Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Summary

Die vorliegende Video zeigt eine Methode, die nutzt die Kombination von Elektroporation und konfokale Mikroskopie, um Live-Aufnahmen zu den einzelnen neuronalen Vorläuferzellen im sich entwickelnden Zebrafisch Vorderhirn führen.

Abstract

Präzise Muster der Teilung, Migration und Differenzierung neuronaler Vorläuferzellen sind entscheidend für die richtige Entwicklung des Gehirns und die Funktion ^1,2. Um zu verstehen, das Verhalten des neuronalen Vorläuferzellen in der komplexen in vivo-Umgebung ist Zeitraffer-Live-Darstellung von neuralen Vorläuferzellen in einem intakten Gehirn kritisch erforderlich. In diesem Video, nutzen wir die einzigartigen Eigenschaften von Zebrafisch-Embryonen zur Entwicklung des Vorderhirns neuralen Vorläuferzellen in vivo sichtbar zu machen. Wir verwenden Elektroporation, genetisch und dünn Label einzelnen neuronalen Vorläuferzellen. Kurz gesagt, Konstrukte kodierenden DNA Fluoreszenzmarker wurden in das Vorderhirn Ventrikel von 22 Stunden nach der Befruchtung (HPF) Zebrafischembryonen und elektrische Impulse wurden sofort injiziert. Sechs Stunden später wurden die Elektroporation Zebrafischembryonen mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose in Glasboden Kulturschalen montiert. Fluoreszenzmarkierten neuralen Vorläuferzellen wurden dann für 36 Stunden mit festen Abständen unter einem konfokalen Mikroskop mit Wasser getaucht Objektiv abgebildet. Das vorliegende Verfahren bietet eine Möglichkeit, Einblicke in die in vivo Entwicklung von Vorderhirn neuralen Vorläuferzellen zu gewinnen und kann auch auf andere Teile des zentralen Nervensystems des Zebrafisch-Embryos angewendet werden.

Protocol

1. Vorbereitung des Zebrafisch-Embryos

1. Zwei Tage vor der Elektroporation eingerichtet Paarung Käfigen von Wildtyp-Fisch mit Trennwänden zu trennen Männchen von Weibchen.
2. Einen Tag vor der Elektroporation, ziehen Sie den Teilern in Paarung Käfigen vom Vortag.
3. Sammeln Embryonen und inkubieren 50 befruchteten Embryonen in 30 ml embryonalen Medium mit 0,003% Phenylthioharnstoff (PTU) bei 28,5 ° C.
4. Am Tag der Elektroporation, dechorionate die Embryonen von Hand mit feinen Pinzetten (Inox 5, Dumont Electronic, Schweiz), wenn die Embryonen der Entwicklungsphase 22hpf erreichen. Übertragen Sie anschließend die Embryonen bis 10ml Elektroporation ^Ringer-3 (180 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM Hepes pH 7,2) mit 0,003% PTU.
5. Add 420 ul Tricaine Lager (4mg/ml), um die 10ml Elektroporation Ringer, die Embryonen zu betäuben.

2. Vorbereitung für die Elektroporation

1. Glass Injektionsnadeln wurden von Kapillaren (1,2 mm OD, 0,9 mm ID, mit Filament) auf einem Flaming-Brown P897 Puller (Sutter Instruments, Novato, CA, USA) gezogen. Die Nadelspitze wurde mit einer Pinzette gebrochen, um ein scharfes Ende bekommen, wie in Abbildung 1D gezeigt. Der Durchmesser der Spitze sollte etwa 10 um und der Kegelwinkel sollte etwa 30 Grad.
2. Bereiten Sie 0,8% und 1% niedriger Schmelzpunkt Agarose (Shelton Scientific, Inc. Katalog # IB70050) in Elektroporation Ringerlösung. Aliquot der Agarose-Lösung in 2 ml Reaktionsgefäße. Halten Sie die Aliquots in einem Heizblock bei ~ 37 ° C.
3. Die Gal4/UAS System wird verwendet, um die Genexpression in neuronalen Vorläuferzellen elektroporiert Embryonen zu fahren. Zwei Plasmide verwendet: Plasmid EF1α-GFF-PT2KXIG, in denen Gal4FF durch die allgegenwärtige Promoter EF1α angetrieben wird, und Plasmid-UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG.
4. Bereiten EF1α-GFF-PT2KXIG und UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG Plasmid-DNA mit GenEluteTM HP Plasmid Midiprep Kit (Sigma).
5. Die Plasmide werden dann von Natriumacetat / Ethanolfällung auf die Endkonzentration von 1-2 ug / ul in 10 mM Tris · Cl (pH 8,5) konzentriert.
6. Mischen Sie die beiden Plasmide und verdünnt mit Nuklease-freiem H2O auf eine Endkonzentration von 500 ng / ul für jedes Plasmid. Die Zugabe von Phenolrot (verwässert 1 / 10 Volumen), um die Lösung für die Visualisierung der Lieferung bevorzugt. Halten Sie die DNA-Lösung auf Eis.
7. Kurz vor der Elektroporation, tendieren, die Injektionsnadel mit 2 ul DNA-Lösung und stellen Sie das Injektionsvolumen zu 2 nl.

3. Elektroporation

1. Ein stero Dissektionsmikroskop (Zeiss Stemi 2000 mit einer maximalen Vergrößerung von 50x), einem Luftdruck-Injektor (Narishige IM 300 Mikroinjektor), zwei Mikromanipulatoren (WPI M3301R, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA), und einer elektrischen Stimulator (SD9 Rechteckimpuls Stimulator, Grass Tlefactor, West Warwick, Rhode Island, USA) werden wie in Abbildung 1A dargestellt eingestellt.
2. Um die Embryonen, tauchen 2 Embryonen in 1% niedrig schmelzenden Agarose montieren. Dann ziehen Sie sofort den Embryonen aus der Agarose mit einer Glaspipette.
3. Legen Sie die Embryonen auf eine umgekehrte Kunststoff Petrischalendeckel in einzelne Tropfen aus Agarose. Richten Sie die Embryonen vorsichtig mit einem Faser-Sonde an eine dorsale-up-Position vor dem Agarose verfestigt, so dass das Vorderhirn zugänglich sowohl die Elektroden und die Mikroinjektionsnadel (Abbildung 1B) ist. Embryonen müssen in einzelnen Agarose Tropfen montiert werden.
4. Bearbeiten Sie die Elektroden mit der linken Mikromanipulator. Legen Sie die Elektroden in die Agarose, wie in Abbildung 1B gezeigt. Benutzerdefinierte Platin-Iridium parallel bipolaren Elektroden 125 um im Durchmesser und Abstand 500 pm voneinander entfernt sind für die Elektroporation (FHC, Katalog # PBSA0575) verwendet.
5. Legen Sie die Mikroinjektion Nadel in das Vorderhirn Herzkammer und spritzen 4NL DNA-Mix, fließt der rote Flüssigkeit und die Schwellung der Ventrikel beobachtet werden können.
6. Sofort wurde eine 28,5 V Puls Dauer von 1 Millisekunde manuell. Dann umpolen und gelten noch 28,5 V Puls Dauer von 1 Millisekunde. Dies wird in bilateralen Mosaik Kennzeichnung des Vorderhirns neuralen Vorläuferzellen führen.
7. Nach der Elektroporation von 10 Embryonen, fügen 5ml embryonalen Medium, um die Embryonen Abdeckung und ziehen Sie die Agarose mit einem mikrochirurgischen Messer, um die Embryonen freizugeben.
8. Übertragen Sie die Elektroporation Embryonen in ein frisches Gericht aus 30 ml embryonalen Medium mit 0,003% PTU und inkubieren bei 28,5 ° C.

4. Montage-und Zeitraffer-Live-Imaging

1. Rund 4 Stunden nach der Elektroporation wird die EGFP-Signal zu beobachten, wenn sie unter einer epifluoreszenten Präpariermikroskop angesehen.
2. Fünf Stunden nach der Elektroporation, wählen Sie die Embryonen mit hoch Mosaik, aber starke EGFP-Expression im Vorderhirn Region.
3. Übertragen Sie die ausgewählten Embryonen embryonale 10ml Medium mit 0,003% PTU.
4. Add 420 ul Tricaine Lager (4mg/ml), um die 10ml embryonalen mittleren to betäuben die Embryonen.
5. Um die Embryonen mount, tauchen ein Embryo in 0,8% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt. Dann ziehen Sie sofort den Embryo aus der Agarose mit einer Glaspipette und Ort der Embryo in der Mitte einer 35-mm Glasboden Kulturschale (MatTek Unternehmen, Part # P35GC-1,5-10-C, www.glass-bottom-dishes.com ) .
6. Richten Sie die Embryonen vorsichtig mit einem Faser-Sonde an eine dorsale-up-Position vor dem Agarose erstarrt.
7. Die Schale richtig von der Temperatur gesteuert Phase des konfokalen Mikroskops, wie in Abbildung 1C (Wir verwenden eine Nikon C1 spektralen konfokalen Mikroskop mit bis rechts Ziele) dargestellt. Stellen Sie die Temperatur auf 28,5 ° C.
8. Add 3ml 28,5 ° C vorgeheizten embryonalen Medium mit 0,003% PTU um den Embryo zu decken. Der Embryo ist nun bereit für die Bildgebung.
9. Führen Sie Zeitraffer-Live-Bildgebung mit einem festgelegten Intervall mit einem Wasser-Tauchen Ziel.

5. Repräsentative Ergebnisse

In Abbildung 2 sind Bilder eines Zeitraffer-konfokale Bildgebung leben des Embryos von EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP bei 22 hpf elektroporiert ausgewählt.

Abbildung 1. Apparatus Set-up. (A) Die Versammlung der Elektroporation Ausstattung: the Grass SD9 Rechteckimpuls Stimulator (i), der linke Mikromanipulator (ii) die Elektroden (iii), das Zeiss-Binokular (iv), der Injektionsnadel (v), das Recht Mikromanipulator (vi) und die Narishige IM 300 Mikroinjektor (vii). (B) Die relative Position der Elektroden (i), das Vorderhirn Ventrikels (ii) und der Injektionsnadel (iii). Beachten Sie die rot gefärbten DNA-Lösung in das Vorderhirn Herzkammer injiziert wurde. (C) Die Montage von Live-Aufnahmen auf Nikon C1 konfokalen Mikroskop: der Temperaturregler (i), das Wasser getaucht Ziel len (ii) und die Elektroporation Embryo in Agarose für niedrigen Schmelzpunkt in einem Glasboden Kulturschale (iii) (D embedded ) Bild von einem gezogen und geschnitten Nadel für die Mikroinjektion von DNA.

Abbildung 2. Ausgewählter Bilder eines 18-Stunden-Zeitraffer-konfokale Bildgebung leben des Embryos mit EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP bei 22 hpf elektroporiert. Ventrikel Oberfläche ist auf der Unterseite eines jeden Bildrahmen. Scale-Balken repräsentiert 10 pm.

Discussion

In diesem Video zeigen wir eine Methode zur Zeitraffer-Live-Darstellung von neuralen Vorläuferzellen in einem klonalen Ebene in den Entwicklungsländern Zebrafisch Vorderhirn. Wir testeten und modifiziert das bestehende Elektroporation Protokolle ^4-6, um genetisch und Fluoreszenz-Label einzelnen neuronalen Vorläuferzellen. Eine Linie Baum klonal verbundenen Nachkommen Zellen zusammengesetzt ist etabliert, da nur wenige Zellen waren spärlich mit einer relativ geringen Spannung von Elektroporation gekennzeichnet werden. Neben EGFP kann das neuronale Vorläuferzellen subcellularly mit verschiedenen fluoreszierenden Proteinen werden durch einfaches Austauschen EGFP mit anderen fluoreszierenden Markern versehen. Zum Beispiel, wenn EF1α-GFF wurde mit UAS-E1B-memberane-EGFP und UAS-E1B-H2B-mRFP Zusammenarbeit elektroporiert werden Membranen einzelner Vorläuferzellen mit dem grün fluoreszierenden Protein markiert werden, während Kern mit rot fluoreszierenden Protein markiert werden. Die meisten der markierten Vorläuferzellen sind gesund, wie durch die allgemeinen normale Entwicklung des Embryos und elektroporiert paar Apoptose während der Live-Bildgebung beobachtet belegt. Es ist auch entscheidend für eine geringe Konzentration an Agarose verwenden, um den Embryo mounten und verwenden eine minimale Laserleistung während konfokale Bildgebung leben zu halten die Zellen gesund. Die vorliegende Technik kann auch auf andere Teile des zentralen Nervensystems wie die Hinterbeine Gehirn und das Rückenmark angewendet werden. Allerdings kann diese Technik nicht an Embryonen jünger als 18 hpf angewendet werden, da die DNA-Konstrukte in die Ventrikel für die Elektroporation injiziert werden müssen.