Summary
مظاهرة رسمية للتشريح العين الماوس ، مما أدى إلى تحميل كامل من الظهارة الصبغية الشبكية.
Abstract
الظهارة الصبغية الشبكية (RPE) وتقع في الجزء الخلفي من العين الثدييات ، فقط تحت الشبكية العصبية ، والتي تحتوي على المستقبلات الضوئية (قضبان ومخاريط). وRPE هو أحادي الطبقة من الخلايا الصباغية مكعبية وبشكل وثيق مع شركاء العصبية في الشبكية فقط فوقه. هذا الارتباط يجعل من RPE اهتماما كبيرا للباحثين الذين يدرسون أمراض الشبكية. وRPE هو أيضا موقع لفحص في الجسم الحي من التماثل الموجه إصلاح الحمض النووي ، ومقايسة للأمم المتحدة ع. العين الماوس صعبة للغاية لتشريح بسبب حجمها الصغير (حوالي 3.5mm في القطر) وشكلها كروي. هذه المقالة يوضح بالتفصيل عن إجراء تشريح للعين مما يؤدي إلى تحميل كامل RPE. في هذا الإجراء ، وتبين لنا كيفية العمل معها ، وليس ضد ، والهيكل الكروي للعين. باختصار ، تتم إزالة النسيج الضام والعضلات ، والعصب البصري من الجزء الخلفي من العين. ثم ، يتم إزالة القرنية والعدسة. المقبل ، يتم إجراء تخفيضات الاستراتيجية التي تؤدي إلى تسطيح كبير من الأنسجة المتبقية. أخيرا ، رفع بلطف العصبية في الشبكية الخروج ، كشفت عن RPE سليمة ، والتي لا تزال تعلق على المشيمية الكامنة والصلبة. ويمكن استخدام هذا كله جبل لتنفيذ مقايسة للامم المتحدة لتقييم p أو المناعية أو مناعي من النسيج RPE.
Protocol
1. إزالة أنسجة غريبة من خارج العين
- صب 1X PBS في غطاء من صحن 35mm. وينبغي أن تكون على مستوى أقل بقليل من شفة الغطاء.
- باستخدام الملقط على التوالي ، ونقل العين (ق) من الأنبوب التخزين إلى صحن 35mm. وغرقت العيون في برنامج تلفزيوني لسببين : 1. فإن أنسجة غريبة "تعويم" بعيدا عن العين بحيث يمكنك رؤية وإزالتها بسهولة ، و 2. أثناء تشريح ، فإن الحفاظ على العين بشكل طبيعي شكله الكروي بينما في التعليق ، مما يسمح لك العمل مع هذا الشكل وليس ضدها.
- باستخدام كل من أزواج من ملقط الزاوية (45 درجة و 15 درجة) ، وإزالة الكثير بلطف والعضلات والنسيج الضام وقت ممكن ، وسحب النسيج ضد التيار (أي نحو القرنية). سوف تبقى بعض النسيج الضام. وينبغي بذل الجهود للضغط مقلة العين أقل قدر ممكن.
- تجارتك 15 ° للملقط مقص الربيع. في حين عقد ثابت مع العين ملقط 45 درجة ، واستخدام المقص لقطع الربيع بعيدا المتبقية العضلات والنسيج الضام ، وكذلك على العصب البصري. * نصيحة : استخدم حافة خارج مقص لدفع الأنسجة ضد الحبوب (نحو الفجوة corneo - الصلبة) ثم تقليم. تستمر حتى تمت إزالة جميع أنسجة غريبة من العين.
2. إزالة القرنية والعدسة
- مع القرنية مواجهة ، استخدم ملقط 45 درجة تصل إلى أضعاف قرصة صغيرة في وسط القرنية.
- باستخدام مقص الربيع ، وجعل شق صغير في قاعدة رفرف. ترك من دحرج.
- عقد وجهة نظر لا يزال بالملقط الخاص ، تضاف إلى أقل شفرة المقص وعمودي على شق واجراء خفض في اتجاه تقسيم corneo - الصلبة. محاولة للحفاظ على النصل السفلي الخاص تحت القزحية حتى يتم قطع كل من القرنية والقزحية. لا قطع كل الطريق إلى تقسيم corneo - الصلبة. إبقاء مقص إدراجها في العين.
- باستخدام الملقط الخاص 45 درجة ، وتناوب على العين بعناية بحيث المقص الخاص موازية لتقسيم corneo الصلبة ، وجعل قطع صغيرة. استدارة 360 درجة ببطء العين ، مما يجعل من شقوق صغيرة على طول الطريق حول. مرة أخرى ، في محاولة للحفاظ على شفرة أقل من مقص الربيع الخاص تحت القزحية حتى يتم قطع كل من القزحية والقرنية. رفع القزحية والقرنية بعيدا عن بقية العين والتخلص منها.
- إمالة العين على جانبها والضغط برفق في النصف الخلفي من العين ، مما اضطر الى العدسة. تجاهل العدسة. غير مبطنة من الداخل فنجان العين المتبقية العصبية في الشبكية ، والتي ينبغي أن ننظر على نحو سلس وشفاف.
3. ربع فنجان العين الناتجة عن ذلك ، مما أدى إلى 4 -- "petaled" ، مثل هيكل الزهور
- وينبغي وضع هذه العين التي افتتاح فنجان العين هو عمودي على جسمك. استخدام الملقط الخاص إلى 45 درجة في فنجان العين ثابت والموقف.
- عقد مقص الربيع الخاص أمامك بحيث تكون عمودية على الجسم ، وإدراج شفرة أقل من مقص الربيع الخاصة بك في الحافة العليا من كأس العين مفتوحة. باستخدام الملقط الخاص ° 45 ، محاذاة بعناية كوب العين بحيث يمكن إجراء واحد ، قطع على التوالي من الفجوة corneo - الصلبة تجاه رأس العصب البصري. وينبغي أن تكون جميع قطع عمودي على تقسيم corneo الصلبة ، وإلا المحدد ، يجب أن تذهب إلى أقرب رئيس العصب البصري ممكن دون أن يقطع فيه.
- تدوير فنجان العين 180 درجة ، والحفاظ على تعامد مع جسمك. استخدام التقنية في خطوة 3.2 إلى اجراء خفض عمودي الثانية.
- تدوير فنجان العين وكرر وصف هذه التقنية في جعل 3.2 إلى اثنين آخرين من التخفيضات. ينبغي لجميع التخفيضات الأربعة قد أقرب إلى 90 درجة بعيدا ممكن. نضع في اعتبارنا أن العين ليست كروية تماما لذلك سيكون هناك بعض التباين.
4. قطع كل من "بتلات" الأربع في النصف ، مما أسفر عن بنية تشبه زهرة ثمانية البتلة.
- نقل فنجان العين إيواء من الطبق 35mm إلى شريحة نظيفة. مع فنجان العين مواجهة ، مغرفة تحته مع ملقط 45 درجة. رفع بعناية للخروج من السائل ووضعها على شريحة نظيفة.
- باستخدام كل من أزواج من ملقط الزاوية ، افتح برفق خارج العين ، وشبكية العين مع مواجهة العصبية. لا تقم بإزالة الشبكية العصبي ، فهو يساعد في الحفاظ على العين بعض من شكله الكروي حتى انك لا يعمل ضدها. لأنه يحمي أيضا من التلف RPE بالصدفه في الإجراءات التالية.
- تدوير الشريحة حتى واحدة من بتلات هو عمودي على جسمك.
- استخدام الملقط الخاص ° 15 ، والاستيلاء على بلطف زاوية البتلة. ينبغي زاوية البتلة تكون القرنية ، وليس الشبكية أو العصبية RPE. ترفع في الزاوية بلطف ، والسماح لها بالاحتفاظ بها انحناء.
- إدراج شفرة أسفل المقص الخاص الربيع بين البتلة وحرك. يصطف المقص الخاص بحيث يمكن إجراء ، مستقيم واحد ، وقطع عمودي من الفجوة corneo - الصلبة تجاه رأس العصب البصري. قطع أقرب إلى رأس العصب البصري ممكن دون أن يقطع فيه. أتركوبتلة ، والسماح لها على الاستلقاء على الشريحة.
- تدوير شريحة 90 درجة ، بحيث البتلة المقبل هو عمودي على جسمك. كرر الخطوة 4.5.
- كرر الخطوات من 4.5 و 4.6 ضعف أكثر. ينبغي أن يكون هيكل الناتج تبدو وكأنها زهرة ثمانية البتلة.
5. إزالة العصبية في الشبكية
- ماصة 100-200 ميكرولتر من 1X PBS على العينة. وهذا سيمنع الشبكية العصبية من الالتصاق كما كنت قشر تشغيله من RPE.
- عادة ما يتم إرفاق فضفاضة العصبية في الشبكية إلى RPE. ومع ذلك ، فإنه لا يأخذ الممارسة ، والمهارة الوحيدة لإزالة العصبية في الشبكية وليس RPE. فهم بلطف بتلة من العصبية في الشبكية مع زوج واحد من ملقط الزاوية حين استقرار (باستمرار) بقية العين مع الزوج الآخر من الزاوية ملقط. سحب العصبية في الشبكية بعيدا عن بقية العين. يستمر هذا الإجراء حتى تم إزالة كامل الشبكية العصبية. * تلميح : عصا غيض من الملقط 15 ° الخاص في رأس العصب البصري إلى مرساة العين. ثم استخدم ملقط 45 درجة على كنس الشوارع تحت الشبكية العصبية ورفع وتشغيله بعيدا. فمن الأفضل عادة لرفع الشبكية العصبية من رأس العصب البصري نحو الفجوة corneo - الصلبة. يجب التأكد من الانسحاب من أي مخلفات فضفاض من القزحية. القزحية هي لزجة جدا ويمكن أن تتعثر وإلا لRPE.
- شطف العينة مع 1X PBS. ماصة 100-200 ميكرولتر من 1X PBS في العينة وتمتص منه مرة أخرى. تجاهل برنامج تلفزيوني. كرر حسب الضرورة لإزالة الغبار والحطام.
6. جبل لك عينة (ق) على شريحة
- ماصة 80-90 ميكرولتر من الجلسرين 90 ٪ على شريحة جديدة في شكل مستطيل. استخدام الجانب من طرف ماصة لجعل حتى مسحة مستطيلة من الجلسرين. (هذا هو الإجراء لتركيب two RPE على شريحة واحدة).
- إدراج أقل من 15 ذراع ملقط ° تحت العينة. رفع بلطف العينة خارج الشريحة تشريح.
- انخفاض ببطء العينة إلى الجلسرين. تذبذب بلطف ملقط كما كنت اخراجهم من تحت العينة.
- كرر الخطوات من 6،1-6،3 لعينة أخرى.
- تدوير الشرائح بحيث الجانب الطويل هو عمودي على جسمك. عقد الزجاج الخاص تغطية على زاوية 45 درجة إلى الشريحة بحيث أنه لمس الشريحة. تحريكه باتجاه تشويه الجلسرين حتى اللمس. الحفاظ على الاتصال بين الزجاج وتغطي الشريحة ، تتحرك ببطء زجاج الغطاء بعيدا عن التشويه ، باتجاه حافة الشريحة. يصطف الجانبين طويلة من الشريحة وزجاج الغطاء بحيث تكون متوازية. عقد أركان الزجاج غطاء بين الإبهام والسبابة.
- التقاط ملقط ° 15 في يدك الأخرى. مهد العليا (مجانا) حافة الزجاج في تغطية المحتال من ذراعه. ببطء شديد ، وانخفاض الغطاء الزجاجي. عندما يتم الاتصال بين زجاج الغطاء والجلسرين ، والتوقف والانتظار لالجلسرين للهجرة. كرر هذا خفض والانتظار حتى يتم تغطية كاملة يتصاعد RPE كله. هذا هو لمنع الجلسرين عالية اللزوجة من التقاط فقاعات الهواء. لا تضغط باستمرار على ساترة -- الجلسرين والضغط من تحت ، مما يجعل الالتصاق سيئة للغاية.
- مع طلاء الأظافر واضحة ، والطلاء حول محيط حيث يغطي الزجاج وتلبية الشريحة.
- مكان الشريحة على قمة الرف فارغة لتجف.
7. ممثل النتائج :
وينبغي أن تكون نتيجة هذا الإجراء أن يكون الهيكل الذي يشبه الزهرة ، وينبغي أن تكون متماثلة إلى حد ما.
الشكل 1. وينبغي تحميل كامل من RPE ماوس C67Bl/6J wildtype. RPE من الأسود أو الحيوانات آغوطي تكون مظلمة في اللون البني ويجب أن يكون السطح على نحو سلس. فمن الطبيعي أن نلاحظ التموجات في الطوبوغرافيا من بتلات. قد تصبغ على أية عينة إعطاء تكون متغيرة بعض الشيء ، نظرا لكثافة المتغير تصبغ RPE على حد سواء والمشيمية الكامنة. الأسهم البيضاء تشير الى "قنوات" ناقصة الصباغ -- وهذا أمر طبيعي ويعود إلى الأوعية الدموية الكامنة وراء العين. السهم الأزرق يشير إلى أن الأضرار المادية على حد سواء RPE والمشيمية الكامنة.
الشكل 2. كله من جبل RPE ماوس المخففة. العينات يمكن حصادها من الحيوانات تتراوح في تخفيف لون شفاف تقريبا من الاتحاد الافريقي مقهى قهوة بحليب وأية عينة واحد هو أن يكون التباين في داخله ، وأشار في الدوائر السوداء هنا. بصفة عامة ، RPE تحصد من الحيوانات الأصغر سنا هي أخف وتلك التي تحصد من أقدم الحيوانات أغمق. السهام السوداء تشير بعض الأوعية الدموية الكامنة ، والتي تظهر ناقصة الصباغ.
الشكل 3. يمكن استخدامها للكشف عن تلطيخ Phalloidin أضرارا مادية RPE. Phalloidin تلطيخ يحدد بوضوح الخليةالأغشية ، وتظهر على شكل سداسي من الظهارة. (أ) مثال من الماوس السوداء. (ب) مثال من الماوس المخففة.
الشكل 4. A RPE تشريح سيئة من تمييع ماوس (أ) بين قوسين تشير إلى أن هامش القرنية واسعة جدا ، والذي يمكن أن يسبب التواء و / أو قابلة للطي. داخل دائرة سوداء يمكنك رؤية كميات كبيرة من الأنسجة الغريبة التي لم يتم إزالتها من الجزء الخلفي من العين. فهي واضحة ولا سيما لأن العينة من حيوان المخففة. غير مطوية جزئيا بتلة على اليسار أسفل أكثر. (ب) وهذا كله قد يشن مظهر الدولاب على الهواء. السهام السوداء تشير بعض التخفيضات التي تم إجراؤها. العديد من التخفيضات من الفجوة corneo - الصلبة تجاه رأس العصب البصري لا يتماشى مع القطر. (C) السهام السوداء تبين كيف كان ينبغي أن التخفيضات التي أجريت ، وذلك تمشيا مع قطر وعمودي على المماس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وRPE هو موقع للامم المتحدة مقايسة ع ، وهي مقايسة في الجسم الحي للإصلاح ، تناظر الموجهة. وقد استخدمت الأمم المتحدة للمقايسة p لدراسة آثار أضرار الحمض النووي DNA ومختلف 1،2 يشير الضرر وإصلاح الجينات 3،4،5 على وتيرة الإصلاح ، تناظر الموجهة. هذا الاختبار هو حساسة للغاية ، وكشف وحيد الخلية الأحداث على RPE 1. فإنه يمكن أيضا الكشف عن الاختلافات في توقيت تناظر توجيه الأحداث خلال إصلاح التنمية 6. العين الفئران تطور شعاعيا الخارج من 7 العصب البصري وبالتالي فإن المسافة النسبية للأحداث من رأس العصب البصري يرتبط الوقت في التنمية الذي وقعت فيه.
وRPE هو أيضا من مصلحة لأولئك الذين يدرسون تطوير شبكية العين أو أمراض الشبكية. بالرغم من أنه يمكن تربيتها RPE الخلايا ، وهناك قيود كبيرة على القيام بذلك. خلايا البالغين RPE وبعد الإنقسامية 7 و لا يمكن التنبؤ بها بشكل جيد تتكاثر في المختبر. علاوة على ذلك ، تلك الثقافات التي لا تنمو تظهر تغيرات كثيرة ، بما في ذلك ولكن لا تقتصر على التغيرات في لون والشكل ، وتقاطعات الخلية 8 -- بعض الخصائص التي هي محور التحقيق العلمي. ولذلك ، وإعداد جبل كامل من RPE هي تقنية ذات الصلة في الدراسات المجراة للتنمية ، وأمراض العين.
تشريح هذا النسيج الصغيرة هو صعب جدا في البداية. من المهم أن تكون مريحة والحفاظ على الموقف السليم وتحديد المواقع كما هو موضح في هذه المقالة الفيديو. إذا كان كل جبل RPE يشبه الدولاب على الهواء ، وهذا هو بسبب عدم إجراء تخفيضات في خط طويل مع القطر ، أي عمودي وليس إلى الظل. وهذا هو الأرجح أن يحدث عندما لا يتم عقد مقص أمام عموديا وبعيدا عن الجسم. وخشنة المظهر إلى التخفيضات طويلة ومن المرجح نتيجة لانسحاب طفيف للشفرات مقص بين التخفيضات.
والمظهر الخشن أو الوعرة على السطح RPE ليس طبيعيا ويمكن أن يكون راجعا إلى الأضرار الناتجة عن المعاملة القاسية للعينة. يمكن التحقق من الضرر به phalloidin تلطيخ. بقع بيضاء أو واضحة هي ثقوب في RPE والمشيمية الكامنة ، وتسبب أيضا في معالجة الخام أو ثقب.
إذا كان يبدو RPE الخام ومبهمة ، وهذا ربما يرجع الى بقايا الشبكية العصبية. وهذا يمكن أن يحدث إذا العيون أقل أو أكثر ثابتة (أقل من 2 ساعة ، أكثر من 4 ساعات في PFA 4 ٪). قد يحدث هذا أيضا في نظر ثابتة صحيح أنه قد تم في التخزين لفترة طويلة من الزمن (> 6 شهور). ويمكن استخدام العلاج Dispase لإزالة بقايا من هذا القبيل ، ولكن يمكن أيضا أن يسبب RPE لتفريق.
الكشف عن الأضرار المادية التي لRPE من الصعب جدا في العينات المخففة أو البيضاء. ونحن نوصي باستخدام تلطيخ phalloidin على تشريح الخاص في وقت مبكر حتى تتمكن من رؤية أي أضرار قد حدثت بسبب المناولة. للقيام بذلك ، وكتلة لمدة 1 ساعة مع جيش صرب البوسنة 200μL 2 ٪ في 1XPBS في أنبوب الطرد المركزي الجزئي. المقبل ، إضافة phalloidin 2μL واحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ثم يغسل 3X مع 1mL من 1XPBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة كل في الظلام. جبل الشرائح على النحو المعتاد. * ملاحظة : وصمة عار مشرق للغاية ونحن لا نوصي باستخدام flouramount أو ما شابه ذلك ، flourescence الحفاظ على وسائل الإعلام.
على الرغم من تحذيره من كل شيء ، RPE جبل كله ليس دقيقا بشكل رهيب ، ويمكن أن تحمل بسهولة التعامل اللازمة لأداء والتشريح ، وتلطيخ ، المناعية أو المناعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية [K22ES012264 لAJRB] وجمعية السرطان الأمريكية InstitutionalResearch غرانت [ACS - IRG - 00 - 173-04] projectaward التجريبية [لAJRB]. ونشكر أيضا أعضاء في مختبر المطران لقراءة نقدية للمخطوطة والتعليقات على الفيديو وآدم براون على وجه الخصوص ، لمثال على ما لا يجب فعله. نشكر الدكتور دونالد مكوين من Greehey سرطان الأطفال في معهد بحوث على السماح لنا استخدام نطاق له تشريح / كاميرا الفيديو الموضوعة للتصوير الفيديو تشريح. نشكر دارون براون في لشحذ الأدوات كورت وتصليح الأدوات microdissection لدينا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| straight forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4903 | tip: .08 x .04 mm material: INOX |
| 45° forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5005 | tip: .05 x.01 mm material: INOX |
| 15° "up" forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5045A | tip: .1 x.06 mm material: INOX |
| spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5604 | comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel |
| binocular dissecting microscope | Carl Zeiss, Inc. | Discovery V.8 | use reflected light source |
| phalloidin | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 |
References
- Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice. Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).
- Reliene, R. H. lavacove, Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice. Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).
- Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice. Cancer Res. 60, 395-399 (2000).
- Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion. J. Nucleic Acids. , (2010).
- Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo. Nucleic Acids Res. , Forthcoming (2010).
- Bishop, A. J. p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development. Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).
- Bodenstein, L., Sidman, R. L. Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity. Dev Biol. 121, 192-204 (1987).
- Burke, J. M. Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt? Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).
