Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen

Summary

De huidige video toont een methode die gebruik maakt van de combinatie van elektroporatie en confocale microscopie te leven imaging op individuele neurale stamcellen uit te voeren in de zich ontwikkelende zebravis voorhersenen.

Abstract

Precieze patronen van verdeeldheid, migratie en differentiatie van neurale progenitorcellen zijn cruciaal voor een goede ontwikkeling van de hersenen en de functie ^1,2. Om te begrijpen van het gedrag van neurale progenitor cellen in het complex in vivo omgeving, is het time-lapse live-imaging van neurale stamcellen in een intacte hersenen kritisch nodig. In deze video maken we gebruik van de unieke kenmerken van de zebravis embryo's naar de ontwikkeling van de voorhersenen neurale progenitor cellen in vivo te visualiseren. We maken gebruik van elektroporatie van genetisch en dun label individuele neurale progenitor cellen. Kortom, DNA-constructen die coderen voor fluorescerende merkers werden geïnjecteerd in de voorhersenen ventrikel van 22 uur na de bevruchting (HPF) zebravis embryo's en elektrische pulsen werden onmiddellijk afgeleverd. Zes uur later werden de zebravis embryo's geëlektroporeerd gemonteerd met een laag smeltpunt agarose in glazen bodem cultuur gerechten. Fluorescent gelabelde neurale progenitor cellen werden vervolgens belicht voor 36 uur met vaste intervallen onder een confocale microscoop met behulp van water te dompelen objectief. De huidige methode biedt een manier om inzicht te krijgen in de in vivo ontwikkeling van voorhersenen neurale progenitor cellen en kan worden toegepast op andere delen van het centrale zenuwstelsel van de zebravis embryo.

Protocol

1. Voorbereiding van de zebravis embryo's

1. Twee dagen voor elektroporatie, opgericht paring kooien van de wilde soort vis met behulp van tussenschotten te scheiden mannetjes van de vrouwtjes.
2. Een dag voor elektroporatie, trek de verdelers in paring kooien van de vorige dag.
3. Verzamel embryo's en incubeer 50 bevruchte embryo's in 30 ml embryonale medium dat 0,003% phenylthiourea (PTU) bij 28,5 ° C.
4. Op de dag van elektroporatie, dechorionate de embryo's handmatig met fijne pincet (Inox 5, Dumont Electronic, Zwitserland) wanneer de embryo's het ontwikkelingsstadium van de 22hpf te bereiken. Vervolgens transfer van de embryo's te 10ml elektroporatie beltoon's ³ (180 mM NaCl, 5mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM Hepes pH 7,2) met 0,003% PTU.
5. Voeg 420 ul tricaïne voorraad (4mg/ml) om de 10ml elektroporatie beltoon aan verdoven van de embryo's.

2. Voorbereiding voor Elektroporatie

1. Glas injectienaalden werden getrokken uit capillairen (1,2 mm OD, 0,9 mm ID, met gloeidraad) op een Flaming-Brown P897 trekker (Sutter Instruments, Novato, CA, USA). De naald was afgebroken met een tang om een ​​scherpe punt te krijgen zoals weergegeven in figuur 1D. De diameter van de tip moet ongeveer 10 urn en de taper hoek moet ongeveer 30 graden.
2. Bereid 0,8% en 1% een lage smeltpunt agarose (Shelton Scientific, Inc catalogus # IB70050) in een oplossing elektroporatie Ringer's. Aliquot de agarose opgelost in 2 ml microcentrifugebuizen. Bewaar de monsters in een warmte-blok ~ 37 ° C.
3. Het Gal4/UAS systeem wordt gebruikt om genexpressie rijden in neurale stamcellen van embryo's geëlektroporeerd. Twee plasmiden worden gebruikt: plasmide EF1α-GFF-PT2KXIG, waarin Gal4FF wordt aangedreven door de alomtegenwoordige promotor EF1α, en plasmide UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG.
4. Bereid EF1α-GFF-PT2KXIG en UAS-E1B-EGFP-plasmide DNA met behulp van PT2KXIG GenEluteTM HP Plasmid Midiprep Kit (Sigma).
5. De plasmiden worden dan geconcentreerd door natriumacetaat / ethanol precipitatie aan de uiteindelijke concentratie van 1-2 ng / pl in 10 mM Tris · Cl (pH 8,5).
6. Meng de twee plasmiden en verdun met nuclease-vrij H2O tot een uiteindelijke concentratie van 500 ng / ul voor elk plasmide. Toevoeging van fenol rood (1 / 10 verdund totaal volume) aan de oplossing heeft de voorkeur voor de visualisatie van de levering. Houd de DNA-oplossing op het ijs.
7. Vlak voor elektroporatie, frictie de injectienaald met 2 ui DNA-oplossing en pas de injectie volume op 2 nl.

3. Elektroporatie

1. Een stero dissectie microscoop (Zeiss Stemi 2000 met een maximale vergroting van 50x), een luchtdruk injector (Narishige IM 300 microinjector), twee micromanipulators (WPI M3301R, World precisie-instrumenten, Sarasota, FL, USA), en een elektrische stimulator (SD9 square pulse stimulator, Gras Tlefactor, West Warwick, Rhode Island, USA) zijn opgezet als in figuur 1A.
2. Om de embryo's, dompel twee embryo's monteren in 1% lage smeltpunt agarose. Dan onmiddellijk verwijderen van de embryo's uit de agarose met een glazen pipet.
3. Plaats de embryo's op een omgekeerde plastic petrischaal deksel in individuele druppels van agarose. Voorzichtig oriënteren van de embryo's met een vezel sonde naar een rug-up positie voordat de agarose stolt, zodat de voorhersenen is toegankelijk voor zowel de elektroden en de micro-injectie naald (Figuur 1B). Embryo's moeten worden gemonteerd in afzonderlijke agarose druppels.
4. Manipuleer de elektroden met de linker micromanipulator. Plaats de elektroden in de agarose zoals weergegeven in figuur 1B. Aangepaste platina iridium parallel bipolaire elektroden 125 micrometer in diameter en zitten 500 micrometer van elkaar worden gebruikt voor elektroporatie (FHC, catalogus # PBSA0575).
5. Steek de micro-injectie naald in de voorhersenen ventrikel en injecteer 4NL DNA mix, zoals stroming van rode vloeistof en de zwelling van de hartkamer kan worden waargenomen.
6. Onmiddellijk werd een 28,5 V puls 1 milliseconde handmatig aangebracht. Draai dan de polariteit en toe te passen een meer 28,5 V puls 1 milliseconde. Dit zal resulteren in bilaterale mozaïek etikettering van de voorhersenen neurale progenitor cellen.
7. Na elektroporatie van 10 embryo's, voeg 5 ml embryonale medium om de embryo's te dekken en schil de agarose met een microchirurgische mes om de embryo's vrij te geven.
8. Breng de geëlektroporeerd embryo's om een ​​nieuwe schotel van 30 ml embryonale medium dat 0,003% PTU en incubeer bij 28,5 ° C.

4. Montage en Time-lapse Live-Imaging

1. Rond 4 uur na elektroporatie, is het EGFP signaal waarneembaar wanneer bekeken onder een microscoop epifluorescerende ontleden.
2. Vijf uur na de elektroporatie, selecteert u de embryo's met zeer mozaïek, maar sterk EGFP expressie in de voorhersenen regio.
3. Overdracht van de geselecteerde embryo's 10ml embryonale medium met 0,003% PTU.
4. Voeg 420 ul tricaïne voorraad (4mg/ml) om de 10ml embryonale medium to verdoven van de embryo's.
5. Om de embryo's monteren, dompel een embryo in 0,8% een laag smeltpunt agarose. Dan onmiddellijk verwijderen van de embryo uit de agarose met een glazen pipet en plaats het embryo in het midden van een 35mm glazen bodem cultuur schotel (MatTek corporatie, Part # P35GC-1.5-10-C, www.glass-bottom-dishes.com ) .
6. Voorzichtig oriënteren van de embryo's met een vezel sonde naar een rug-up positie vóór de agarose stolt.
7. De juiste plaats de schotel op de temperatuur gecontroleerde fase van de confocale microscoop zoals weergegeven in figuur 1C (We maken gebruik van een Nikon C1 spectrale confocale microscoop met up-rechts doelstellingen). Breng de temperatuur op 28,5 ° C.
8. Voeg 3 ml 28,5 ° C voorverwarmde embryonale medium met 0,003% PTU om de embryo te dekken. Het embryo is nu klaar voor de beeldvorming.
9. Uitvoeren van time-lapse leven beeldvorming met een vast interval met behulp van een water dompelen doelstelling.

5. Representatieve resultaten

Weergegeven in figuur 2 zijn geselecteerd frames van een time-lapse confocale live-beeldvorming van het embryo geëlektroporeerd van EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP op 22 hpf.

Figuur 1. Apparatuur set-up. (A) De montage van elektroporatie apparatuur: de Grass-SD9 vierkante pulse stimulator (i), de linker micromanipulator (ii), de elektroden (iii), de Zeiss dissectiemicroscoop (iv), de injectienaald (v), het recht micromanipulator (vi) en de Narishige IM 300 microinjector (vii). (B) De relatieve positie van de elektroden (i), de voorhersenen ventrikel (ii) en de injectienaald (iii). Let op de rood-gekleurde DNA-oplossing werd ingespoten in de voorhersenen ventrikel. (C) De Algemene Vergadering van de live imaging op de Nikon C1 confocale microscoop: de temperatuur controller (i), het water dompelen doel len (ii) en de geëlektroporeerd embryo ingebed in een laag smeltpunt agarose in een glazen bodem cultuur schaal (iii) (D ) Afbeelding van een getrokken en snijd naald voor micro-injectie van DNA.

Figuur 2. Geselecteerde frames van een 18-uurs time-lapse confocale live-beeldvorming van het embryo geëlektroporeerd met EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP op 22 hpf. Hartkamer oppervlak is aan de onderkant van elke afbeelding frame. Schaalbalk staat voor 10 micrometer.

Discussion

In deze video tonen we een methode voor time-lapse live-beeldvorming van neurale stamcellen op een klonale niveau in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen. We testten en gewijzigd de elektroporatie bestaande protocollen ^4-6 om genetisch en fluorescent label individuele neurale progenitor cellen. Een afstamming boom bestaat uit klonaal verwante nakomelingen cellen kunnen worden vastgesteld, omdat slechts een paar cellen werden dun gemerkt met een relatief lage spanning van elektroporatie. In aanvulling op EGFP, kan het neurale stamcellen subcellularly worden gelabeld met verschillende fluorescente eiwitten door simpelweg te vervangen EGFP met andere fluorescente merkers. Bijvoorbeeld, als EF1α-GFF was co-geëlektroporeerd met UAS-E1B-memberane-EGFP en UAS-E1B-H2B-mRFP, zal membranen van de individuele progenitor cellen worden gelabeld met groen fluorescerend eiwit, terwijl kern zal gelabeld worden met rood fluorescerend eiwit. De meeste van de gelabelde progenitor cellen zijn gezond, zoals blijkt uit de algemene normale ontwikkeling van de embryo's en geëlektroporeerd paar apoptose waargenomen tijdens de live-imaging. Het is ook van cruciaal belang voor een lage concentratie van agarose te gebruiken om de embryo monteren en een minimale laservermogen gebruiken tijdens de confocale live-imaging te houden de cellen gezond. De huidige techniek kan ook worden toegepast op andere delen van het centrale zenuwstelsel, zoals de achterste hersenen en het ruggenmerg. Toch kan deze techniek niet worden toegepast op embryo's jonger dan 18 HPF, omdat de DNA-constructen worden geïnjecteerd in de ventrikel voor elektroporatie.