Summary
הפגנה רשמית של דיסקציה של העין עכבר, וכתוצאה מכך הר שלם של אפיתל הפיגמנט ברשתית.
Abstract
אפיתל הפיגמנט ברשתית (הרשתית) שוכנת בחלק האחורי של העין של יונקים, ממש מתחת לרשתית עצביים, אשר מכיל את photoreceptors (מוטות קונוסים). הרשתית היא monolayer של תאים cuboidal וחבריו בשיתוף פעולה הדוק עם פיגמנט הרשתית העצבית בדיוק מעל אותה. אגודה זו הופכת את הרשתית עניין רב החוקרים ללמוד מחלות רשתית. הרשתית היא גם באתר של assay ב-vivo של תיקון הומולוגיה ביים DNA, assay בלתי p. העין עכבר קשה במיוחד לנתח בשל גודלו הקטן (כ 3.5 מ"מ קוטר) ואת הצורה הכדורית שלו. מאמר זה מדגים בפירוט הליך לנתיחה של העין וכתוצאה מכך הר שלם של הרשתית. בהליך זה, אנו מראים כיצד לעבוד עם, ולא נגד, במבנה הכדורית של העין. בקצרה, ברקמת השריר החיבור, ואת עצב הראייה יוסרו מהחלק האחורי של העין. ואז, הקרנית ואת העדשה יוסרו. בשלב הבא, חתכים אסטרטגי נעשים כי התוצאה משטחת משמעותי של הרקמה הנותרת. לבסוף, הרשתית העצבית היא הרימה בעדינות את וחשף הרשתית שלם, אשר מחוברת עדיין דמית העין הבסיס והלחמית. הר זה כל שניתן להשתמש בהם כדי לבצע את assay בלתי p או הערכה או אימונוהיסטוכימיה immunofluorescent של רקמת הרשתית.
Protocol
1. הסרה של רקמה חיצוניים מבחוץ של העין
- יוצקים 1X PBS לתוך המכסה של צלחת 35mm. הרמה צריכה להיות ממש מתחת שפת המכסה.
- בעזרת מלקחיים ישר, להעביר עין (ים) מהצינור אחסון המנה 35mm. עיניים שקועות PBS משתי סיבות: 1. הרקמות החיצוניות יהיה "לצוף" הרחק מן העין, כך שתוכל לראות ולהסיר אותם בקלות, 2. במהלך הניתוח, העין באופן טבעי לשמור על הצורה הכדורית שלו בעוד ההשעיה, ומאפשר לך לעבוד עם הצורה הזו ולא נגדה.
- שימוש בשני זוגות של מלקחיים זווית (45 ° ו 15 °), להסיר בעדינות רבה כמו שריר ורקמת חיבור ככל האפשר, מושך את רקמת נגד הזרם (כלומר לכיוון הקרנית). יש רקמת חיבור יישאר. מאמץ צריך להיעשות כדי לסחוט את גלגל העין מעט ככל האפשר.
- המסחר מלקחיים שלך 15 מעלות במשך מספריים האביב. בעוד מחזיק את העין יציב עם מלקחיים 45 °, להשתמש במספריים באביב כדי לחתוך שריר הנותרים רקמת חיבור, כמו גם את עצב הראייה. * טיפ: השתמש בקצה החיצוני של המספריים לדחוף את רקמת נגד הזרם (לכיוון לחלק corneo-scleral) ולאחר מכן לקצץ. המשך עד שכל הרקמות החיצוניות הוסר מן העין.
2. הסר את הקרנית ואת העדשה
- עם הקרנית פונה כלפי מעלה, יש להשתמש במלקחיים 45 מעלות לצבוט את קפל קטן במרכז הקרנית.
- בעזרת מספריים האביב, לעשות חתך קטן בבסיס של דש. עזוב דש.
- להחזיק את העיניים עדיין עם מלקחיים, הכנס את להב מספריים נמוך לתוך בניצב החתך ולעשות חתך לכיוון לחלק corneo-scleral. נסו לשמור על הלהב התחתונה תחת הקשתית כך גם קרנית איריס נחתכים. אין לחתוך את כל הדרך לחלק corneo-scleral. שמור מספריים מוכנס בעיניים.
- בעזרת מלקחיים שלך 45 °, בזהירות לסובב את העיניים כך מספריים שלך מקבילות לחלק corneo-scleral ולעשות חתך קטן. לאט לאט לסובב את העין ° 360, מה שהופך חתכים קטנים כל הדרך מסביב. שוב, מנסה לשמור את הלהב התחתון של המספריים האביב שלך לפי קשתית כך גם את איריס הקרנית נחתכים. הרם את איריס הקרנית רחוק משאר העין וזורקים אותם.
- הטה את העין על צידו ולחצו בעדינות על החצי האחורי של העין, מה שאילץ את העדשה החוצה. מחק את העדשה. החלק הפנימי של עיינית הנותר הוא בשורה של הרשתית העצבית, אשר צריך להיראות חלקות אטום.
3. הרובע עיינית וכתוצאה מכך, וכתוצאה מכך 4 - "עטורת פרחים", פרח דמוי מבנה
- העין צריכה להיות ממוקמת כך פתיחת עיינית היא בניצב לגוף שלך. שימוש במלקחיים 45 ° עד עיינית שלך יציב ואת המיקום.
- החזקת מספריים האביב שלך מולך אז הם ניצבים הגוף שלך, להכניס את הלהב התחתון של המספריים האביב שלך לתוך הקצה העליון של גביע לפתוח את העין. בעזרת מלקחיים שלך 45 °, בזהירות ליישר את כוס העין כך חתך בודד, ישר יכול להיות עשוי מחלקים corneo-scleral כלפי ראש עצב הראייה. כל הקיצוצים צריכה להיות בניצב לחלק corneo-scleral ו אלא אם כן צוין, צריך ללכת קרוב לראש עצב הראייה ככל האפשר מבלי לחתוך אותו.
- סיבוב 180 ° עיינית, שמירה נצבות עם הגוף שלך. השתמש בטכניקה בשלב 3.2 לעשות חתך בניצב השני.
- סובב את עיינית וחזור על הטכניקה המתוארת 3.2 לבצע שני חתכים נוספים. כל ארבעת קיצוצים צריך להיות קרוב עד 90 ° בנפרד האפשרי. יש לזכור כי העין אינה כדורית מושלמת כך יהיו כמה השתנות.
4. חותכים כל אחד מארבעת "עלי כותרת" במחצית, והתוצאה היא מבנה הפרח דמוי שמונה עלה כותרת
- מעבירים את עיינית לרבעים מצלחת 35mm לשקופית נקי. עם עיינית פונה כלפי מעלה, סקופ תחת אותה עם מלקחיים 45 מעלות. הרם בזהירות את זה של הנוזל ומניחים אותו בשקופית נקי.
- שימוש בשני זוגות של מלקחיים זוויתי, בעדינות לפתוח את העיניים, עם הרשתית העצבית פונה כלפי מעלה. אין להסיר העצבית ברשתית העין, זה עוזר לשמור על כמה צורה כדורית שלה אז אתה לא פועלים נגד זה. הוא גם מגן על הרשתית מפני נזק בטעות בהליכים הבאים.
- סובב את השקף עד שאחד עלי הכותרת הוא בניצב לגוף שלך.
- שימוש במלקחיים 15 שלך מעלות, בעדינות לתפוס את הפינה של עלי כותרת. הפינה של עלה כותרת יש הקרנית, לא הרשתית הרשתית העצבית או. הרם את בפינה בעדינות, שמאפשר לו לשמור על העקמומיות שלה.
- הכנס את הלהב התחתון של המספריים האביב שלך בין כותרת לבין שקופיות. הקו עד מספריים שלך כזה אחד, ישר, בניצב לחתוך יכול להיות עשוי מחלקים corneo-scleral כלפי ראש עצב הראייה. גזור קרוב לראש עצב הראייה כפי withou אפשרילא לחתוך אותו. עזוב עלה כותרת, המאפשר זה לשכב על השקופית.
- סובב את השקופית 90 °, כך עלה כותרת הבא הוא בניצב לגוף שלך. חזור על שלב 4.5.
- חזור על שלבים 4.5 ו 4.6 פעמיים נוספות. המבנה וכתוצאה מכך צריך להיראות כמו פרח שמונה עלה כותרת.
5. הסר את הרשתית העצבית
- פיפטה 100-200 μL של 1X PBS על הדגימה. זה ימנע את הרשתית העצבית יידבקו כפי שאתה לקלף אותו על הרשתית.
- בדרך כלל הרשתית העצבית מחובר באופן רופף על הרשתית. לעומת זאת, לקחת תרגול ומיומנות כדי להסיר רק את הרשתית העצבית ולא הרשתית. בעדינות לתפוס עלה כותרת של הרשתית העצבית עם זוג אחד מלקחיים זווית תוך ייצוב (החזקת) את שאר בעין עם זוג השני של מלקחיים זווית. משוך את הרשתית העצבית רחוק משאר של העין. המשך הליך זה עד הרשתית העצבית כולה הוסרה. * טיפ: מקל קצה מלקחיים 15 שלך · אל ראש עצב הראייה לעגן את העין. ואז להשתמש במלקחיים 45 מעלות לטאטא מתחת הרשתית העצבית והרם אותו משם. זה בדרך כלל הטובה ביותר להרים את הרשתית העצבית מהראש עצב הראייה לכיוון לחלק corneo-scleral. הקפידו להתרחק מכל שאריות רופפת של איריס. הקשתית דביק למדי, אחרת יכול להיתקע על הרשתית.
- יש לשטוף את הדגימה עם 1X PBS. פיפטה 100-200 μL של 1X PBS לתוך הדגימה ולמצוץ אותו בחזרה. בטל PBS. חזור על הצורך להסיר אבק ופסולת.
6. הר את הדגימה (ים) בשקופית
- פיפטה 80-90 μL של גליצרול 90% לשקופית חדשה צורה מלבנית. השתמש בצד של קצה פיפטה לעשות למרוח אפילו, מלבני של גליצרול. (זהו הליך פיחלץ שני הרשתית בשקופית אחת.)
- הכנס את הזרוע התחתונה של 15 ° מלקחיים תחת הדגימה. הרם בעדינות את הדגימה את השקופית הניתוחים.
- לאט לאט להוריד את הדגימה לתוך גליצרול. בעדינות לכשכש מלקחיים כמו שאתה מושך אותם מתחת הדגימה.
- חזור על שלבים 6.1-6.3 עבור הדגימה אחרים.
- סובב את השקופית כך שהצד הארוך בניצב לגוף שלך. החזק זכוכית לכסות שלך 45 ° זווית לשקופית, כך שהוא נוגע שקופיות. הזז אותו לכיוון למרוח את גליצרול עד שהם נוגעים. שמירה על קשר בין הזכוכית המכסה והחלק, לאט להזיז את זכוכית לכסות הרחק למרוח, לעבר קצה המגלשה. בשורה ארוכה של שקופיות הצדדים ואת מכסה זכוכית, כך הם מקבילים. החזק את קצוות הזכוכית המכסה בין האגודל לאצבע המורה.
- תרימי את 15 מלקחיים · ב היד השנייה. עריסת את הקצה העליון (חינם) של זכוכית המכסה בכיפוף של היד. לאט לאט, להוריד את מכסה זכוכית. כאשר הקשר הוא בין הזכוכית המכסה את גליצרול, לעצור ולחכות גליצרול כדי להגר. חזור על הפחתת ומחכה עד mounts כל הרשתית מכוסים במלואם. זה כדי למנוע את גליצרול צמיגה מאוד ללכוד בועות אוויר. אל תלחץ על COVERGLASS - גליצרול יהיה לסחוט אותו מתחת, מה שהופך הידבקות עניים מאוד.
- ברור עם לק, צבע מסביב למתחם שבו הזכוכית המכסה והחלק להיפגש.
- הנח את השקף על גבי מדף ריק לייבוש.
7. נציג תוצאות:
התוצאה של הליך זה יש מבנה שנראה כמו פרח צריך להיות סימטרי למדי.
באיור 1. שלמות הרשתית הר מן העכבר wildtype C67Bl/6J. הרשתית משחור או חיות agouti צריך להיות חום כהה בצבע צריך משטח חלק. זה נורמלי לשים לב הגליות בתוך הטופוגרפיה של עלי הכותרת. פיגמנטציה על כל דגימה לתת יכול להיות משתנה במקצת, עקב צפיפות משתנה של פיגמנטציה של הרשתית והן דמית העין הבסיסית. חיצים הצבע הלבן "ערוצי" hypopigmented - זה נורמלי נובע vasculature הבסיסית של העין. החץ הכחול מצביע על נזק פיזי הרשתית והן דמית העין הבסיסית.
איור 2. שלמות הרשתית הר מן העכבר לדלל. דוגמאות שנקטפו מן החי ניתן לדלל טווח צבע כמעט שקוף לבית קפה בחלב וכל דגימה אחת היא רוצה השתנות בתוך זה, המצוין עיגולים שחורים כאן. באופן כללי, הרשתית שנקטפו מן החי הצעיר קלים אלה שנקטפו מן החי הם ישנים יותר כהה. החצים מצביעים שחור חלק vasculature הבסיסי, המופיע hypopigmented.
איור 3. מכתים Phalloidin יכול לשמש כדי לזהות נזק פיזי הרשתית. מכתים Phalloidin בבירור מתאר את קרום התא, מראה את צורת משושה של האפיתל. (א) דוגמה של עכבר שחור. (ב) דוגמה מתוך עכבר לדלל.
איור 4. הרשתית גזור גרוע מכל עכבר לדלל. (א) בסוגריים מצביעים בשולי הקרנית כי הם רחבים מדי, דבר שיכול לגרום קריסה ו / או קיפול. בתוך העיגול השחור אתה יכול לראות כמויות עודפות של רקמות זרים שלא הוסרו מהחלק האחורי של העין. הם בולטים במיוחד כי המדגם הוא מבעל חיים לדלל. עלה כותרת בצד שמאל למטה הוא מקופל חלקית מעל. (ב) זה הר כולו מראה של שבשבת. החצים מצביעים שחור חלק הקיצוצים שנעשו. רבים חתכים לחלק corneo-scleral כלפי ראש עצב הראייה אינם בקנה אחד עם קוטר. (ג) חיצים שחורים לציין כיצד הקיצוץ צריך להיות עשוי, בהתאם לקוטר ו בניצב המשיק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הרשתית היא אתר של האו"ם p assay, ב assay-vivo של תיקון הומולוגיה מכוונת. Assay בלתי p נעשה שימוש כדי לחקור את ההשפעות של נזקי דנ"א שונה 1,2 ו נזק לדנ"א איתות גנים לתקן 3,4,5 על תדר של תיקון, הומולוגיה מכוונת. Assay זה רגיש במיוחד, גילוי תא בודד אירועים על הרשתית 1. היא יכולה גם לזהות הבדלים העיתוי של הומולוגיה מכוונת אירועים לתקן במהלך הפיתוח 6. העין Murine מפתחת רדיאלית החוצה מתוך עצב הראייה 7 ולכן, את המרחק היחסי של אירועים מן הראש עצב הראייה בקורלציה לזמן בהתפתחות שבו הם התרחשו.
הרשתית היא גם לעניין את אלו שלומדים רשתית או התפתחות מחלות רשתית. למרות שתאי הרשתית יכול להיות מתורבת, קיימות מגבלות משמעותיות כדי לעשות זאת. למבוגרים בתאי הרשתית הם שלאחר mitotic 7 וכצפוי לא להתרבות גם במבחנה. יתר על כן, אלה תרבויות לעשות לגדול להראות שינויים רבים, כולל אך לא רק, שינויים בפיגמנטציה, מורפולוגיה, וצמתים תא 8 - כמה מן המאפיינים כי הם מוקד של חקירה מדעית. לכן, הכנה של הר שלמה של הרשתית היא טכניקה רלוונטי במחקרים vivo של התפתחות מחלות של העין.
Dissection של רקמה זו היא קטנה מאוד מסובך בהתחלה. חשוב להיות רגוע ולשמור על יציבה נכונה מיצוב כפי שמוצג במאמר זה וידאו. אם כל הר הרשתית נראה כמו שבשבת, זה בגלל הקיצוצים ארוכה לא נעשו בהתאם לקוטר, כלומר לא בניצב המשיק. זה הסיכוי הטוב ביותר מתרחשות כאשר מספריים לא מתקיימים מול ו בניצב מהגוף. המראה המשונן של חתכים ארוכים סביר בשל נסיגה קלה של להבי מספריים בין חתכים.
מראה מחוספס או מחוספס על פני השטח הרשתית אינו נורמלי יכול להיות בשל נזק שנגרם על ידי טיפול אגרסיבי של הדגימה. נזק ניתן לאמת באמצעות מכתים phalloidin. כתמים לבנים או נקה חורים הרשתית לבין דמית העין הבסיסית, נגרם גם על ידי טיפול או לנקב מחוספס.
אם הרשתית נראה מחוספס אטום, זה כנראה בגלל שאריות של הרשתית העצבית. זה יכול להתרחש אם העיניים מתחת או מעל קבועים (פחות מ 2 שעות, יותר מ -4 שעות PFA 4%). זו עלולה להתרחש גם בעיני קבוע כראוי, כי כבר בשנת אחסון לתקופה מוגזמת של זמן (> 6 חודשים). טיפול Dispase ניתן להשתמש כדי להסיר שאריות כאלה, אבל גם יכול לגרום הרשתית כדי להתפרק.
גילוי נזק פיזי הרשתית היא קשה מאוד דגימות לדלל או לבקנים. אנו ממליצים להשתמש מכתים phalloidin על והניתוחים המוקדמים שלך, כך שאתה יכול לראות כל נזק, אשר ייתכן שאירעו עקב הטיפול. כדי לעשות זאת, לחסום שעה 1 עם BSA 200μL 2% 1XPBS בתוך שפופרת מיקרו צנטריפוגות. לאחר מכן, להוסיף phalloidin 2μL ו דגירה בחושך בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר מכן לשטוף עם 3x 1mL של 1XPBS במשך 30 דקות כל אחד על טמפ החדר בחושך. הר שקופיות כרגיל. * הערה: כתם בהיר מאוד ואנחנו לא ממליצים להשתמש flouramount או דומה flourescence-שמירה התקשורת.
למרות כל אזהרה, הרשתית כל הר הוא לא עדין מאוד והוא יכול בקלות לעמוד בטיפול צורך לבצע נתיחה, מכתים, אימונוהיסטוכימיה, או immunofluorescence.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה [K22ES012264 כדי AJRB] ו אמריקאי האגודה למלחמה בסרטן InstitutionalResearch גרנט [ACS-IRG-00-173-04] טייס projectaward [אל AJRB]. אנו מודים גם אנשי המעבדה הבישוף לקריאה ביקורתית של כתב היד והערות על וידאו ואדם בראון בפרט, למשל של מה לא לעשות. אנו מודים ד"ר דונלד מקיואן לחקר הסרטן Greehey ילדים המכון מאפשר לנו להשתמש היקף הניתוחים שלו / וידאו מצלמה הגדרת לצילום הווידאו לנתיחה. אנו מודים Daron בראון מכשירים Corte עבור חידוד ותיקון של כלי microdissection שלנו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| straight forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4903 | tip: .08 x .04 mm material: INOX |
| 45° forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5005 | tip: .05 x.01 mm material: INOX |
| 15° "up" forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5045A | tip: .1 x.06 mm material: INOX |
| spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5604 | comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel |
| binocular dissecting microscope | Carl Zeiss, Inc. | Discovery V.8 | use reflected light source |
| phalloidin | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 |
References
- Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice. Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).
- Reliene, R. H. lavacove, Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice. Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).
- Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice. Cancer Res. 60, 395-399 (2000).
- Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion. J. Nucleic Acids. , (2010).
- Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo. Nucleic Acids Res. , Forthcoming (2010).
- Bishop, A. J. p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development. Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).
- Bodenstein, L., Sidman, R. L. Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity. Dev Biol. 121, 192-204 (1987).
- Burke, J. M. Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt? Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).
