离可能是由于长期的削减一个锯齿状外观。
RPE细胞表面粗糙或粗犷的外观不正常，可能是由于标本处理粗糙造成损害。损坏可以使用鬼笔环肽染色验证。白色或斑点清晰，也造成处理不当或穿刺孔，在视网膜色素上皮和基本脉络。
如果出现的视网膜色素上皮粗糙，不透明，这可能是由于残存的视网膜神经。如果眼睛不足或过度固定（不少于2小时，超过4小时）在4％煤灰，这可能会发生。这也可能发生在眼睛中存储了过多的时间期限（> 6个月）妥善固定。 Dispase治疗，可用于消除这些残余，但也可能导致视网膜色素上皮分手。
稀或白化标本中检测到物理损坏的RPE是非常困难的的。我们建议使用你早期解剖的鬼笔环肽染色，所以你可以看到任何可能发生的由于处理不当造成的损害。要做到这一点，块1小时200μL2％的牛血清白蛋白在微型离心管1XPBS。接下来，添加2μL鬼笔环肽，并在黑暗中孵育室温为20分钟。然后用1XPBS 1ML在黑暗的房间温度每30分钟的3倍。山像往常一样的幻灯片。 *注：污渍是非常光明的的，我们不建议使用flouramount或类似flourescence维护媒体。
尽管所有的警告，整个安装的RPE并不十分精致，可以轻松承受的处理需要进行解剖，染色，免疫组织化学，或免疫。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由全国环境卫生科学研究所的支持K22ES012264 AJRB]和美国癌症协会InstitutionalResearch格兰特[ACS - IRG - 00 - 173 - 04]试点projectaward [AJRB]。我们也感谢批判性阅读的稿件和评论，尤其是视频和亚当布朗主教实验室的成员，什么不该做的例子。我们感谢让我们解剖视频拍摄他解剖的范围/摄像机设置使用Greehey儿童癌症研究所的博士唐纳德麦克尤恩。我们感谢达龙布朗科尔特仪器锐化和修复我们的显微切割工具。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| straight forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4903 | tip: .08 x .04 mm material: INOX |
| 45° forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5005 | tip: .05 x.01 mm material: INOX |
| 15° "up" forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5045A | tip: .1 x.06 mm material: INOX |
| spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5604 | comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel |
| binocular dissecting microscope | Carl Zeiss, Inc. | Discovery V.8 | use reflected light source |
| phalloidin | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 |
References
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