Summary
Eine formale Demonstration der Zerlegung einer Maus Auge, was zu einem ganzen Berg der retinalen Pigmentepithels.
Abstract
Das retinale Pigmentepithel (RPE) liegt an der Rückseite des Säugetier-Auge, gerade unter der neuralen Netzhaut, die Photorezeptoren (Stäbchen und Zapfen) enthält. Das RPE ist eine Monoschicht von pigmentierten kubischen Zellen und Mitarbeiter eng mit der neuronalen Retina knapp darüber. Dieser Verein macht die RPE von großem Interesse für Forscher untersuchen Netzhauterkrankungen. Das RPE ist auch der Ort einer in vivo-Assay von Homologie-directed DNA-Reparatur, die p un-Assay. Die Maus Auge ist besonders schwer zu sezieren aufgrund seiner geringen Größe (ca. 3,5 mm im Durchmesser) und seine Kugelform. Dieser Artikel zeigt im Detail ein Verfahren für die Präparation des Auges führt einen ganzen Berg der RPE. In diesem Verfahren zeigen wir, wie man mit und nicht gegen die kugelförmige Struktur des Auges zu arbeiten. Kurz gesagt, sind das Bindegewebe, Muskeln und Sehnerv aus dem hinteren Teil des Auges entfernt. Dann werden die Hornhaut und die Linse entfernt. Als nächstes sind strategische Schnitte, die zu erheblichen Abflachung der übrigen Gewebe. Schließlich ist der neuronalen Retina vorsichtig abgehoben, enthüllt eine intakte RPE, die noch auf die zugrunde liegende Ader-und Lederhaut befestigt wird. Das ganze Berg kann die p un-Assay oder für die Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz Beurteilung des RPE Gewebe durchzuführen.
Protocol
1. Entfernen Fremdwasser Gewebe von der Außenseite des Auges
- Gießen 1X PBS in den Deckel eines 35-mm-Schale. Das Niveau sollte knapp unterhalb der Lippe des Deckels werden.
- Mit geraden Zangen, Transfer Auge (n) aus der Lagerung Rohr auf die 35mm Gericht. 1: Die Augen sind in PBS aus zwei Gründen unter Wasser. Der fremde Gewebe wird "float" vom Auge weg, so dass Sie sehen können, und entfernen Sie sie einfach, und 2. Während Dissektion, wird das Auge natürlich pflegen ihre Kugelform, während in der Schwebe, so dass Sie mit dieser Form eher als Arbeit gegen sie.
- Mit beiden Paare von abgewinkelten Pinzette (45 ° und 15 °), sanft wie viel Muskel-und Bindegewebe wie möglich zu entfernen, ziehen das Gewebe gegen den Strich (also in Richtung der Hornhaut). Einige Bindegewebe bleibt. Dabei sollte nach den Augapfel so wenig wie möglich unter Druck zu setzen.
- Handeln Sie Ihre 15 ° Zange für das Frühjahr Schere. Halten Sie das Auge ständig mit 45 ° Zange, mit der Feder Schere wegschneiden verbleibenden Muskel-und Bindegewebe sowie den Sehnerv. * Tipp: Verwenden Sie den äußeren Rand der Schere, um das Gewebe gegen den Strich schieben (in Richtung der Hornhaut-Sklera-teilen) und dann zu trimmen. Fort, bis alle fremden Gewebe aus dem Auge entfernt worden.
2. Entfernen Sie die Hornhaut und Linse
- Mit der Hornhaut nach oben, die 45 ° Zange kneifen eine kleine Falte in der Mitte der Hornhaut.
- Mit dem Frühling Schere, einen kleinen Schnitt an der Basis der Klappe. Lassen Sie die Klappe.
- Halten Sie die Augen noch mit einer Pinzette, legen Sie die untere Scherenblatt in und senkrecht zur Schnitt-und einen Schnitt in Richtung der Corneo-Sklera teilen. Versuchen Sie, Ihre Untermesser unter der Iris zu halten, damit sowohl die Hornhaut und Iris geschnitten werden. Schneiden Sie nicht den ganzen Weg auf die Hornhaut-Sklera-teilen. Halten einer Schere in das Auge eingesetzt.
- Mit Ihren 45 ° Pinzette vorsichtig drehen das Auge, so dass die Schere parallel zur Hornhaut-Sklera trennen sind und machen einen kleinen Schnitt. Drehen Sie langsam den Blick um 360 °, so dass kleine Schnitte rundum. Auch hier versuchen, die untere Klinge Ihrer Feder Schere unter der Iris zu halten, damit sowohl die Iris und Hornhaut geschnitten werden. Heben Sie die Iris und Hornhaut weg vom Rest des Auges und werfen Sie sie weg.
- Kippen Sie das Auge auf die Seite und drücken Sie sanft auf der hinteren Hälfte des Auges, wodurch der Linse aus. Entsorgen Sie das Objektiv. Das Innere des verbleibenden Augenmuschel ist durch das neuronale Netzhaut, die glatt und undurchsichtig sollten ausgekleidet.
3. Quarter die daraus resultierenden Augenmuschel, was zu einem 4 - "petaled" Blume-ähnliche Struktur
- Das Auge soll so positioniert, dass die Öffnung der Augenmuschel senkrecht auf den Körper sein. Verwenden Sie Ihre 45 ° Zange zu stabilisieren und die Position der Augenmuschel.
- Halten Sie Ihre Feder Schere vor Ihnen, so dass sie senkrecht stehen, um Ihren Körper, legen Sie die untere Klinge Ihrer Feder Schere in die obere Kante der offenen Augenmuschel. Mit Ihren 45 ° Zange, richten Sie die Augenmuschel, so dass einem einzigen geraden Schnitt aus der Corneo-Sklera-Kluft in Richtung des Sehnervenkopfes gemacht werden kann. Alle Schnitte sollten senkrecht zur Hornhaut-Sklera-teilen und sofern nicht anders angegeben, gehen sollte möglichst nahe an den Sehnervenkopf wie möglich, ohne Schneiden hinein.
- Drehen Sie die Augenmuschel 180 ° unter Beibehaltung der Rechtwinkligkeit mit Ihrem Körper. Verwenden Technik in Schritt 3.2 eine zweite senkrecht Schnitt zu machen.
- Drehen Sie das Okular und wiederholen Sie die Technik in 3.2 beschrieben, zwei weitere Schnitte zu machen. Alle vier Schnitte sollten möglichst nahe an 90 ° auseinander wie möglich. Beachten Sie, dass das Auge nicht perfekt sphärische so gibt es eine gewisse Variabilität werden.
4. Cut jede der vier "Laschen" in zwei Hälften, die sich in einem Acht-Blütenblatt Blüte-Struktur
- Übertragen Sie die geviertelt Augenmuschel aus dem 35-mm-Schale auf einen sauberen Objektträger. Mit der Augenmuschel nach oben, darunter Kugel mit dem 45 ° Zange. Heben Sie ihn aus der Flüssigkeit und legen Sie es auf einen sauberen Objektträger.
- Mit beiden Paare von abgewinkelten Pinzette vorsichtig öffnen sich die Augen, mit der neuronalen Netzhaut nach oben zeigt. AUF KEINEN FALL DIE neuralen Retina-es hilft dem Auge zu halten einige seiner Kugelform, so dass Sie nicht berufstätig sind dagegen. Es schützt auch die RPE entfernt, versehentlich in den folgenden Verfahren beschädigt.
- Drehen Sie das Bild, bis eines der Blütenblätter steht senkrecht auf den Körper.
- Verwenden Sie Ihre 15 ° Pinzette vorsichtig greifen die Ecke des Blütenblatt. Die Ecke des Blütenblatt sollte Hornhaut, nicht neuronalen Netzhaut oder RPE. Heben Sie die Ecke vorsichtig, so dass sie ihre Krümmung zu behalten.
- Setzen Sie den unteren Klinge Ihrer Feder Schere zwischen dem Blütenblatt und der Folie. Richten Sie Ihr Schere, so dass eine einzelne, gerade, rechtwinklig geschnitten aus der Hornhaut-Sklera-Kluft in Richtung des Sehnervenkopfes gemacht werden kann. Cut möglichst nahe an den Sehnervenkopf wie möglich without Schneiden hinein. Lassen Sie das Blütenblatt, so dass sie auf der Folie liegen.
- Drehen Sie die Folie 90 °, so dass die nächste Blütenblatt senkrecht auf Ihren Körper. Wiederholen Sie Schritt 4.5.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.5 und 4.6 noch zweimal. Die resultierende Struktur sollte wie ein Acht-Blütenblatt Blüte aussehen.
5. Entfernen Sie die neuralen Netzhaut
- Pipette 100-200 ul 1X PBS auf die Probe. Dies wird die neuronale Netzhaut klebt, wie Sie diese abziehen des RPE zu verhindern.
- Typischerweise werden die neuronalen Netzhaut ist lose mit dem RPE befestigt. Allerdings dauert es, Übung und Geschick, um nur die neuralen Netzhaut und nicht der RPE zu entfernen. Fassen Sie ein Blütenblatt der neuronalen Netzhaut mit einem Paar abgewinkelte Pinzette und stabilisiert (gedrückt halten) den Rest des Auges mit dem anderen Paar abgewinkelte Pinzette. Ziehen Sie die neuralen Netzhaut weg vom Rest des Auges. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das gesamte neuronale Netzhaut entfernt worden ist. * Tipp: Kleben Sie die Spitze des 15 ° Zange in den Sehnervenkopf für das Auge zu verankern. Dann nutzen Sie die 45 ° Pinzette aufkehren unter der neuronalen Netzhaut und heben Sie sie ab und weg. Es ist normalerweise am besten, die neuronalen Netzhaut von der Sehnerv Kopf in Richtung der Corneo-Sklera-teilen zu heben. Achten Sie darauf, wegzuziehen alle losen Reste der Iris. Die Iris ist ganz klebrig und kann ansonsten auf die RPE stecken.
- Spülen Sie die Probe mit 1X PBS. Pipette 100-200 ul 1X PBS in die Probe und saugen ihn wieder aufzubauen. Entsorgen Sie die PBS. Bei Bedarf wiederholen, um Staub und Schmutz zu entfernen.
6. Montieren Sie Probe (n) auf einer Folie
- Pipette 80-90 ul von 90% Glycerin auf eine neue Folie in eine rechteckige Form. Verwenden Sie die Seite der Pipettenspitze, um eine gleichmäßige, rechteckige Abstrich von Glycerin zu machen. (Dies ist das Verfahren für die Montage von zwei RPE auf einer Folie.)
- Setzen Sie den unteren Arm von 15 ° Zange unter der Probe. Heben Sie die Probe aus dem Sezieren gleiten.
- Langsam senken die Probe in das Glycerin. Sanft wiggle der Zange, wie Sie sie herausziehen unter der Probe.
- Wiederholen Sie die Schritte 6,1-6,3 für die anderen Proben.
- Drehen Sie die Folie, so dass die lange Seite senkrecht auf Ihren Körper. Halten Sie Ihr Deckglas in einem 45 ° Winkel auf die Folie, so dass es zu berühren ist die Folie. Move it auf die Glycerin-Abstrich, bis sie sich berühren. Aufrechterhaltung des Kontakts zwischen dem Deckglas und Objektträger, langsam das Deckglas entfernt von der Abstrich, auf den Rand der Folie. Line up den langen Seiten des Schlittens und das Deckglas, so dass sie parallel sind. Halten Sie die Ecken des Deckglases zwischen Daumen und Zeigefinger.
- Nehmen Sie den 15 ° Zange in der anderen Hand. Cradle der oberen (kostenlos) Rand des Deckglases in die Armbeuge. Sehr langsam, senken Sie die Abdeckung aus Glas. Wenn der Kontakt zwischen dem Deckglas und Glycerin gemacht wird, zu stoppen und warten auf die Glycerin zu migrieren. Wiederholen Sie diesen Senken und warten, bis die RPE ganzen mounts vollständig abgedeckt werden. Dies ist die hochviskose Glycerin aus der Aufnahme von Luftblasen zu verhindern. NICHT drücken Sie auf dem Deckglas - das Glycerin wird Squeeze-out unter ihm, was Haftung sehr schlecht.
- Mit klaren Nagellack, Farbe rund um den Perimeter, wo das Deckglas und Objektträger zu erfüllen.
- Legen Sie die Folie auf der Oberseite eines leeren Rack, um zu trocknen.
7. Repräsentative Ergebnisse:
Das Ergebnis dieser Prozedur sollte eine Struktur, die wie eine Blume aussieht und sollte recht symmetrisch sein.
Abbildung 1. Whole mount RPE von einem Wildtyp C67Bl/6J Maus. RPE aus schwarzem oder agouti Tiere sollten von dunkelbrauner Farbe und sollte eine glatte Oberfläche haben. Es ist normal, Wellen in der Topographie der Blütenblätter kündigen. Die Pigmentierung auf jedem geben Proben können etwas variable, durch variable Dichte der Pigmentierung sowohl der RPE und der darunter liegenden Aderhaut. Weiße Pfeile zeigen auf hypopigmentierte "Kanäle" - das ist normal und ist aufgrund der zugrunde liegenden Gefäßsystem des Auges. Blauer Pfeil zeigt auf physische Schäden am RPE und der zugrunde liegenden Aderhaut.
Abbildung 2. Whole mount RPE aus einer verdünnten Maus. Proben aus verdünnter Tieren geerntet werden in der Farbe von fast transparent zu Café au lait und in jeder ein Exemplar ist wie die Variabilität in sich haben, angegeben in schwarzen Kreisen hier. Im Allgemeinen sind RPE von jüngeren Tieren geerntet leichter und die von älteren Tieren geerntet werden dunkler. Schwarze Pfeile zeigen einige der zugrunde liegenden Blutgefäßen, die hypopigmentierte erscheint.
Abbildung 3. Phalloidin-Färbung kann verwendet werden, um körperliche Schäden an der RPE erkannt werden. Phalloidin-Färbung deutlich die Zellmembranen, zeigt die sechseckige Form des Epithels. (A) Beispiel aus einem schwarzen Maus. (B) Beispiel aus einer verdünnten Maus.
Abbildung 4. Ein schlecht präpariert RPE aus einer verdünnten Maus. (A) Werte in Klammern zeigen die Margen der Hornhaut, die zu breit sind, die dazu führen Knicken und / oder Falten können. Innerhalb der schwarzen Kreis sieht man große Mengen von Fremdstoffen Gewebe, das nicht aus dem hinteren Teil des Auges entfernt worden sind. Sie sind besonders offensichtlich, da die Probe aus einer verdünnten Tier. Das Blütenblatt in der linken unteren teilweise umgeschlagen. (B) Das ganze Berg sieht aus wie ein Windrad. Schwarze Pfeile zeigen einige der Einschnitte, die gemacht wurden. Viele der Kürzungen aus der Hornhaut-Sklera-Kluft in Richtung des Sehnervs sind nicht im Einklang mit dem Durchmesser. (C) Schwarze Pfeile zeigen an, wie die Kürzungen hätte erfolgen müssen, in Einklang mit dem Durchmesser und senkrecht zur Tangente.
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Discussion
Das RPE ist die Website des p un-Assay, einem In-vivo-Assay von Homologie-directed reparieren. Die p un-Assay wurde verwendet, um die Auswirkungen der verschiedenen DNA-Schäden 1,2 und DNA-Schäden Signal-und Reparatur-Gene 3,4,5 über die Häufigkeit von Homologie-directed Reparatur zu studieren. Dieser Test ist sehr empfindlich, Aufdeckung Single-Cell-Veranstaltungen auf der RPE 1. Es kann auch erkennen, Unterschiede im Timing der Homologie-directed Reparatur Ereignisse während Entwicklung 6. Die murine Auge entwickelt radial nach außen von den Sehnerv 7 und damit korreliert die relative Distanz der Ereignisse aus dem Sehnervenkopf, um die Zeit in der Entwicklung, in der sie aufgetreten sind.
Das RPE ist auch von Interesse für diejenigen, die retinalen Entwicklung oder Netzhauterkrankungen zu studieren. Obwohl RPE-Zellen kultiviert werden, gibt es erhebliche Einschränkungen dabei. Adult RPE-Zellen sind post-mitotischen 7 und vorhersehbar nicht vermehren und in vitro. Darüber hinaus zeigen die Kulturen, die nicht wachsen viele Veränderungen, einschließlich, aber nicht zu Veränderungen in der Pigmentierung, Morphologie und Zellkontakte 8 begrenzt - einige der Merkmale, die im Mittelpunkt der wissenschaftlichen Untersuchung sind. Daher ist die Vorbereitung einer ganzen Berg der RPE eine entsprechende Technik zur in-vivo-Studien der Entwicklung und Erkrankungen des Auges.
Dissection dieser kleinen Gewebe ist sehr schwierig am Anfang. Es ist wichtig, entspannt zu sein und pflegen die richtige Haltung und Positionierung als in diesem Video Artikel dargestellt. Wenn eine ganze Berg RPE sieht aus wie ein Windrad, ist dies, weil die lange Schnitte waren nicht im Einklang mit dem Durchmesser, also nicht senkrecht zu einer Tangente gemacht. Dies ist am wahrscheinlichsten auftreten, wenn die Schere nicht vor gehalten und senkrecht vom Körper weg. Eine zerklüftete Aussehen der langen Schnitte ist wahrscheinlich auf eine leichte Rücknahme der Scherenblätter zwischen den Schnitten.
Eine grobe oder robuste Aussehen des RPE Oberfläche ist nicht normal und könnte darauf zurückzuführen sein, um Schäden durch unsachgemäße Handhabung der Probe verursacht. Schaden kann überprüft mittels Phalloidin-Färbung werden. Weiße oder klare Stellen sind Löcher in den RPE und der darunter liegenden Aderhaut, auch durch unsachgemäße Handhabung oder Punktion verursacht.
Wenn die RPE erscheint rauh und undurchsichtig, ist dies vermutlich auf Reste der neuronalen Netzhaut. Dies kann auftreten, wenn die Augen unter-oder über-fixed (weniger als 2 Stunden, mehr als 4 Stunden in 4% PFA) sind. Dies kann auch in richtig befestigt Augen, die im Speicher für eine übermäßige Zeit (> 6 Monate) wurden auftreten. Dispase Behandlung kann verwendet werden, um diese Reste zu entfernen, sondern kann auch dazu führen, das RPE zu brechen.
Erfassen von physikalischen Schäden an der RPE ist sehr schwierig, in verdünnter oder Albino-Exemplare. Wir empfehlen die Verwendung Phalloidin-Färbung auf Ihrer frühen Dissektionen, so dass Sie alle Schäden, die durch die Handhabung entstanden sein könnten sehen können. Um dies zu tun, für 1 Stunde Block mit 200 ul 2% BSA in 1XPBS in einer Mikro-Zentrifugenröhrchen. Als Nächstes fügen 2μL Phalloidin und inkubieren im Dunkeln bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Dann abwaschen mit 1ml von 1XPBS 3x für jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Berg Folien wie gewohnt. * Hinweis: der Fleck ist sehr hell, und wir raten davon ab, flouramount oder ähnliche Fluoreszenz-Erhaltung Medien.
Trotz aller warnen, ist eine ganze Berg RPE nicht sehr empfindlich und kann leicht überstehen die Behandlung notwendig, Präparation, Färbung, Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz durchführen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Institute of Environmental Health Sciences unterstützt [K22ES012264 zu AJRB] und einem American Cancer Society InstitutionalResearch Grant [ACS-IRG-00-173 bis 04] Pilot projectaward [zum AJRB]. Wir danken auch Mitglieder der Bishop-Labor für die kritische Durchsicht des Manuskripts und Kommentare auf der Video-und Adam Brown insbesondere für das Beispiel von dem, was nicht zu tun. Wir danken Dr. Donald McEwen von Greehey Kinder-Krebs-Forschung für die Erlaubnis der Verwendung seiner Binokular / Video-Kamera Set-up für die Dreharbeiten der Dissektion Video. Wir bedanken uns bei Daron Brown in Corte Instruments zum Schärfen und Reparatur unserer Mikrodissektion Werkzeuge.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| straight forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4903 | tip: .08 x .04 mm material: INOX |
| 45° forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5005 | tip: .05 x.01 mm material: INOX |
| 15° "up" forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5045A | tip: .1 x.06 mm material: INOX |
| spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5604 | comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel |
| binocular dissecting microscope | Carl Zeiss, Inc. | Discovery V.8 | use reflected light source |
| phalloidin | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 |
References
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