Summary
Discutimos a construção e operação de um sistema não-linear complexa óptico que utiliza comutação totalmente óptica ultra-rápida para isolar Raman a partir de sinais de fluorescência. Usando este sistema, somos capazes de separar com sucesso sinais Raman e fluorescência utilizando energias de pulso e poderes média que permanecem biologicamente seguro.
Abstract
A espectroscopia Raman é frequentemente assolada por um fundo fluorescente muito forte, particularmente para amostras biológicas. Se uma amostra é animado com um trem de pulsos ultra-rápidos, um sistema que pode temporalmente separadas espectralmente sobrepostas sinais em uma escala de tempo de picosegundos pode isolar rapidamente chegar luz dispersa Raman de tarde-de chegar a luz de fluorescência. Aqui nós discutimos a construção e operação de um sistema não-linear complexa óptico que utiliza todos os óptica de comutação em forma de um baixo consumo de energia óptico Kerr portão para isolar sinais Raman e de fluorescência. Um único laser de 808 nm com 2,4 W de potência média e taxa de repetição 80 MHz é dividida, com aproximadamente 200 mW de 808 nm de luz que está sendo convertido para <5 mW de 404 nm de luz enviado para a amostra para excitar espalhamento Raman. Os restantes luz nm unconverted 808 é então enviada para um meio não-linear, onde ele atua como a bomba para o obturador totalmente óptica. O obturador abre e fecha em 800 fs com um pico de eficiência de aproximadamente 5%. Usando este sistema, somos capazes de separar com sucesso sinais Raman e fluorescência em uma taxa de repetição de 80 MHz a partir de energias de pulso e poderes média que permanecem biologicamente seguro. Porque o sistema não tem capacidade ociosa em termos de potência óptica, detalhamos várias considerações de design e de alinhamento que ajuda a maximizar o rendimento do sistema. Discutimos, também, o nosso protocolo para a obtenção da sobreposição espacial e temporal do sinal e vigas bomba dentro do meio Kerr, bem como um protocolo detalhado para aquisição espectral. Por fim, relatamos um representante alguns resultados de espectros Raman obtidos na presença de fluorescência forte usando o nosso sistema de tempo de selecção.
Protocol
1. Alguns cuidados devem ser tomados na preparação e colocação de uma amostra de Raman dentro deste sistema.
- Porque o sistema normalmente faz uso de muito alta abertura numérica com objetivos muito curta distâncias de trabalho, as amostras são colocadas em uma lamela. Amostras biológicas são normalmente colocados em uma lamela espessura No. 1 montado em uma câmara de célula Attofluor (Invitrogen, Carlsbad, CA).
- Amostras líquidas, em particular os tóxicos para os seres humanos, são colocados em um pequeno frasco de vidro com uma lamela cimentado à abertura por meio de um epóxi silicone. A garrafa é então invertido para a medição.
- Porque o nosso sistema depende momento preciso da bomba e pulsos de sinal, somos constrangidos a não utilizar o ajuste do foco do nosso microscópio convencional, o que traduz o objetivo cima e para baixo. Isso adiciona e subtrai caminho óptico do nosso sistema. Em vez disso, nós colocamos as nossas amostras em um palco secundário montado em cima do palco microscópio que tem controle de foco independente.
2. A fim de ter tempo de gated espectros Raman, o feixe de excitação deve ser devidamente preparado.
- Começamos com a luz saindo de um 2,4 W sintonizável pulsado de Ti: Sapph laser (Chameleon, sistemas coerentes, Santa Clara, CA). Cada pulso na década de 80 MHz trem de pulsos tem 30 nJ de energia, tem uma largura temporal de 140 fs, e tem um espectro centrado em 808 nm com uma largura de banda espectral de ~ 6 nm.
- Para evitar back-reflexões a partir de re-entrada na cavidade laser, a luz é transmitida através de um isolador Faraday. Uma placa de meia onda colocado antes do isolador Faraday permite ajuste contínuo da potência total enviado para o sistema.
- Porque 6 nm é muito ampla largura de banda para resolver uma maioria dos modos de Raman, o feixe é enviado através de um filtro de banda muito estreita (0,8 nm FWHM, Andover Corporation, Salem, NH) centrado em 808 nm.
- A luz é, então, focalizada por um gibão acromática (f = mm 100) em um 5 milímetros de borato de bário-β (BBO) cristal (CASIX, Fuzhou, Fujian, China PR) para reduzir pela metade o comprimento de onda de 808 nm a 404 nm. O cristal BBO é colocado em uma montagem com controles de ponta e de inclinação, e também montado em um estágio de tradução. Para maximizar a eficiência da conversão de comprimento de onda, o cristal deve ser colocado exatamente simétrica sobre o foco do gibão, e com seu eixo de cristal alinhados à polarização do feixe de entrada.
- Porque a eficiência da conversão de comprimento de onda é dependente da polarização, o controle sobre a quantidade de luz enviada para a amostra pode ser obtido pela colocação de uma placa de meia onda segundo após o isolador de Faraday. Rodando este waveplate, a intensidade de luz enviado para a amostra pode ser ajustado independentemente da intensidade enviado no feixe de bomba (a ser discutido abaixo).
- O comprimento de onda da luz é convertida recollimated por um gibão segundo acromática (f = mm 500) escolhidos de forma que o feixe de sair é grande o suficiente para encher a abertura parte de trás da objetiva do microscópio, e dirigido para um microscópio invertido (IX-71, Olympus, Center Valley, PA), por meio de dois espelhos de direção.
- A objetiva do microscópio, sendo o elemento óptico alojados dentro do componente mais monolítico do sistema, define o eixo óptico. Para alinhar o feixe de excitação a este eixo, um espelho é colocado no plano da amostra do microscópio. Os dois espelhos de direção são, então, iterativamente sintonizado enquanto observa o back-raio laser refletida em um CCD cam-era (μEye, IDS, Obersulm, Alemanha) conectada a uma porta de imagem do microscópio. Assumindo que a imagem da câmera é centrada no microscópio de campo de visão, o raio é no eixo quando o ponto focal é centrado no chip de microscópio e tradução do objectivo ao longo do eixo z não altera o ponto central do feixe desfocado.
- Quando uma amostra é colocada no plano da amostra e irradiado com luz laser Raman ocorre. Um filtro dicróica colocada abaixo da objetiva do microscópio separa o comprimento de onda deslocado luz Raman espalhada (e fluorescência) do feixe de excitação, direcionando a luz Raman espalhada para a porta do lado do microscópio. O microscópio foi modificada para remover as lentes dentro desse caminho, de tal forma que a luz do sinal emerge do microscópio colimado.
- Porque o feixe de sinal emergentes do microscópio é maior do que a abertura clara dos polarizadores Glan-Thompson, um telescópio 0.47x confeccionada com dois doublets acromática (f1 = 75 mm, f2 = 35 mm) é usado para reduzir o feixe.
- A luz do sinal é, então, polarizados por um polarizador Glan-Thompson orientada a 0 ° em relação à vertical no referencial de laboratório, e dirigido a um espelho dicróico onde é recombinado com o feixe de bomba.
3. Para que o portão óptica para operar com a máxima eficiência, é preciso ter cuidado na preparação do feixe de bomba (Kerr feixe) também.
4. Com os dois feixes combinado, o portão Kerr e sistema de coleta são criados para maximizar o tempo de gated coletados sinal.
- Os feixes de bomba e de sinal são os primeiros passados por um filtro dicróico que tem um OD de 6 em 404 nm para evitar qualquer luz de excitação residual de espalhamento Raman emocionante dentro do meio não-linear.
- A bomba e vigas de sinal são em seguida, ambos focados por um gibão acromática (f = mm 35) numa cuvete caminho ótico 1 centímetro de quartzo contendo o material não-linear. Qualquer material não-linear tendo um alto índice convenientemente não-linear (superior CS 2), e convenientemente curta resposta temporal (<2 ps), pode ser utilizado aqui. Para estes experimentos, usamos dissulfeto de carbono, CS 2, que tem um índice não-linear n 2 = 3,1 x 10 -18 m 2 / W. A luz é então recollimated por um gibão segundo com uma distância focal idêntica à primeira.
- As vigas são então passados através de e Glan-Thompson analisador em um monte de rotação, e depois através de um conjunto de absorção e interferência filtros que combinadas têm um OD de 10 a 808 nm.
- Finalmente, a luz do sinal é focada por um gibão acromática (f = mm 35) em uma fibra multimodo 50 mM óptica, onde a fibra é montado em um palco que permite a tradução em x, y, e z. A fibra é então acoplado a um espectrógrafo de imagem comercial com anexado câmera CCD (SP2300i e Pixis 100B, respectivamente, ambos fabricados pela Princeton Instruments, Trenton, NJ).
- Para alinhar o sistema de coleta para maximizar sinal coletado, o analisador está definido para 0 ° e uma amostra de tolueno é colocado no plano da amostra. Ao ajustar o x, y, z e controles do monte de fibra, o sinal coletado Raman é otimizado.
- Para garantir a adequada sobreposição espacial e temporal da bomba e feixes de sinal, um espelho é colocado no plano da amostra do microscópio. O filtro nm 404 é removido do sistema. Com o analisador a 90 ° rodada do feixe nm retroreflected 404 é enviado para o espectrógrafo com a intensidade ajustada de tal forma que não satura a câmera. Com o feixe de bomba desligada, o analisador é girado para minimizar o sinal transmitido nm 404. Com o feixe de bomba ligada novamente, o estágio de atraso é ajustado lentamente até que a transmissão da luz nm 404 começa a aumentar. Então, por iterativamente ajustar o estágio de atraso, o espelho piezo-elétricos, e os x, y, z e controles da fibra, um maximiza o sinal.
- Porque a retro-refletida 404 nm e feixe de luz Raman espalhada pode demorar um pouco diferentes caminhos através do sistema, os ajustes finais são feitos colocando uma forte Raman dispersor (como tolueno) no palco da amostra e os ajustes ligeiramente o alinhamento, alterando a estágio de atraso, piezeo-elétrico, espelho e x, y, e z controles da fibra para otimizar o sinal Raman.
5. Coleção de um espectro de tempo-gated única Raman exige a aquisição de espectros de várias para corrigir artefatos do sistema.
- Com o analisador de set a 0 °, o feixe de excitação sobre a viga e bomba de fora, um espectro "ungated" é tomada, o que representa o espectro de que seria adquirido sem o benefício do sistema de tempo de selecção.
- Com o analisador definido para 90 °, o feixe de excitação e do feixe de bomba de fora ainda, um espectro de fundo é tomada, o que representa a quantidade de luz difusa vazando através do polarizadores e outros elementos no sistema.
- Com o analisador restantes em 90 °e todas as vigas, o espectro de "gate" é tomado, representando a luz Raman espalhada permitido através do polarizadores cruzados pela presença do feixe de bomba.
- Finalmente, com o analisador ainda a 90 °, o feixe de excitação off eo feixe bomba, um espectro de fundo é tomada segundo, representando a contribuição para o espectro de "gate" de quantidades residuais de 808 nm de luz entrando no espectrógrafo.
- Além disso, um espectro é tomado com todos os lasers off, caracterizando a linha de base nível de sinal "dark" da câmera e eletrônica.
- Porque os espectros muitas vezes exigem longos tempos de integração, é imperativo para quebrar este tempo de integração em vários pedaços (frames) para permitir a correção adequada dos raios cósmicos - um problema comum quando a aquisição de dados durante períodos de vários minutos.
6. Uma vez adquirido, várias etapas de processamento são úteis para melhorar a qualidade ea aparência dos dados.
- Primeiro, todos os espectros são escuros corrigido subtraindo-se fora do espectro "dark".
- Para corrigir os raios cósmicos, os vários quadros que constituem uma aquisição são comparados uns com os outros em uma base de pixel por pixel. Para qualquer pixel de qualquer quadro que está fora de dois desvios mediana do valor médio para o pixel em todos os frames, valor que pixel é substituído pelo valor mediano em todos os frames.
- Os quadros de raios cósmicos são, então, corrigido e média suavizada por um filtro Savitzky-Golay 1.
- Para extrair o espectro de "verdadeiro" gated, subtraímos a "excitação-only" e "bomba-only" espectros do espectro medido fechado.
- Finalmente, os espectros gated e ungated são, então, fundo corrigido subtraindo-se a 5 ª ordem polinomial, determinada pelo método de Lieber e Mahadevan-Jansen 2.
7. Resultados representativos:
Figura 1. Diagrama esquemático do sistema de propagação Kerr. O caminho do feixe bomba é mostrado em vermelho, enquanto o caminho SHG é mostrado em azul. O caminho onde Raman e de fluorescência são sobrepostas é mostrado em verde, enquanto o caminho onde a fluorescência tem sido temporalmente filtrados é mostrado em amarelo. Abreviaturas da seguinte forma: BPF, banda passante do filtro; CCD, charge-coupled device; DCM, dicróicas espelho; FI, Faraday isolador; λ / 2, placa de meia onda; LPF, longa-pass do filtro; médio, NLM não-linear; P polarizador, ; SHG, cristal geração de segundo harmônico.
Figura 2 Top:. Raw espectros de cumarina dissolvidos em óleo de imersão. Curva vermelha mostra o espectro tomado com a porta abertas (analisador de conjunto para transmissão máxima). Curva preta mostra o espectro tomado com o analisador alinhados para transmissão mínima e uma bomba de feixe aplicado (o espectro gated). Curva azul mostra a spectum tomadas com o analisador alinhado para a transmissão mínima e nenhuma bomba feixe aplicado (portão mantida fechada). Curva verde mostra o espectro tomado com a bomba só feixe aplicado. Linhas tracejadas indicam magenta região espectral mostrado no painel abaixo. Todos os espectros foram suavizadas com uma ponto 11, de 3 ª ordem Savitzky-Golay filtro. Inferior: Spectra de cumarina dissolvido em óleo de imersão após fluorescência de fundo subtração. Curva vermelha é o espectro com a porta abertas, ea curva azul é o espectro fechado. O espectro gated mostra claramente a característica de pico de alta complicado número de ondas de óleos.
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Discussion
O campo da espectroscopia Raman biomédica tem visto um crescente interesse nos últimos anos diversas como resultado de seu potencial demonstrado para a resolução de vários desafios difíceis no diagnóstico biológico. Por exemplo, espectros Raman tem sido demonstrado que têm valor de diagnóstico do câncer de detecção de 3, 4, 5, 6. A espectroscopia Raman também tem sido utilizado na quantificação bacteriana 7, 8 e resposta à droga bacteriana 9. Ele também encontrou aplicação em uma ampla gama de outras aplicações biomédicas que vão desde a saúde óssea de 10 a análise biofluid 11, 12.
Apesar de grande potencial, no entanto, espectroscopia Raman tem uma grande barreira a ultrapassar, na maioria dos sistemas biológicos: a sua extremamente fraco seção transversal. Portanto, os sinais de Raman podem ser facilmente dominado por bastante modesto, mesmo backgrounds fluorescente. Muitas técnicas existem para a remoção do LineShape fluorescência 2, 13, 14. No entanto, nenhuma dessas técnicas enfrentar verdadeiramente o problema principal com fortes antecedentes fluorescentes; o tiro ruído contribuiu para o espectro, a presença do fundo fluorescente oprime o sinal Raman e não pode ser subtraído de distância. Diversas técnicas, tais como coerente espectroscopia Raman anti-Stokes (CARS) e espalhamento Raman estimulado (ou espalhamento Raman inversa), têm sido desenvolvidos para tentar amplificar a força do sinal Raman 15, 16, 17. No entanto, todas estas técnicas são principalmente aplicável às amostras transparentes e têm seus próprios fundos e problemas com químicas sensibilidade 18.
Blindagem do detector a partir do sinal de fluorescência é a única maneira de realmente rejeitar o ruído tiro associados com o fundo de fluorescência em espalhamento Raman espontâneo. Mais de uma década atrás, Matousek et al. demonstrou rejeição de fluorescência usando um ultra-rápida do obturador Kerr para isolar temporariamente os sinais Raman e fluorescência 19, 20. No entanto, até à data, este sistema não encontrou uso difundido no campo biológico, devido à necessidade de energias de pulso excessivamente elevados. O sistema apresentado na presente comunicação, pelo contrário, utiliza 1000 vezes mais fracas energias de pulso do que alguns relatórios anteriores e é compatível com sistemas biológicos.
Nosso sistema, mostrado na Figura 1 utiliza uma geometria colineares Kerr portão para conservar a energia e fornecer como muita sobreposição entre a bomba e feixes de sinal dentro do meio não-linear possível. Além disso, tomamos o cuidado de reduzir as perdas óptica, tanto quanto possível para garantir que temos a potência máxima disponível para operar nossos obturador Kerr. Usando este sistema obtivemos espectros Raman de amostras biológicas altamente fluorescentes, ou seja, um caule de plantas Jasmine, sem observação de qualquer photodamage 21. Neste relatório, mostrar alguns dados representativos em um sistema modelo de um fluoróforo à base de plantas (cumarina, τF ≈ 5 ns) dissolvido em óleo de imersão do microscópio. Isso é mostrado na Figura 2. No painel superior, vemos a forte espectro "ungated" (conjunto analisador a 0 °) em vermelho, escalado para 0,04% do seu valor máximo para efeitos de visualização. Note que não há picos Raman discernable visível. Abaixo, em preto, é o espectro gated-primas (ou seja, o espectro com a bomba e excitação em lasers). Abaixo disso, em azul, é o espectro, com apenas a excitação do laser sobre, representando fluorescência residual vazando através do polarizadores cruzados. Finalmente, em verde, nós vemos o fundo devido ao laser bomba vazando através da combinação de absorção e interferência filtros colocados no sistema. No painel inferior da Figura 2 vemos uma sub-região do espectro ungated e fechado (região indicada por linhas tracejadas magenta no painel superior) após a subtração de um polinômio de ordem 5. O espectro gated mostra claramente o pico de número de ondas de alta associada com lipídios, enquanto o espectro ungated não tem características claras Raman.
Embora o nosso sistema não funciona com efciência grande no momento (transmissão maxiumum medida tem sido em torno de 5%), força do sinal absoluto é tipicamente menos importante do que sinal-ruído. Existem vários grandes classes de amostras biológicas para que a medição espectros Raman convencional é difícil ou impraticável devido à esmagadora fundos de fluorescência. Para essas amostras, o nosso sistema pode fornecer uma melhoria de sinal-ruído definida, como pode ser visto claramente na Figura 2.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela NSF prêmio DBI 0852891. Parte deste trabalho também foi financiado pelo Centro de Biophotonics Ciência e Tecnologia, um designado NSF Centro de Ciência e Tecnologia gerido pela Universidade da Califórnia, Davis, no âmbito do Acordo de Cooperação n º PHY0120999.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lenses | Thorlabs Inc. | Various | All lenses coated to have maximum transmission losses of 1% each |
| Tunable Ti:Sapph laser | Coherent Inc. | Chameleon | 30 nJ, 200 fs, 80 MHz |
| 40X oil immersion objective | Olympus Corporation | UApo/340 | NA = 1.35 |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | IX-71 | Modified to remove all lenses in side port |
| Half wave plate | Thorlabs Inc. | AHWP05M-600 | |
| Glan-Thompson polarizer | Thorlabs Inc. | GTH10M | ∼10% transmission loss |
| Spectrometer | Princeton Instruments/Acton | SP2300i | |
| CCD | Princeton Instruments/Acton | Pixis 100B | |
| Mathmatical software | Mathworks | MATLAB | version 2008a |
| Faraday isolator | EOT | BB8-5I | |
| Piezo-electric mirror | Newport Corp. | AG-M100 | |
| BBO crystal | CASIX | custom | 1 mm thickness |
| Bandpass filter 1 | Andover | 008FC14 | 808 ± 0.4 nm |
| Dichroic mirror | Semrock | FF662-FDI01 | band edge at 662 nm |
| Long-pass filter | Semrock | BLP01-405R | band edge at 417 nm |
| Bandpass filter 2 | Semrock | FF02-447/60 | 417-447 nm |
| CS2 | Sigma-Aldrich | 335266 | 99% purity |
| Coumarin 30 | Sigma-Aldrich | 546127 | 99% purity |
| Immersion oil | Cargill Labs | 16242 | Type DF |
References
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