Summary
वर्तमान वीडियो एक विधि है जो electroporation और confocal माइक्रोस्कोपी के संयोजन का लाभ लेता है है विकासशील zebrafish अग्रमस्तिष्क में व्यक्तिगत तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं पर रहते इमेजिंग प्रदर्शन को दर्शाता है.
Abstract
विभाजन, प्रवास, और तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की भेदभाव की सटीक पैटर्न उचित मस्तिष्क विकास और समारोह 1,2 के लिए महत्वपूर्ण हैं. Vivo वातावरण में परिसर में न्यूरल पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के व्यवहार को समझने के लिए, समय चूक एक अक्षुण्ण मस्तिष्क में तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का जीना इमेजिंग समीक्षकों की आवश्यकता है. इस वीडियो में, हम zebrafish भ्रूण की अनूठी विशेषताओं का दोहन करने के लिए vivo में अग्रमस्तिष्क तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के विकास की कल्पना. हम आनुवंशिक और कम से लेबल व्यक्तिगत तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं को electroporation का उपयोग करें. संक्षेप में, डीएनए फ्लोरोसेंट मार्करों के लिए कोडिंग constructs 22 घंटे के बाद निषेचन (HPF) zebrafish भ्रूण और बिजली के दालों तुरंत दिया गया अग्रमस्तिष्क निलय में इंजेक्शन थे. छह घंटे बाद, electroporated zebrafish भ्रूण कम पिघलने बिंदु agarose साथ गिलास नीचे संस्कृति बर्तन में घुड़सवार थे. Fluorescently लेबल तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं तो एक confocal खुर्दबीन के नीचे पानी की सूई उद्देश्य लेंस का उपयोग निर्धारित अंतराल के साथ 36hours के लिए imaged थे. वर्तमान विधि अग्रमस्तिष्क तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के vivo विकास में में अंतर्दृष्टि लाभ प्रदान करता है और zebrafish भ्रूण के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के अन्य भागों में लागू किया जा सकता है.
Protocol
1. Zebrafish भ्रूण तैयार
- Electroporation के पहले दो दिनों जंगली प्रकार महिलाओं से पुरुषों के लिए अलग डिवाइडर का उपयोग मछली के संभोग पिंजरों सेट.
- Electroporation के एक दिन पहले, पिछले दिन से संभोग पिंजरों में डिवाइडर खींच.
- भ्रूण लीजिए और 30 मिलीलीटर भ्रूण 28.5 पर 0.003% phenylthiourea (PTU) युक्त मध्यम डिग्री सेल्सियस में 50 निषेचित भ्रूण को सेते
- Electroporation की दिन पर, मैन्युअल रूप से ठीक संदंश (5 Inox, Dumont इलेक्ट्रॉनिक, स्विट्जरलैंड), जब भ्रूण 22hpf विकास मंच तक पहुँचने के साथ dechorionate भ्रूण. फिर 10ml electroporation घंटी है (180 मिमी NaCl, 5mm KCl, 1.8 CaCl2 मिमी, 5 मिमी Hepes पीएच 7.2) 3 0.003% युक्त PTU भ्रूण स्थानांतरण.
- 10ml electroporation घंटी के लिए भ्रूण anesthetize 420 μl tricaine शेयर (4mg/ml) जोड़ें.
2. Electroporation के लिए तैयार
- ग्लास इंजेक्शन सुइयों capillaries (1.2 मिमी आयुध डिपो, 0.9 मिमी आईडी फिलामेंट के साथ,) से एक ज्वलंत ब्राउन P897 डांड़ी (Sutter उपकरण, Novato, CA, संयुक्त राज्य अमरीका) पर खींच रहे थे. सुई टिप बंद संदंश के साथ टूट गया था एक तेज अंत आंकड़ा 1D में दिखाया के रूप में. टिप के व्यास 10 सुक्ष्ममापी आसपास और शंकु कोण 30 डिग्री के आसपास होना चाहिए.
- 0.8% की तैयारी और 1% electroporation घंटी समाधान में कम गलनांक agarose (शेल्टन वैज्ञानिक, Inc सूची IB70050 #). विभाज्य 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में agarose समाधान. एक गर्मी ब्लॉक में ~ सी. ° 37 aliquots रखें
- Gal4/UAS प्रणाली electroporated भ्रूण के तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए प्रयोग किया जाता है. प्लाज्मिड EF1α GFF - PT2KXIG, जिसमें Gal4FF सर्वव्यापी प्रमोटर EF1α द्वारा संचालित है और प्लाज्मिड यूएएस E1B-EGFP-PT2KXIG: दो plasmids उपयोग किया जाता है.
- EF1α GFF - PT2KXIG और यूएएस E1B-EGFP-PT2KXIG प्लाज्मिड डीएनए GenEluteTM हिमाचल प्रदेश प्लाज्मिड Midiprep किट (सिग्मा) का उपयोग कर तैयार है.
- plasmids तो 10 मिमी Tris · सीएल में 1-2 μg / μl की अंतिम एकाग्रता (8.5 पीएच) सोडियम वर्षण / एसीटेट इथेनॉल से ध्यान केंद्रित कर रहे हैं.
- दो plasmids मिक्स और nuclease - मुक्त 500 / प्रत्येक प्लाज्मिड के लिए एनजी μl के अंतिम एकाग्रता के लिए H2O के साथ पतला. Phenol लाल (1 / 10 कुल मात्रा पतला) के समाधान के लिए इसके अलावा प्रसव के दृश्य के लिए पसंद है. बर्फ पर डीएनए समाधान रखें.
- राइट electroporation, backload 2 μl डीएनए समाधान के साथ इंजेक्शन सुई से पहले और 2 nl करने के लिए इंजेक्शन की मात्रा समायोजित.
3. Electroporation
- एक stero विच्छेदन (50x का एक अधिकतम बढ़ाई साथ Zeiss 2000 STEMI) माइक्रोस्कोप, एक हवा के दबाव सुई लगानेवाला (Narishige आईएम microinjector 300), दो micromanipulators (डब्ल्यूपीआई M3301R, विश्व परिशुद्धता उपकरण, Sarasota, FL, संयुक्त राज्य अमरीका), और एक बिजली के उत्तेजक औधधि (SD9 वर्ग पल्स उत्तेजक औधधि, घास Tlefactor, पश्चिम वारविक, रोड आइलैंड, संयुक्त राज्य अमरीका) स्थापित कर रहे हैं के रूप में चित्र 1A में दिखाया गया है.
- 1% कम गलनांक agarose में भ्रूण, विसर्जित 2 भ्रूण माउंट. तो तुरंत agarose से एक गिलास विंदुक के साथ भ्रूण को हटाने.
- एक औंधा agarose की व्यक्तिगत बूंदों में प्लास्टिक पेट्री डिश ढक्कन पर भ्रूण रखें. भ्रूण धीरे एक फाइबर पृष्ठीय - अप की स्थिति में जांच के साथ पहले agarose इतना है कि अग्रमस्तिष्क दोनों इलेक्ट्रोड और microinjection सुई (चित्रा 1 बी) के लिए सुलभ है solidifies ओर मालूम. भ्रूण व्यक्तिगत agarose बूँदें में मुहिम शुरू होना चाहिए.
- बाईं micromanipulator के साथ इलेक्ट्रोड हेरफेर. Agarose में इलेक्ट्रोड चित्रा 1B में दिखाया के रूप में सम्मिलित करें. कस्टम प्लैटिनम iridium समानांतर द्विध्रुवी व्यास और स्थान 500 सुक्ष्ममापी में 125 सुक्ष्ममापी इलेक्ट्रोड अलग electroporation (fhc, PBSA0575 # सूची) के लिए किया जाता है.
- अग्रमस्तिष्क वेंट्रिकल में microinjection सुई डालें और 4nl डीएनए मिश्रण इंजेक्षन लाल तरल पदार्थ के बहने और वेंट्रिकल की सूजन मनाया जा सकता है के रूप में.
- तत्काल, एक 28.5 वी नाड़ी स्थायी 1 millisecond मैन्युअल रूप से लागू किया गया था. फिर polarity रिवर्स और एक और 28.5 वी नाड़ी स्थायी 1 millisecond लागू. यह अग्रमस्तिष्क तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के द्विपक्षीय मोज़ेक लेबलिंग में परिणाम होगा.
- 10 भ्रूण की electroporation के बाद, 5ml भ्रूण मध्यम जोड़ने भ्रूण कवर और एक microsurgical भ्रूण रिहाई चाकू के साथ agarose छील.
- 30 मिलीलीटर भ्रूण मध्यम की एक ताजा पकवान 28.5 पर 0.003% PTU और सेते युक्त डिग्री सेल्सियस electroporated भ्रूण स्थानांतरण
4. बढ़ते और समय चूक लाइव इमेजिंग
- Electroporation के बाद 4 घंटे के आसपास, EGFP संकेत अगर एक epifluorescent विदारक माइक्रोस्कोप के अंतर्गत देखा नमूदार है.
- Electroporation के बाद पांच घंटे, अत्यधिक मोज़ेक लेकिन अग्रमस्तिष्क क्षेत्र में मजबूत EGFP अभिव्यक्ति के साथ भ्रूण का चयन करें.
- 10ml भ्रूण 0.003% PTU युक्त माध्यम से चयनित भ्रूण स्थानांतरण.
- 10ml भ्रूण मध्यम टी 420 μl tricaine शेयर (4mg/ml) जोड़ेंओ भ्रूण anesthetize है.
- भ्रूण माउंट करने के लिए, 0.8% कम पिघलने बिंदु agarose में विसर्जित भ्रूण 1. Agarose से फिर तुरंत एक गिलास विंदुक के साथ भ्रूण और दूर एक 35 मिमी गिलास नीचे संस्कृति डिश (MatTek निगम, # P35GC-1.5-10-सी पार्ट के केंद्र पर भ्रूण जगह www.glass - नीचे dishes.com ) .
- एक फाइबर agarose solidifies पहले स्थिति पृष्ठीय जांच के साथ भ्रूण धीरे ओर मालूम.
- डिश ठीक से confocal खुर्दबीन का तापमान नियंत्रित मंच पर आंकड़ा 1C (हम ऊपर सही उद्देश्यों के साथ एक Nikon C1 वर्णक्रमीय confocal खुर्दबीन का उपयोग करें) के रूप में दिखाया गया है प्लेस. 28.5 करने के लिए तापमान समायोजित ° सी.
- 28.5 3ml जोड़ें डिग्री सेल्सियस preheated भ्रूण 0.003 भ्रूण कवर PTU% युक्त मध्यम. भ्रूण अब इमेजिंग के लिए तैयार है.
- समय चूक एक निश्चित अंतराल के साथ एक पानी की सूई उद्देश्य का उपयोग रहते इमेजिंग प्रदर्शन.
5. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 2 में दिखाया गया है एक समय चूक 22 HPF EF1α GFF + यूएएस E1B-EGFP electroporated भ्रूण के confocal रहते इमेजिंग के फ्रेम का चयन कर रहे हैं.
चित्रा 1 उपकरण. सेट अप. (ए) electroporation उपकरणों के विधानसभा घास SD9 वर्ग पल्स (i) के उत्तेजक औधधि, बाएँ micromanipulator (ii) (iii) इलेक्ट्रोड, Zeiss खुर्दबीन विदारक (iv), (v) इंजेक्शन सुई, सही micromanipulator (vi) और Narishige आईएम 300 microinjector (vii). (बी) (i) इलेक्ट्रोड, अग्रमस्तिष्क वेंट्रिकल (ii) और इंजेक्शन की सुई (iii) के सापेक्ष स्थिति. नोट: लाल रंग का डीएनए समाधान अग्रमस्तिष्क वेंट्रिकल में अंतःक्षिप्त किया गया है. (सी) Nikon C1 confocal खुर्दबीन पर रहते इमेजिंग के विधानसभा: तापमान नियंत्रक (i), पानी की सूई उद्देश्य लेन (ii) और electroporated एक गिलास नीचे संस्कृति पकवान (iii) (डी में कम पिघलने बिंदु agarose में एम्बेडेड भ्रूण ) डीएनए के microinjection के लिए एक खींच लिया और कटौती सुई की छवि.
चित्रा 2 18 घंटे समय चूक 22 HPF EF1α GFF + यूएएस E1B-EGFP के साथ electroporated भ्रूण के confocal रहते इमेजिंग के चयनित फ्रेम . निलय सतह प्रत्येक छवि फ्रेम के नीचे की ओर पर है. स्केल बार 10 सुक्ष्ममापी का प्रतिनिधित्व करता है.
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Discussion
इस वीडियो में, हम समय चूक विकासशील zebrafish अग्रमस्तिष्क में एक clonal स्तर पर तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का जीना इमेजिंग के लिए एक विधि का प्रदर्शन. हम परीक्षण और आनुवंशिक और fluorescently लेबल व्यक्तिगत तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं को संशोधित मौजूदा electroporation प्रोटोकॉल 4-6. एक वंश clonally संबंधित संतान कोशिकाओं से बना पेड़ के बाद से केवल कुछ कोशिकाओं को कम electroporation की एक रिश्तेदार कम वोल्टेज के साथ लेबल रहे थे स्थापित किया जा सकता है. EGFP करने के लिए इसके अलावा में, तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं subcellularly बस अन्य फ्लोरोसेंट मार्करों के साथ EGFP की जगह द्वारा किया जा सकता है विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल. उदाहरण के लिए, अगर EF1α GFF था यूएएस - E1B - memberane-EGFP और UAS E1B H2B - mRFP के साथ सह electroporated व्यक्तिगत पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की झिल्ली हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल किया जाएगा, जबकि नाभिक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल किया जाएगा. लेबल पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के अधिकांश के रूप में स्वस्थ हैं electroporated भ्रूण और कुछ apoptosis रहते इमेजिंग के दौरान मनाया सामान्य सामान्य विकास के द्वारा evidenced. यह भी है agarose की एक कम एकाग्रता का उपयोग करने के लिए भ्रूण माउंट और confocal रहते इमेजिंग के दौरान कोशिकाओं को स्वस्थ रखने के एक न्यूनतम लेजर शक्ति का उपयोग महत्वपूर्ण है. वर्तमान तकनीक भी हिंद मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के रूप में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के अन्य भागों में लागू किया जा सकता है. हालांकि, इस तकनीक को 18 HPF की तुलना में छोटी भ्रूण पर लागू नहीं कर सकते हैं, के बाद से डीएनए constructs electroporation के लिए वेंट्रिकल में इंजेक्ट किया है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम theNIH grantNS042626 द्वारा समर्थित किया गया. हम कर्ट कांटा और UCSF Nikon इमेजिंग केंद्र इमेजिंग के साथ सहायता के लिए धन्यवाद.
References
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