Summary
Uma demonstração formal da dissecação de um olho de rato, resultando em uma montagem de todo o epitélio pigmentar da retina.
Abstract
Do epitélio pigmentar da retina (EPR) está no fundo do olho dos mamíferos, logo abaixo da retina neural, que contém os fotorreceptores (cones e bastonetes). O EPR é uma monocamada de células pigmentadas cuboidal e associados estreitamente com a retina neural logo acima dele. Esta associação faz com que o RPE de grande interesse para pesquisadores que estudam doenças da retina. O RPE é também o local de um ensaio in vivo de homologia dirigido reparo do DNA, o ensaio p un. O olho do rato é particularmente difícil de dissecar, devido ao seu pequeno tamanho (cerca de 3,5 milímetro de diâmetro) e sua forma esférica. Este artigo demonstra detalhadamente um procedimento para dissecação do olho, resultando em uma montagem de todo o RPE. Neste procedimento, vamos mostrar como trabalhar com, e não contra, a estrutura esférica do olho. Resumidamente, o tecido conjuntivo, músculo e do nervo óptico são removidos da parte traseira do olho. Então, a córnea eo cristalino são removidos. Em seguida, os cortes são feitos estratégicas que resultam em achatamento significativo do tecido remanescente. Finalmente, a retina neural é suavemente levantado, revelando um RPE intactas, o que ainda está ligado à coróide subjacente e esclera. Esta montagem inteira pode ser usado para executar o ensaio p un ou para avaliação imuno-histoquímica ou imunofluorescência do tecido EPR.
Protocol
1. Remover o tecido Extraneous do lado de fora do olho
- Despeje 1X PBS na tampa de um prato de 35 mm. O nível deve ser logo abaixo da borda da tampa.
- Utilizando uma pinça reta, olhos de transferência (s) do tubo de armazenamento para o prato de 35 mm. Olhos estão submersos em PBS, por duas razões: 1. Os tecidos estranhos irá "flutuar" longe dos olhos para que você possa ver e removê-los facilmente, e 2. Durante a dissecção, o olho vai, naturalmente, manter a sua forma esférica, enquanto em suspensão, permitindo que você trabalhe com este formato e não contra ela.
- Utilizando ambas as pinças anguladas (45 ° e 15 °), remova tanto músculo e tecido conjuntivo possível, puxando o tecido contra a corrente (ou seja, em direção à córnea). Alguns tecido conjuntivo permanecerá. Esforço deve ser feito para comprimir o globo ocular o mínimo possível.
- Comércio seus 15 ° para pinças tesouras primavera. Enquanto mantém o olho fixo com 45 pinças °, use a tesoura para cortar mola muscular restantes e do tecido conjuntivo, bem como o nervo óptico. * Dica: Use a borda externa da tesoura para empurrar o tecido de encontro à grão (em direção a divisão córneo-escleral) e depois cortar. Continue até que todo o tecido estranho foi removido do olho.
2. Remova a córnea ea lente
- Com a córnea para cima, use a pinça de 45 ° a beliscar-se uma pequena dobra no centro da córnea.
- Usando a tesoura primavera, fazer uma pequena incisão na base do retalho. Deixar de ir a retalho.
- Mantendo os olhos ainda com o fórceps, inserir o menor lâmina de tesoura para dentro e perpendiculares à incisão e fazer um corte para a divisão córneo-escleral. Tente manter a sua menor lâmina sob a íris para tanto a córnea ea íris são cortadas. Não corte todo o caminho para a divisão córneo-escleral. Mantenha tesouras inserido no olho.
- Usando o seu fórceps de 45 °, cuidadosamente girar o olho para que sua tesoura são paralelos ao dividir córneo-escleral e fazer um pequeno corte. Girar lentamente os olhos de 360 °, fazendo pequenas incisões em toda a volta. Mais uma vez, tentar manter a parte inferior da lâmina da tesoura sua primavera sob a íris para que ambos íris e córnea são cortados. Levante a íris ea córnea longe do resto do olho e descartá-las.
- Incline o olho do seu lado e pressione suavemente na metade posterior do olho, forçando a lente para fora. Descarte da lente. O interior da ocular restante está alinhada pela retina neural, que deve ser suave e opaca.
3. Trimestre a ocular, resultando, resultando em um 4 - "pétalas", flor-como a estrutura
- O olho deve estar posicionado de tal forma que a abertura da ocular é perpendicular ao seu corpo. Use sua pinça de 45 ° a posição firme e ocular o.
- Segurando uma tesoura sua primavera na frente de você assim que são perpendiculares ao seu corpo, insira a parte inferior da lâmina da tesoura sua primavera na borda superior do copo olho aberto. Usando o seu fórceps de 45 °, alinhe cuidadosamente o copo olho para que um corte, única reta pode ser feita a partir da divisão córneo-escleral em direção à cabeça do nervo óptico. Todos os cortes devem ser perpendicular à divisão córneo-escleral ea menos que especificado, deve ir tão perto da cabeça do nervo óptico quanto possível, sem cortá-lo.
- Gire a ocular 180 °, mantendo a sua perpendicularidade com o seu corpo. Usar a técnica em passo 3.2 para fazer um corte perpendicular segundo.
- Gire a ocular e repita a técnica descrita em 3.2 para fazer dois cortes mais. Todos os quatro cortes devem ser tão próximas a 90 ° entre si quanto possível. Tenha em mente que o olho não é perfeitamente esférica para que haja alguma variabilidade.
4. Corte cada um dos quatro "pétalas" no meio, resultando em uma estrutura de oito pétalas de flores como
- Transferência a ocular esquartejado do prato 35 milímetros para uma lâmina limpa. Com a ocular para cima, colher por baixo com as 45 forceps °. Cuidadosamente retire-o do líquido e colocá-lo em uma lâmina limpa.
- Utilizando ambas as pinças anguladas, gentilmente abrir o olho, com a retina neural voltada para cima. NÃO REMOVA A NEURAL RETINA-ajuda o olho manter alguns de seus forma esférica para que você não está trabalhando contra ela. Também protege o RPE de ser acidentalmente danificados nos procedimentos a seguir.
- Gire o slide até que uma das pétalas é perpendicular ao seu corpo.
- Use seus 15 forceps °, agarram delicadamente o canto da pétala. O canto da pétala deve ser córnea, retina neural ou não RPE. Levante o canto suave, permitindo-lhe manter a sua curvatura.
- Insira a lâmina inferior da tesoura sua mola entre a pétala eo slide. Line up suas tesouras de tal forma que uma única linha reta, corte perpendicular pode ser feita a partir da divisão córneo-escleral em direção à cabeça do nervo óptico. Corte o mais próximo da cabeça do nervo óptico como withou possívelt cortá-lo. Deixar de ir a pétala, permitindo que ele deitar no slide.
- Girar a lâmina de 90 °, de modo que a pétala seguinte é perpendicular ao seu corpo. Repita o passo 4.5.
- Repita os passos 4.5 e 4.6 mais duas vezes. A estrutura resultante deve ser semelhante a uma flor de oito pétalas.
5. Remova a retina neural
- Pipeta 100-200 mL de 1X PBS para a amostra. Isso impedirá que a retina neural grude que você retire-a do EPR.
- Tipicamente, a retina neural é vagamente ligado ao RPE. No entanto, ele requer prática e habilidade para remover somente a retina neural e não o RPE. Gentilmente segure uma pétala da retina neural com um par de pinças anguladas estabilizando ao mesmo tempo (mantendo) o resto do olho com o outro par de pinças anguladas. Puxe a retina neural longe do resto do olho. Continue este procedimento até a retina inteiras neural foi removido. * Dica: furar a ponta do seu 15 ° para forceps cabeça do nervo óptico para ancorar o olho. Em seguida, use a pinça de 45 ° para varrer debaixo da retina neural e retire-a e longe. Geralmente é melhor para levantar a retina neural da cabeça do nervo óptico em direção ao dividir córneo-escleral. Certifique-se de afastar quaisquer vestígios da íris frouxa. A íris é muito pegajosa e pode ficar preso de outra forma para o EPR.
- Lavar a amostra com PBS 1X. Pipeta 100-200 mL de 1X PBS para a amostra e chupar-lo de volta. Descartar a PBS. Repita conforme necessário para remover a poeira e detritos.
6. Monte você espécime (s) em um slide
- Pipeta 80-90 mL de glicerol 90% para um novo slide em uma forma retangular. Use o lado da ponta da pipeta para fazer um esfregaço, mesmo retangular de glicerol. (Este é o procedimento para a montagem de dois RPE em um slide.)
- Insira o antebraço de 15 de fórceps ° sob o espécime. Levante cuidadosamente a amostra para fora do diapositivo de dissecação.
- Abaixe lentamente a amostra para o glicerol. Abanando as pinças como você retirá-los de debaixo do espécime.
- Repita os passos de 6,1-6,3 para o outro espécime.
- Gire o slide para que o lado mais longo é perpendicular ao seu corpo. Segure o vidro da tampa em um ângulo de 45 ° para o slide de forma que ele está tocando o slide. Movê-lo para o esfregaço glicerol até que eles toquem. Manter contato entre a tampa de vidro e deslize, mova lentamente a tampa de vidro longe da mancha, em direção à borda do slide. Alinhe os lados da lâmina ea tampa de vidro de modo que eles são paralelos. Segure os cantos da tampa de vidro entre o polegar eo indicador.
- Pegar o 15 ° em uma pinça a outra mão. Berço da borda (grátis) superior da tampa de vidro na dobra do braço. Muito lentamente, abaixe a tampa de vidro. Quando o contato é feito entre o vidro da tampa e do glicerol, pare e espere que o glicerol para migrar. Repita esse rebaixamento e espera até que as montagens RPE todo são totalmente cobertos. Isso é para evitar o glicerol altamente viscoso de capturar as bolhas de ar. NÃO empurre para baixo a lamela - o glicerol vai apertar debaixo dela, fazendo de adesão muito pobre.
- Com claras unha polonês, pintura em torno do perímetro onde a tampa de vidro e deslize se encontram.
- Coloque o slide em cima de uma prateleira vazia para secar.
7. Resultados representativos:
O resultado deste procedimento deve ser uma estrutura que se parece com uma flor e deve ser bastante simétricos.
Figura 1. RPE montar todo a partir de um rato C67Bl/6J tipo selvagem. RPE de preto ou animais cutia deve ser de cor marrom escuro e deve ter uma superfície lisa. É normal a notar ondulações na topografia das pétalas. A pigmentação em qualquer espécime dar pode ser um pouco variável, devido à densidade variável de pigmentação de ambos RPE ea coróide subjacente. Setas brancas apontam para hipopigmentadas "canais" - isto é normal e é devido à vascularização subjacente do olho. Azul seta aponta para danos físicos aos dois RPE ea coróide subjacente.
Figura 2. RPE montar todo a partir de um camundongo diluído. Amostras colhidas de animais diluir pode variar de cor de quase transparente para café au lait e qualquer um espécime é como ter variabilidade dentro dela, indicado em círculos negros aqui. Em geral, RPE colhidas de animais mais jovens são mais leves e aqueles colhidos de animais mais velhos são mais escuras. Setas pretas indicam alguns dos vasculatura subjacente, que aparece hipopigmentadas.
Figura 3. Faloidina coloração pode ser usado para detectar danos físicos ao RPE. Coloração faloidina define claramente as membranas celulares, mostrando a forma hexagonal do epitélio. (A) Exemplo de um rato preto. (B) Exemplo de um camundongo diluído.
Figura 4. A RPE mal dissecados de um camundongo diluído. (A) Os colchetes indicam margens de córnea que são demasiado grandes, que podem causar deformação e / ou dobrar. Dentro do círculo preto você pode ver uma quantidade excessiva de tecido estranho que não tenham sido removidos da parte traseira do olho. Eles são particularmente evidente, porque a amostra é de um animal diluída. A pétala no canto inferior esquerdo é parcialmente dobrada. (B) Esta montagem tem toda a aparência de um cata-vento. Setas pretas indicam alguns dos cortes que foram feitos. Muitos dos cortes, desde desigualdade córneo-escleral em direção à cabeça do nervo óptico não estão em conformidade com o diâmetro. (C) setas pretas indicam como os cortes deveriam ter sido feitas, de acordo com o diâmetro ea perpendicular à tangente.
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Discussion
O RPE é o site da p un ensaio, um ensaio in vivo de homologia dirigido reparação. O ensaio p un tem sido usado para estudar os efeitos dos danos de DNA diferentes 1,2 e sinalização de danos ao DNA e genes de reparo 3,4,5 sobre a freqüência de homologia dirigido reparação. Este ensaio é altamente sensível, detectando uma única célula eventos no RPE 1. Ele também pode detectar diferenças no momento de homologia-dirigido eventos de reparo durante o desenvolvimento 6. O olho murino desenvolve radialmente para fora a partir do nervo óptico 7 e, portanto, a distância relativa de eventos a partir da cabeça do nervo óptico se correlaciona com o tempo de desenvolvimento em que eles ocorreram.
O RPE é também de interesse para aqueles que estudam o desenvolvimento da retina ou doenças da retina. Embora as células RPE podem ser cultivadas, existem limitações significativas para fazê-lo. RPE células adultas são pós-mitóticas 7 e previsivelmente não proliferam bem in vitro. Além disso, as culturas que se desenvolvem mostram muitas alterações, incluindo mas não limitados a mudanças na pigmentação, morfologia e junções celulares 8 - algumas das características que são o foco da investigação científica. Portanto, a preparação de uma montagem toda a RPE é uma técnica relevante para estudos in vivo de desenvolvimento e de doenças do olho.
Dissecção deste tecido pequena é muito complicado no início. É importante estar relaxado e manter a postura correta eo posicionamento como mostra este artigo de vídeo. Se montar um todo RPE parece um cata-vento, é porque os cortes longos não foram feitas de acordo com o diâmetro, ou seja, não perpendicular à tangente. Isto é mais provável de ocorrer quando a tesoura não são detidos em frente e perpendicularmente longe do corpo. A aparência irregular ao longo cortes é provavelmente devido a uma ligeira retirada das lâminas de tesoura entre cortes.
A aparência áspera ou acidentado para a superfície RPE não é normal e pode ser devido a danos causados por manuseio da amostra. Dano pode ser verificada usando coloração phalloidin. Manchas brancas ou claras são buracos no RPE ea coróide subjacente, também causada por manuseio brusco ou punção.
Se o RPE aparece áspera e opaca, esta é provavelmente devido a resquícios da retina neural. Isso pode ocorrer se os olhos são sub ou super-fixo (menos de 2 horas, mais de 4 horas em PFA 4%). Isso também pode ocorrer nos olhos adequadamente fixo que tenham sido armazenadas por um período excessivo de tempo (> 6 meses). Dispase tratamento pode ser usado para remover restos tal, mas também pode causar o RPE para quebrar.
Detecção de danos físicos ao RPE é muito difícil em amostras diluídas ou albino. Recomendamos o uso de coloração phalloidin em seu dissecções cedo para que você possa ver qualquer dano que possa ter ocorrido devido ao manuseio. Para fazer isso, o bloco de uma hora com BSA 2% em 200μL 1XPBS em um tubo de centrífuga de micro. Em seguida, adicione phalloidin 2μL e incubar no escuro à temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, lave 3x com 1mL de 1XPBS por 30 minutos cada em temperatura ambiente no escuro. Montar slides como de costume. * Nota: a mancha é muito brilhante e nós não recomendamos o uso flouramount ou similar Fluorescência de preservação da mídia.
Apesar de todas as advertindo, um RPE montar todo não é muito delicada e pode facilmente suportar o tratamento necessário para realizar a dissecação, coloração, imuno-histoquímica ou imunofluorescência.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Ciências de Saúde Ambiental [K22ES012264 para AJRB] e um American Cancer Society InstitutionalResearch Grant [ACS-IRG-00-173-04] piloto projectaward [para AJRB]. Agradecemos também aos membros do laboratório de Bishop para a leitura crítica do manuscrito e comentários sobre o vídeo e Adam Brown, em particular, para a exemplo do que não fazer. Agradecemos ao Dr. Donald McEwen de Câncer Greehey infantil Research Institute por nos permitir o uso de seu escopo dissecar / vídeo câmera set-up para as filmagens do vídeo de dissecação. Agradecemos a Daron Brown em Instrumentos Corte para afiar e reparação de nossas ferramentas de microdissecção.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| straight forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4903 | tip: .08 x .04 mm material: INOX |
| 45° forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5005 | tip: .05 x.01 mm material: INOX |
| 15° "up" forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5045A | tip: .1 x.06 mm material: INOX |
| spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5604 | comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel |
| binocular dissecting microscope | Carl Zeiss, Inc. | Discovery V.8 | use reflected light source |
| phalloidin | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 |
References
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