Summary
Bir fare göz diseksiyon resmi bir gösteri, retinal pigment epitel bir bütün montaj.
Abstract
Memeli gözün arkasındaki retina pigment epitel (RPE), fotoreseptör (çubuklar ve koniler) içeren nöral retina altında yatıyor. RPE yakından sadece yukarıda nöral retina ile pigmentli küboid hücreleri ve iştiraklerin tek tabaka. Bu dernek, retina hastalıklarının çalışan araştırmacılar büyük ilgi RPE yapar. RPE homoloji yönettiği DNA onarımı, p un tahlil in vivo tayininde bir sitedir. Küçük boyutu nedeniyle teşrih (çapı 3.5mm hakkında) ve küresel şekli fare göz özellikle zordur. Bu makalede ayrıntılı olarak RPE bir bütün montaj ile sonuçlanan göz diseksiyon için bir prosedür ortaya koymaktadır. Bu prosedürde, küresel yapısı, karşı göz ile değil, nasıl çalıştığını gösteriyor. Kısaca, bağ dokusu, kas, ve optik sinir gözün arka kaldırılır. Sonra, kornea ve lens kaldırılır. Sonraki kalan doku önemli düzleşme, stratejik kesimler bu sonucu yapılır. Son olarak, nöral retina nazikçe, hala altta yatan koroid ve sklera bağlı bozulmamış bir RPE, ifşa, kapalı olduğunu kaldırdı. Bütün bu montaj p un tahlil veya RPE doku immünhistokimya veya immunofluorescent değerlendirilmesi için gerçekleştirmek için kullanılabilir.
Protocol
1. Gözün dışında fazladan doku çıkarın
- 1X PBS 35mm çanak kapağı içine dökün. Seviyesi sadece kapağın dudak altında olmalıdır.
- 35mm çanak depolama tüpü düz forseps, transfer göz (ler) kullanarak. 1: Gözler iki nedenden ötürü PBS batmış. Görmek ve onları kolayca kaldırmak ve 2, böylece gereksiz dokular göz "float". Diseksiyon sırasında asılı kalırken, gözün doğal olarak buna karşı ziyade bu şekli ile çalışmak için izin, küre şeklini koruyacaktır.
- Açılı forseps (45 ° ve 15 °) her iki çifti kullanarak, hafifçe (kornea doğru yani) tahıl karşı doku çekerek, mümkün olduğu kadar çok kas ve bağ dokusu gibi çıkarın. Bazı bağ dokusu kalacaktır. Çaba mümkün olduğunca az göz küresinin sıkmak için yapılmalıdır.
- Yaylı makas için 15 ° forseps Tic. 45 ° forseps ile göz sabit tutarken, kalan kas ve bağ dokusunun yanı sıra optik sinir kesip yaylı makas kullanın. * İpucu: Döşeme sonra tahıl karşı doku itmek için makas dış kenarına kullanın (corneo skleral bölmek doğru). Tüm yabancı doku, göz çıkarıldı kadar devam edin.
2. Kornea ve lens çıkarın
- Kornea yukarı bakacak şekilde, kornea merkezinde kat küçük bir çimdik 45 ° forseps kullanabilir.
- Yaylı makas kullanılarak, flep tabanında küçük bir kesi yapmak. Flep gidelim.
- Holding gözleri hala forseps düşük makas bıçak yerleştirin ve kesi dik ve corneo skleral bölmek doğru bir kesim yapmak. Alt bıçak, hem kornea ve iris kesilir, böylece, iris altında tutmak için çalışın. Corneo-skleral bölmek için tüm yol kesmeyin. Göz takılı makas tutun.
- 45 ° forseps kullanarak, dikkatli bir makas corneo-skleral bölmek için paralel böylece göz döndürmek ve küçük bir kesim yapmak. Yavaş yavaş, etrafında küçük kesiler tüm yol, göz 360 ° döndürün. Yine, yaylı makas alt bıçak, iris ve kornea kesilir, böylece, iris altında tutmaya çalışın. Iris ve kornea gözün geri kalanı uzakta kaldırın ve atın.
- Göz yan yatırın ve lens zorlayarak, gözün arka yarısında hafifçe bastırın. Lens atın. Kalan Göz yuvası içinde nöral retina, pürüzsüz ve mat görünmelidir kaplı olduğu.
3. Çeyrek 4 sonucu ortaya çıkan göz kapağı "petaled" çiçek gibi yapı
- Göz Göz yuvası açılması vücudunuza dik olacak şekilde yerleştirilmiş olmalıdır. 45 ° forseps, kararlı ve pozisyon Vizör adaptör kullanın.
- Önünde yaylı makas Holding bu yüzden vücudunuza dik yaylı makas alt bıçak, açık göz fincan üst kenarına yerleştirin. 45 ° forseps kullanarak dikkatli bir şekilde, bir tek, düz kesim optik sinir başı doğru corneo-skleral ayrımı yapılabilir böylece göz fincan hizalayın. Tüm kesimler corneo-skleral bölmek için dik olmalı ve belirtilmediği sürece, içine kesmeden optik sinir başı olarak mümkün olduğunca yakın gitmek gerekir.
- Vücudunuzun dikliğini koruyarak, Göz yuvası 180 ° döndürün. Ikinci bir dik kesim yapmak için 3.2 adımı tekniği kullanın.
- Göz yuvası çevirin ve iki tane daha kesimler yapmak için 3.2 'de açıklanan tekniği tekrarlayın. Tüm dört kesimler dışında 90 ° mümkün olduğunca yakın olmalıdır. Bazı farklılıklar bulunmaktadır olacak kadar gözü mükemmel bir küre olmadığını aklınızdan çıkarmayın.
4. Sekiz yapraklı bir çiçek gibi bir yapı içinde, yarım her dört "yaprakları" Kes
- 35mm çanak temiz bir slayt dörde Göz yuvası aktarın. Göz yuvası yukarı bakacak şekilde, 45 ° forseps ile altında kepçe. Sıvı dikkatlice dışarı çıkarın ve temiz bir slayt üzerine yerleştirin.
- Açılı forseps iki çifti kullanarak, yavaşça yukarı bakacak şekilde nöral retina ile göz açmak. ÇIKARMAYIN SİNİR Retina-buna karşı değildir bu yüzden göz küre şeklini bazı korumak yardımcı olur. Ayrıca, aşağıdaki yordamları kazara zarar görmesini RPE korur.
- Slayt yaprakları bir vücudunuzun dik olana kadar çevirin.
- 15 ° forseps yavaşça petal köşe kapmak. Petal köşesinde değil, nöral retina veya RPE kornea olmalıdır. Onun eğrilik korumak için izin köşesinde hafifçe yukarı kaldırın.
- Petal ve slayt arasında yaylı makas alt bıçak yerleştirin. Makas kadar satır, bir tek, düz, dik kesme, optik sinir başı doğru corneo-skleral bölmek yapılabilir. Içine kesmeden optik sinir başı olarak mümkün olduğunca yakın kesin. Gidelimslaytta yalan sağlayan taç yaprağı.
- Slayt 90 ° döndür, sonraki petal vücudunuza dik olacak şekilde. 4,5 adımı tekrarlayın.
- Bunu iki kez daha adım 4.5 ve 4.6 tekrarlayın. Ortaya çıkan yapı, sekiz yapraklı bir çiçek gibi görünmelidir.
5. Nöral retina çıkarın
- Pipet 100-200 mcL numune üzerine 1X PBS. Bu nöral retinanın RPE soyulması gibi yapışmasını önleyecektir.
- Genellikle nöral retina gevşek RPE eklenir. Ancak, sadece nöral retina ve RPE kaldırmak için uygulama ve beceri sürer. Açılı forseps diğer çift göz (basılı tutarak) geri kalanı stabilize bir çift açılı forseps ile yavaşça nöral retinanın bir taç yaprağı kavramak. Nöral retina gözün geri kalanı uzakta çekin. Tüm nöral retina kaldırıldı kadar bu işleme devam edin. * İpucu: göz çapa optik sinir başı 15 ° forseps ucu sopa. Sonra nöral retina altına süpürüyor 45 ° forseps kullanımı ve kapalı asansör ve. Nöral retina, corneo skleral bölmek doğru optik sinir başı kaldırmak için en iyi genellikle. Iris herhangi bir gevşek kalıntıları çekmeye emin olun. Iris oldukça yapışkan ve aksi RPE sıkışmış alabilirsiniz.
- 1X PBS ile örnek durulayın. Pipet 100-200 numune içine 1X PBS mcL ve yedekleme emmek. PBS atın. Toz ve enkaz kaldırmak için gerekli tekrarlayın.
6. Bir slayt Mount numune (ler)
- Pipet 80-90 mcL dikdörtgen şeklinde yeni bir slayt üzerine% 90 gliserol. Gliserol, hatta bir dikdörtgen karalama yapmak için pipet ucu tarafında kullanın. (Bu bir slayt iki RPE montaj için bir işlemdir.)
- , Örnek altında 15 ° forseps alt kolu takın. Diseksiyon slayt kapalı örnek yavaşça kaldırın.
- Gliserol içine yavaşça örnek daha düşüktür. Yavaşça numune altından onları çekin forseps wiggle.
- Diğer örnek için 6,1-6,3 adımları tekrarlayın.
- Uzun kenarı vücudunuzun dik böylece slayt döndürün. Kapak cam tutun 45 ° slayt dokunmadan böylece slayt açı. Dokunmak kadar gliserol smear doğru hareket ettirin. Kapak cam ve slayt arasındaki temas sağlanması, slayt kenarına doğru yavaş yavaş, smear uzak kapak cam taşımak. Slayt, uzun kenarlarında ve kapak cam hizaya böylece paralel. Başparmak ve işaret parmağı arasındaki kapak cam köşelerinden tutun.
- Diğer taraftan 15 ° forseps Pick up. Üst (ücretsiz) kol Crook kapak cam kenarına Cradle. Çok yavaş, kapağı cam düşüktür. Kapak cam ve gliserol arasındaki temas yapıldığında, durdurma ve gliserol geçirmek için bekleyin. Bu düşürücü ve RPE bütün bağlar tamamen kaplıdır kadar bekleyen tekrarlayın. Bu hava kabarcıkları yakalamak oldukça viskoz gliserol önlemek için. COVERGLASS aşağı doğru itin VERMEYİN - gliserol yapışma çok zayıf altında sıkmak.
- Açık oje, kapak cam ve slayt karşılamak çevresinde boya.
- Kuruması için boş bir raf üstünde slayt yerleştirin.
7. Temsilcisi Sonuçlar:
Bu prosedürün sonucu, bir çiçek gibi görünüyor ve oldukça simetrik olmalıdır bir yapı olmalıdır.
Şekil 1. Tüm montaj RPE wild tip C67Bl/6J fare, siyah veya agouti hayvanların gelen RPE koyu kahverengi renkli olmalı ve pürüzsüz bir yüzeye sahip olmalıdır . Bu yaprakları topografya dalgalı fark normaldir. Verecek herhangi bir numune üzerinde pigmentasyon RPE ve altta yatan koroid hem değişken pigmentasyon yoğunluğu nedeniyle biraz değişken olabilir. Beyaz oklar hipopigmente "kanallar" noktası - Bu normal bir durumdur ve göz altında yatan damarsal nedeniyle. RPE ve altta yatan koroid hem fiziksel hasar Mavi ok puan.
Şekil 2. Seyreltilmiş fare Tüm montaj RPE. Seyreltik hayvanlardan elde edilen hasat Örnekler café au lait neredeyse saydam renk değişebilir ve herhangi bir örnek siyah daireler burada belirtilen, içinde değişkenlik olması gibi. Genel olarak, genç hayvanlardan elde edilen hasat RPE, daha hafif ve yaşlı hayvanlarda hasat koyu. Siyah oklar hipopigmente görünen altta yatan damarsal bazı göstermektedir.
Şekil 3. Phalloidin boyama RPE fiziksel hasar tespit etmek için kullanılabilir. Phalloidin boyama hücre açıkça özetliyorepitelin altıgen şekil gösteren membranlar. (A) siyah bir fare örneği. (B) seyreltilmiş fare örneği.
Şekil 4. Seyreltilmiş fare kötü disseke RPE (A) Parantezler ve / veya katlama burkulma neden olabilir korneanın çok geniş marjları gösterir. Siyah bir daire içinde gözün arka kaldırıldı gereksiz doku aşırı miktarda görebilirsiniz. Örnek seyreltik bir hayvan çünkü özellikle açıktır. Sol alt taç yaprağı kısmen katlanmış. (B) Tüm bu montaj bir fırıldak bir görünüme sahiptir. Siyah oklar yapılmış olan bazı kesim göstermektedir. Birçok optik sinir başı doğru corneo-skleral bölmek kesim çapı ile uyumlu değildir. (C) Siyah oklar keser teğet çapı ve dik doğrultusunda yapılmış olmalıdır nasıl göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RPE bir homoloji yönettiği onarım in vivo tayininde, p un testin sitesidir. P un tahlil homoloji yönettiği onarım sıklığı üzerine etkileri farklı DNA zararların 1,2 ve DNA hasarı sinyalizasyon ve onarım genleri 3,4,5 incelemek için kullanılır olmuştur. Bu testte, RPE 1 tek hücreli olaylar tespit son derece duyarlıdır. Ayrıca homoloji yönettiği onarım olayların gelişimi 6 sırasında zamanlama farklılıkları tespit edebilirsiniz. Fare gözün optik sinir 7 dışa doğru radyal geliştirir ve bu nedenle, optik sinir başı olayların gelişiminde meydana geldiği zaman izafi mesafe ilişkilidir.
RPE de retina gelişimi ya da retina hastalıklarının eğitim görenlerin ilgisini. RPE hücrelerinin kültürü olmasına rağmen, bunu önemli sınırlamalar vardır. Yetişkin RPE hücreleri post-mitotik 7 ve tahmin edilebileceği in vitro prolifere yok. Ayrıca, büyümek mi bu kültürlerin de dahil olmak üzere birçok değişiklikler, ancak pigmentasyon değişiklikleri, morfoloji, hücre kavşakları 8 ile sınırlı değil, bilimsel bir araştırmanın odak olduğunu bazı özellikleri. Bu nedenle, RPE bir bütün montaj hazırlama, geliştirme ve göz hastalıkları in vivo çalışmalar için uygun bir tekniktir .
Bu küçük doku Diseksiyon ilk bakışta çok zor. Rahat olması önemlidir ve bu video makalede gösterildiği gibi, doğru bir duruş ve konumlandırma korumak. Bütün bir montaj RPE bir fırıldak gibi görünüyor, uzun kesimler, yani teğet değil dik bir çapı doğrultusunda yapılmış değildi, çünkü bu. Bu makas önünde düzenlenen ve dik vücuttan ne zaman ortaya büyük olasılıkla. Pürüzlü görünümünü uzun kesimler için büyük olasılıkla kesimler arasındaki makas bıçakları hafif bir geri çekilme nedeniyle.
RPE yüzeyi pürüzlü veya sağlam bir görünüm normal değildir ve numune kötü muameleden kaynaklanan hasar nedeniyle olabilir. Hasar Phalloidin boyama kullanılarak kontrol edilebilir. Beyaz veya açık noktalar da kötü muameleden veya delinme kaynaklanan delikler, RPE ve altta yatan koroid.
RPE kaba ve mat görünüyorsa, bu muhtemelen nöral retina kalıntıları nedeniyle. Gözleri, altında ya da (en az 2 saat,% 4 PFA fazla 4 saat) üzerinden sabit eğer bu durum oluşabilir. Bu aynı zamanda, düzgün bir şekilde monte gözleri aşırı uzun bir süre (> 6 ay) için depolama olmuştur oluşabilir. Dispase tedavi gibi kalıntıları çıkarmak için kullanılır, ama ayrıca RPE kırılmasına neden olabilir.
RPE fiziksel hasar algılama, seyreltilmiş ya da albino örneklerin çok zordur. Biz işleme nedeniyle meydana gelen herhangi bir zarar görmek, böylece erken diseksiyonları Phalloidin boyama kullanmanızı öneririz. Bunu yapmak için, bir mikro santrifüj tüpüne 1XPBS 200μL% 2 BSA ile 1 saat süreyle bloke eder. Sonra, 2μL Phalloidin ekleyin ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin. Ardından her biri 30 dakika karanlıkta, oda sıcaklığında 1XPBS 1 ml ile 3x yıkayın. Mount her zamanki gibi kayar. * Not: leke çok parlak ve flouramount veya benzeri flöresan koruyan medya kullanmanızı tavsiye etmiyoruz.
Uyarıda rağmen, bir bütün montaj RPE korkunç hassas değildir ve kolayca diseksiyonu, boyama, immünhistokimya, ya da immünofloresan gerçekleştirmek için gerekli taşıma dayanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü tarafından desteklenen [K22ES012264 AJRB] ve Amerikan Kanser Derneği InstitutionalResearch Grant [ACS-IRG-00-173-04] Pilot projectaward [AJRB]. Biz yapmak için değil ne, örneğin, el yazması ve özellikle de video ve Adam Brown hakkında yorum eleştirel okuma Bishop laboratuar üyeleri de teşekkür ederim. Biz Greehey Çocuk Kanser Araştırmaları Enstitüsü'nden Dr Donald McEwen diseksiyon video film çekimi için kamera set-up onun diseksiyon kapsam / video kullanımına izin verdiği için teşekkür ederim. Biz netlik ve mikrodiseksiyon araçları tamir Corte Aletleri Daron Brown teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| straight forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4903 | tip: .08 x .04 mm material: INOX |
| 45° forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5005 | tip: .05 x.01 mm material: INOX |
| 15° "up" forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5045A | tip: .1 x.06 mm material: INOX |
| spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5604 | comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel |
| binocular dissecting microscope | Carl Zeiss, Inc. | Discovery V.8 | use reflected light source |
| phalloidin | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 |
References
- Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice. Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).
- Reliene, R. H. lavacove, Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice. Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).
- Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice. Cancer Res. 60, 395-399 (2000).
- Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion. J. Nucleic Acids. , (2010).
- Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo. Nucleic Acids Res. , Forthcoming (2010).
- Bishop, A. J. p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development. Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).
- Bodenstein, L., Sidman, R. L. Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity. Dev Biol. 121, 192-204 (1987).
- Burke, J. M. Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt? Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).
