Bioengineering

דחיית רקע הקרינה תהודה ו microspectroscopy ראמאן ספונטנית

Published: May 18, 2011 doi: 10.3791/2592

Zachary J. Smith*¹, Florian Knorr*¹, Cynthia V. Pagba¹, Sebastian Wachsmann-Hogiu^1,2

¹Center for Biophotonics Science and Technology, University of California, Davis, ²Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of California, Davis

* These authors contributed equally

Summary

אנחנו דנים הקמה ותפעול של מערכת מורכבת אופטית לא לינארית המשתמשת מיתוג מהירים כל אופטי לבודד ראמאן אותות הקרינה. באמצעות מערכת זו אנו מסוגלים להפריד בהצלחה אותות רמן הקרינה ניצול אנרגיות וכוחות הדופק הממוצע להישאר בטוחים מבחינה ביולוגית.

Abstract

ספקטרוסקופיית ראמאן היא סובלת לעתים קרובות על ידי רקע פלורסנט חזקה, במיוחד עבור דגימות ביולוגיות. אם המדגם הוא נרגש עם רכבת של פולסים מהירים, מערכת שיכולה temporally נפרד spectrally חופפים אותות על picosecond זמנים יכולים לבודד מיד מגיע אור מפוזר ראמאן מן האור המגיע מאוחר פלואורסצנטי. כאן אנו דנים, הקמה ותפעול של מערכת מורכבת אופטית לא לינארית העושה שימוש כל אופטי מיתוג בצורה של צריכת חשמל נמוכה אופטי קר השער לבודד את האותות רמן פלואורסצנטי. לייזר יחיד 808 ננומטר עם 2.4 וואט בממוצע ו 80 חזרות בקצב MHz מפוצלת, עם mW כ 200 של אור 808 ננומטר להיות מומר 5 mW <אור 404 ננומטר נשלח המדגם לרגש פיזור ראמאן. הנותרים unconverted אור 808 ננומטר לאחר מכן נשלחת בינוני קוי בו מעשים כמו משאבת עבור תריס כל אופטי. תריס נפתח ונסגר ב fs 800 עם יעילות שיא של כ -5%. באמצעות מערכת זו אנו מסוגלים להפריד בהצלחה אותות רמן הקרינה על שיעור 80 MHz החזרה באמצעות אנרגיות וכוחות הדופק הממוצע להישאר בטוחים מבחינה ביולוגית. כיוון שהמערכת אין לקיבולת במונחים של כוח אופטי, אנחנו מספר שיקולים פרט לעיצוב ויישור המסייעים למקסם את התפוקה של המערכת. כמו כן, אנו דנים פרוטוקול שלנו להשגת חפיפה במרחב ובזמן של האות וקורות המשאבה בתוך המדיום קר, כמו גם פרוטוקול מפורט לרכישת ספקטרלי. לבסוף, אנו דו"ח תוצאות נציג כמה ספקטרום ראמאן שהושג בנוכחות הקרינה חזקה באמצעות מערכת זמן gating שלנו.

Protocol

1. הטיפול חייב להילקח חלק בהכנת והנחת מדגם ראמאן בתוך המערכת הזאת.

כיוון שהמערכת בדרך כלל עושה שימוש מאוד גבוה מטרות הצמצם המספרי עם מרחקים עבודה קצר מאוד, דגימות ממוקמים על coverslip. דגימות ביולוגיות מונחות בדרך כלל על coverslip 1 עובי מספר רכוב בתא תא Attofluor (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה).
דגימות נוזלי, במיוחד אלה רעילים לבני אדם, ממוקמות בתוך בקבוק זכוכית קטן עם coverslip ביצרו לפתיחת באמצעות אפוקסי סיליקון. הבקבוק הוא הפוך אז למדידה.
מכיוון שהמערכת שלנו תלויה בתזמון מדויק של המשאבה וקטניות האות, אנחנו מוגבלים לא להשתמש הסתגלות להתמקד קונבנציונאלי של המיקרוסקופ שלנו, המתרגמת את המטרה למעלה ולמטה. זה מוסיף גורע נתיב אופטי מהמערכת שלנו. במקום זאת, אנו מקום דגימות שלנו על הבמה המשנית רכוב על גבי הבמה מיקרוסקופ כי יש להתמקד שליטה עצמאית משלו.

2. על מנת לקחת זמן מגודרת ספקטרום ראמאן, הקורה עירור צריכים להיות מוכנים כראוי.

אנחנו מתחילים עם האור העולה מתוך 2.4 W מתכונן פעמו טי: Sapph לייזר (Chameleon, מערכות קוהרנטית, סנטה קלרה, קליפורניה). כל הדופק הרכבת 80 הדופק MHz יש 30 NJ של אנרגיה, יש רוחב הזמני של fs 140, ויש לו מגוון מרוכז ב 808 ננומטר עם רוחב פס רפאים של ~ 6 ננומטר.
כדי למנוע חזרה מ-השתקפויות מחדש את חלל הכניסה הלייזר, האור עובר דרך המבודד פאראדיי. צלחת חצי גל להציב לפני המבודד פאראדיי מאפשרת כוונון רציף מכלל כוח שנשלח לתוך המערכת.
כי 6 ננומטר הוא רחב מדי רוחב פס כדי לפתור מצבים ראמאן ביותר, קרן נשלחת דרך פילטר (0.8 ננומטר FWHM, אנדובר Corporation, סאלם, NH) צר מאוד bandpass מרוכז ב 808 ננומטר.
האור ממוקדת מכן על ידי כפיל אכרומטי (f = 100 מ"מ) על borate β-בריום 5 מ"מ (BBO) קריסטל (CASIX, פוז 'ו, Fujian, סין יח"צ) לקצץ בחצי את אורך הגל של nm 808-404 ננומטר. גביש BBO ממוקם הר עם פקדי קצה ו להטות, ועלה גם על הבמה תרגום. כדי למקסם את יעילות ההמרה גל, גביש חייבים להיות ממוקמים בדיוק סימטרי על הפוקוס של כפיל, ועם ציר קריסטל שלה מיושר הקיטוב של הקרן הנכנסת.
בגלל יעילות ההמרה של אורך הגל הוא תלויי קיטוב, שליטה על כמות האור נשלח המדגם ניתן להשיג על ידי הנחת צלחת חצי שנייה אחרי גל המבודד פאראדיי. על ידי החלפה זו waveplate, עוצמת האור נשלח המדגם יכול להיות מותאם באופן בלתי תלוי בעוצמת נשלח הקורה משאבה (שיידונו להלן).
גל המרה האור הוא recollimated ידי כפיל אכרומטי השני (f = 500 מ"מ) נבחר כך הקורה היציאה הוא גדול מספיק כדי למלא את הצמצם חזרה המטרה מיקרוסקופ, וביים לתוך מיקרוסקופ הפוכה (IX-71, אולימפוס, מרכז עמק, PA) באמצעות שתי מראות ההיגוי.
מטרת מיקרוסקופ, להיות אלמנט אופטי שוכן בתוך רכיב מונוליטי ביותר של המערכת, מגדיר את ציר הראייה. כדי ליישר את הקורה עירור על הציר הזה, מראה ממוקם המטוס מדגם של המיקרוסקופ. שתי מראות ההיגוי הם אז מכוון iteratively תוך שמירה על גב משתקף קרן לייזר על מצלמת CCD-ERA (μEye, IDS, Obersulm, גרמניה) המחובר ליציאה הדמיה של המיקרוסקופ. בהנחה התמונה על המצלמה מתמקדת מיקרוסקופ שדה של נוף, הקורה על ציר כאשר את המקום מוקד מרוכז על השבב מיקרוסקופ ותרגום המטרה לאורך ציר Z-אינו משנה את נקודת המרכז הקורה ממוקד.
כאשר דגימת ממוקם המטוס מדגם מוקרן עם פיזור אור לייזר ראמאן מתרחשת. מסנן dichroic הניח מתחת למיקרוסקופ המטרה מפריד את אורך הגל, העביר אור מפוזר ראמאן (ו פלואורסצנטי) מן הקורה עירור, לכוון את אור מפוזר ראמאן לנמל בצד של המיקרוסקופ. המיקרוסקופ שונה כדי להסיר עדשות בתוך הנתיב הזה, כך עולה מן האור האות המיקרוסקופ collimated.
מכיוון קרן אות העולה מתוך המיקרוסקופ הוא גדול יותר מאשר הצמצם ברורה של מקטבים Glan-תומפסון, טלסקופ 0.47x בנוי משני כפילויות אכרומטי (F1 = 75 מ"מ, F2 = 35 מ"מ) משמש כדי לכווץ את הקורה.
אור מקוטב האות מכן על ידי מקטב Glan-תומפסון בכיוון ב 0 ° ביחס אנכי בתוך מסגרת במעבדה, וניהל למראה dichroic שבו הוא recombined עם קרן המשאבה.

3. על מנת השער האופטי כדי לפעול ביעילות שיא, יש להקפיד בהכנת הקורה משאבה (קר קרן) וכן.

הדופק המשאבה מוגדל הראשון עם טלסקופ בנוי עם שתי כפילויות אכרומטי (F1 = 35 מ"מ, F2 = 100 מ"מ) כדי להתאים את גודלו הסופי של קרן את האות על ידי 0.35x.

קרן המשאבה לאחר מכן נשלחת לקו עיכוב מורכבת פריזמה זווית ישרה להציב על הבמה תרגום ליניארי כי יכול להיות מכוון, כדי להבטיח חפיפה הזמני של המשאבה וקטניות אות (כוונון שיידונו להלן).

אחרי שורת עיכובים, קרן נשלחת באמצעות צלחת חצי גל ו מקטב בכיוון ב 45 ° ביחס אנכי בתוך מסגרת מעבדה. זה מבטיח את מצב הקיטוב הנכון של קרן המשאבה כאשר הוא מגיע בינוני קוי.

האור משתקף אז את ההיגוי של שתי מראות, אחת עם piezo חשמלי שולטת, המשמשים דק להתאים את המיקום של הקורה משאבה כזאת שהיא חופפת מרחבית עם קרן את האות. חפיפה מתקבל על ידי התבוננות המשאבה ואת הקורות אות בשני מקומות, אחד קרוב אחד רחוק מן המראה dichroic שבו קורות משולבים. באמצעות המראה ההיגוי הראשון חפיפה שתי הקורות בשלב הקרוב, את המראה piezo חפיפה קורות בנקודה רחוקה, קרן המשאבה יכול להתבצע בדיוק קוליניארי עם קרן את האות.

עם שתי הקורות גם יחד, השער קר ומערכת איסוף מוגדרים על מנת למקסם את הזמן מגודרת שנאספו האות.

4. עם שתי הקורות גם יחד, השער קר ומערכת איסוף מוגדרים על מנת למקסם את הזמן מגודרת שנאספו האות.

קורות המשאבה ואת האות הם עברו תחילה דרך פילטר dichroic כי יש מנת יתר של 6 ב 404 ננומטר למנוע אור עירור שיורית מתוך פיזור ראמאן מרגש בתוך המדיום ליניארית.
המשאבה וקורות אות ואז הם שניהם התמקדו על ידי כפיל אכרומטי (f = 35 מ"מ) לתוך קובט 1 ס"מ pathlength קוורץ המכיל את החומר ליניארית. כל חומר בעל קוי מדד כראוי קוי גבוה (גבוה מ CS _2), בתגובה הזמני קצר כראוי (<2 ps), יכול להיות מנוצל כאן. בניסויים אלה, אנו משתמשים פחמן דיסולפיד, CS _2, כי יש מדד קוי n ₂ = 3.1 x 10 ^-18 מ ^'2 / W. האור recollimated מכן על ידי כפיל שנייה עם אורך מוקד זהה לראשון.
הקורות הם עברו אז דרך Glan-תומפסון מנתח על הר מסתובב, ולאחר מכן באמצעות מערכת של מסנני קליטה הפרעה בשילוב יש OD של 10 ב 808 ננומטר.
לבסוף, לאור אות הוא התמקד על ידי כפיל אכרומטי (f = 35 מ"מ) לתוך סיב אופטי multimode 50 מיקרומטר, כאשר הוא רכוב סיבים בשלב המאפשר תרגום x, y, וז' סיבים מצמידים מכן הספקטרוגרף הדמיה מסחרי עם המצורפת מצלמת CCD (SP2300i ו Pixis 100B, בהתאמה, שניהם מיוצרים על ידי פרינסטון מכשירים, טרנטון, ניו ג'רזי).
כדי ליישר את מערכת איסוף על מנת למקסם את האות שנאספו, הנתח הוא 0 ° ו מדגם הבדיקה של טולואן ממוקם המטוס מדגם. על ידי התאמת x, y, z בקרות ההר סיבים, האות ראמאן נאסף הוא מותאם.
כדי להבטיח חפיפה במרחב ובזמן הנכון של המשאבה וקורות האות, מראה ממוקם המטוס מדגם של המיקרוסקופ. המסנן 404 ננומטר הוא הסיר מהמערכת. עם הנתח כדי לסובב 90 ° ננומטר retroreflected קרן 404 נשלח אל הספקטרוגרף עם עוצמת מותאם כאלה שזה לא להרוות את המצלמה. עם הקורה משאבת כבוי, הנתח הוא הסתובב כדי למזער ננומטר האות המועבר 404. עם קרן משאבת חזר על, בשלב עיכוב מכוון לאט עד לסיום השידור של אור 404 ננומטר מתחיל לעלות. ואז, על ידי iteratively כוונון השלב דיחוי, את המראה piezo חשמלי, ואת x, y, z בקרות של סיבים, אחד ממקסם את האות.
מכיוון רטרו משתקף 404 ננומטר קרן אור מפוזר ראמאן עשוי להימשך נתיבים שונים במקצת באמצעות המערכת, התאמות הסופי מבוצעים על ידי הצבת חזק ראמאן scatterer (כגון טולואן) על הבמה מדגם ואת tweaking מעט יישור על ידי שינוי שלב עיכוב, piezeo חשמלי במראה, ו-x, Y ו-Z שולט של סיבים כדי לייעל את האות ראמאן.

5. אוסף של ספקטרום זמן מגודרת אחת ראמאן דורש רכישת ספקטרום כמה לתקן חפצים המערכת.

עם הנתח מוגדר 0 °, קרן עירור על הקורה ואת משאבת כבוי, ספקטרום "ungated" היא נלקחה, המייצגים את הקשת זה יהיה רכש ללא היתרון של מערכת זמן gating.
עם הנתח מוגדר ° 90, את קרן עירור ואת קרן משאבת עדיין כבוי, ספקטרום גב הקרקע נלקחת, המייצג את כמות האור תועה דולף דרך מקטבים ורכיבים אחרים במערכת.
עם הנתח הנותר על 90 °וכל הקורות על, את הספקטרום "מגודרת" היא נלקחה, המייצג את אור מפוזר ראמאן מותר דרך מקטבים חצו על ידי נוכחות של הקורה המשאבה.
לבסוף, עם הנתח עדיין 90 °, הקורה עירור לסירוגין את קרן על המשאבה, ספקטרום הרקע השני הוא נלקח, המייצג את התרומה הספקטרום "מגודרת" כמויות שיורית של אור 808 ננומטר נכנסים הספקטרוגרף.
בנוסף, קשת נלקח עם כל לייזרים כבוי, המאפיינת את הבסיס האות "כהה" ברמה של המצלמה ואלקטרוניקה.
בגלל הספקטרום לעיתים קרובות דורשים פעמים אינטגרציה ארוך, הכרחי לשבור הפעם להשתלבות כמה חתיכות (מסגרות), כדי לאפשר תיקון נאותה של קרניים קוסמיות - בעיה נפוצה כאשר רכישת נתונים על תוחלת של מספר דקות.

6. רכשה פעם, מדרגות עיבוד כמה מועילים כדי לשפר את האיכות והמראה של הנתונים.

ראשית, כל הספקטרום מתוקנות כהה על ידי הפחתת את ספקטרום "כהה".
כדי לתקן את הקרניים הקוסמיות, המסגרות מספר המהווה one רכישת מושווים זה לזה על בסיס פיקסל אחר פיקסל. עבור כל פיקסל של מסגרת כלשהי נופל החוצה של 2 סטיות חציון מהערך החציוני פיקסל כי על פני כל המסגרות, ערך של פיקסל מוחלף על ידי הערך החציוני על פני כל המסגרות.
מסגרות הקרינה הקוסמית תיקן הם ממוצעים אז והחליקה על ידי מסנן Savitzky-Golay ^1.
כדי לחלץ את ספקטרום "נכון" מגודרת, אנו לנכות את "עירור בלבד" ו "משאבת בלבד" ספקטרה מן הספקטרום נמדד מגודרת.
לבסוף, ספקטרה מגודרת ו ungated אז הם הרקע לתיקון על ידי הפחתת 5 ^th סדר פולינום, נקבע בשיטה של ליבר Mahadevan ו-Jansen ^2.

7. נציג תוצאות:

באיור 1. תרשים סכמטי של מערכת gating קר. נתיב קרן משאבת מוצג באדום, ואילו נתיב SHG מוצג בכחול. הנתיב שבו רמן פלואורסצנטי הן חפפו מוצג בירוק, ואילו הנתיב בו Fluorescence סוננה temporally החוצה מוצג בצהוב. קיצורים כדלקמן: BPF, הלהקה לעבור סינון, CCD, מצמידים מכשיר חיוב; DCM, dichroic במראה; FI, פאראדיי מבודד; λ / 2, גל צלחת וחצי, LPF, ארוך לעבור מסנן: בינוני NLM, קוי, P, מקטב ; SHG, הדור השני הרמוני קריסטל.

איור 2 למעלה:. ספקטרה גולמי של coumarin מומס בשמן טבילה. עקומת האדום מראה את ספקטרום שצולמו עם השער החזיק פתוח (מנתח מערכת להעברת מקסימום). עקומת שחור מראה ספקטרום שצולמו עם הנתח מיושר להעברת מינימום משאבה קרן מיושם (הספקטרום מגודרת). עקומת הכחול מראה את spectum שצולמו עם הנתח מיושר להעברת מינימלית ולא משאבת קרן מיושם (השער החזיק סגור). עקומת גרין מציג את ספקטרום שצולמו רק את הקורה משאבת מיושם. קווים מקווקווים מציינים מגנטה באזור ספקטרלי המוצגים בלוח להלן. כל ספקטרום להיות מוחלק עם נקודה 11, 3 Savitzky-Golay כדי לסנן. למטה: ספקטרה של coumarin מומס בשמן טבילה לאחר הקרינה רקע חיסור. עקומת האדום הוא הספקטרום עם השער החזיק פתוח, עקומת כחול הוא ספקטרום מגודרת. הספקטרום מגודרת מראה בבירור את מאפיין מפותל גבוהה wavenumber שיא של שמנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תחום ספקטרוסקופיית ראמאן ביו ראה עניין גובר בשנים האחרונות כתוצאה פוטנציאל הפגינו שלה לפתרון האתגרים הקשים מספר אבחון ביולוגי. לדוגמה, ספקטרום ראמאן הוכחו יש ערך אבחון סרטן זיהוי ^{3, 4, 5, 6.} ספקטרוסקופיית ראמאן שימש גם ב quantitation חיידקי ^{7, 8} ו ⁹ תגובה התרופה חיידקי. היא מצאה גם יישום מגוון רחב של יישומים ביו אחרים החל בריאות העצם ¹⁰ לניתוח biofluid ^{11, 12.}

למרות פוטנציאל גדול כזה, עם זאת, ספקטרוסקופיית ראמאן יש מכשול גדול יתר לבוא במערכות ביולוגיות ביותר: חלש מאוד שלה חתך. לכן, אותות ראמאן יכול להיות המום בקלות אפילו רקע פלורסנט צנוע למדי. קיימות טכניקות רבות להסרת lineshape פלואורסצנציה ^{2, 13, 14.} עם זאת, אף אחת הטכניקות האלה באמת לטפל בבעיה העיקרית עם רקע פלורסנט חזקה; ירו לרעש תרמה הספקטרום על ידי נוכחות של מציפה רקע ניאון האות ראמאן ולא ניתן לגרוע ממנו. כמה טכניקות, כגון ספקטרוסקופיה קוהרנטית ראמאן אנטי סטוקס (מכוניות) ואת פיזור ראמאן מגורה (או פיזור ראמאן הפוך), פותחו כדי לנסות להגביר את עוצמת האות ראמאן ^{15, 16, 17.} עם זאת, כל הטכניקות האלה חלים בעיקר דגימות שקופים בעלי רקע שלהם בעיות עם רגישות כימית ^18.

מיגון הגלאי מן האות הקרינה היא הדרך היחידה באמת לדחות את רעש הירייה הקשורים ברקע הקרינה פיזור ראמאן ספונטנית. לפני למעלה מעשור, Matousek et al. הפגינו דחייה הקרינה באמצעות תריס קר מהירים כדי לבודד את האותות temporally רמן פלואורסצנציה ^{19, 20.} עם זאת, נכון להיום, המערכת הזו לא מצאה שימוש נרחב בתחום הביולוגי, בשל הצורך של אנרגיות גבוהות מדי הדופק. המערכת המוצגת תקשורת זה, לעומת זאת, מנצל 1000 פעמים אנרגיות דופק חלש יותר כמה דיווחים קודמים והוא תואם עם מערכות ביולוגיות.

המערכת שלנו, שמוצג באיור 1 מנצל קוליניארי קר הגיאומטריה השער כדי לחסוך בצריכת החשמל ולספק כמו חפיפה רבה בין המשאבה לבין הקורות אות בתוך המדיום קוי האפשרי. בנוסף, אנו דואגים לצמצם הפסדים אופטי ככל האפשר, כדי להבטיח שיש לנו את הכוח זמין לכל היותר לפעול תריס קר שלנו. באמצעות מערכת זו השגנו ספקטרום ראמאן fluorescing מאוד של דגימות ביולוגיות, כלומר גבעול הצמח יסמין, ללא תצפית על כל נזקי ^21. בדוח זה אנו מציגים נציג כמה נתונים על מערכת מודל של fluorophore על בסיס צמחי (coumarin τF ≈ 5 ns) מומס בשמן טבילה מיקרוסקופ. זה שמוצג באיור 2. בפאנל העליון, אנו רואים את הספקטרום חזק "ungated" (אנלייזר כדי להגדיר 0 °) באדום, טיפס על 0.04% מתוך הערך המקסימלי שלה למטרות ויזואליזציה. שים לב כי אין פסגות ראמאן להבחין גלוי. למטה, שחור, הוא ספקטרום מגודרת גלם (כלומר את הספקטרום עם המשאבה וגם עירור על לייזרים). מתחת לזה, בכחול, הוא ספקטרום עם לייזר רק על עירור, המייצג הקרינה השיורית דולף דרך מקטבים חצה. לבסוף, ירוק, אנו רואים את הרקע בגלל לייזר המשאבה דולף באמצעות שילוב של מסנני קליטה התערבות להציב במערכת. בפאנל התחתון של תרשים 2 אנו רואים subregion של הספקטרום ungated ו מגודרת (האזור מסומן על ידי קווים מקווקווים מגנטה בלוח העליון) לאחר ניכוי של הפולינום צו 5. הספקטרום מגודרת מראה בבירור את השיא wavenumber גבוה קשור השומנים, ואילו קשת ungated אין תכונות ראמאן ברור.

למרות המערכת שלנו אינו פועל עם effciency גדול כרגע (שידור maxiumum נמדד כבר סביב 5%), עוצמת האות המוחלט הוא בדרך כלל פחות חשובה האות לרעש-to-. ישנן מספר כיתות רחב של דגימות ביולוגיות אשר מדידת ספקטרום ראמאן המקובלת היא קשה או בלתי מעשי עקב רקע הקרינה המכריע. לקבלת דוגמיות אלה, המערכת שלנו יכולה לספק שיפור מובהק אות לרעש, כפי שנראה בבירור באיור 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי הפרס NSF DBI 0852891. חלק מהעבודה זה גם מומן על ידי המרכז Biophotonics מדע וטכנולוגיה, המיועד NSF המדע והטכנולוגיה מרכז המנוהל על ידי אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס, על פי הסכם שיתופית מס 'PHY0120999.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lenses	Thorlabs Inc.	Various	All lenses coated to have maximum transmission losses of 1% each
Tunable Ti:Sapph laser	Coherent Inc.	Chameleon	30 nJ, 200 fs, 80 MHz
40X oil immersion objective	Olympus Corporation	UApo/340	NA = 1.35
Inverted microscope	Olympus Corporation	IX-71	Modified to remove all lenses in side port
Half wave plate	Thorlabs Inc.	AHWP05M-600
Glan-Thompson polarizer	Thorlabs Inc.	GTH10M	∼10% transmission loss
Spectrometer	Princeton Instruments/Acton	SP2300i
CCD	Princeton Instruments/Acton	Pixis 100B
Mathmatical software	Mathworks	MATLAB	version 2008a
Faraday isolator	EOT	BB8-5I
Piezo-electric mirror	Newport Corp.	AG-M100
BBO crystal	CASIX	custom	1 mm thickness
Bandpass filter 1	Andover	008FC14	808 ± 0.4 nm
Dichroic mirror	Semrock	FF662-FDI01	band edge at 662 nm
Long-pass filter	Semrock	BLP01-405R	band edge at 417 nm
Bandpass filter 2	Semrock	FF02-447/60	417-447 nm
CS₂	Sigma-Aldrich	335266	99% purity
Coumarin 30	Sigma-Aldrich	546127	99% purity
Immersion oil	Cargill Labs	16242	Type DF