Imagerie time-lapse en direct de relation clonale cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur développement Zebrafish

Summary

La vidéo montre le présent une méthode qui prend avantage de la combinaison de l'électroporation et la microscopie confocale pour l'imagerie en direct sur chaque cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur poisson zèbre en développement.

Abstract

Schémas précis de la division, la migration et la différenciation des cellules progénitrices neurales sont cruciales pour le développement du cerveau et ^1,2 fonction. Pour comprendre le comportement des cellules progénitrices neurales dans le complexe dans un environnement in vivo, imagerie time-lapse en direct de cellules progénitrices neurales dans un cerveau intact est absolument nécessaire. Dans cette vidéo, nous exploitons les caractéristiques uniques des embryons de poisson zèbre pour visualiser le développement des cellules progénitrices neurales du cerveau antérieur in vivo. Nous utilisons d'électroporation génétiquement et peu d'étiquettes individuelles cellules progénitrices neurales. En bref, des constructions d'ADN codant pour des marqueurs fluorescents ont été injectées dans le ventricule du cerveau antérieur de 22 heures après fécondation (HPF) et les embryons de poissons zèbres impulsions électriques ont été livrés immédiatement. Six heures plus tard, les embryons de poissons zèbres électroporées ont été montés avec bas point de fusion de verre dans des plats d'agarose culture sur le fond. Marqués par fluorescence des cellules progénitrices neurales ont ensuite été imagés pour les 36 heures avec des intervalles fixes sous un microscope confocal à l'aide d'eau plongeant objectif. La méthode actuelle fournit un moyen d'avoir un aperçu dans le développement in vivo des cellules progénitrices neurales du cerveau antérieur et peut être appliquée à d'autres parties du système nerveux central de l'embryon de poisson zèbre.

Protocol

1. Préparation des embryons de poissons zèbres

1. Deux jours avant l'électroporation, mis en place des cages d'accouplement des poissons de type sauvage en utilisant des diviseurs d'hommes séparés des femelles.
2. Un jour avant l'électroporation, tirez les diviseurs de l'accouplement des cages de la journée précédente.
3. Recueillir des embryons et incuber 50 embryons fécondés in 30 ml de milieu contenant embryonnaire phénylthiourée 0,003% (PTU) à 28,5 ° C.
4. Le jour de l'électroporation, les embryons dechorionate manuellement avec une pince fine (Inox 5, Dumont électronique, Suisse) où les embryons atteignent le stade de développement 22hpf. Puis transfert des embryons à ³ 10ml électroporation Ringer (180 mM de NaCl, KCl 5 mM, 1,8 mM de CaCl2, 5 mM pH Hepes 7,2) contenant 0,003% PTU.
5. Ajouter 420 ul tricaïne stock (4mg/ml) à l'électroporation 10ml Ringer pour anesthésier les embryons.

2. Préparation pour l'électroporation

1. Aiguilles d'injection de verre ont été retirés de capillaires (1,2 mm de diamètre extérieur, 0,9 mm ID, avec filament) sur un extracteur Flaming-Brown P897 (Sutter Instruments, Novato, CA, USA). La pointe de l'aiguille a été rompu avec une pince pour obtenir une extrémité pointue, comme indiqué dans la figure 1D. Le diamètre de la pointe devrait être d'environ 10 pm et l'angle du cône doit être autour de 30 degrés.
2. Préparer 0,8% et 1% à bas point de fusion d'agarose (Shelton Scientific, Inc catalogue # IB70050) dans une solution de Ringer électroporation. Aliquoter la solution d'agarose à 2 ml microtubes. Gardez les aliquotes dans un bloc thermique à ~ 37 ° C.
3. Le système Gal4/UAS est utilisé pour piloter l'expression des gènes dans les cellules progénitrices neurales des embryons électroporé. Deux plasmides sont utilisés: le plasmide EF1α-GFF-PT2KXIG, dans lequel Gal4FF est entraîné par le promoteur ubiquitaire EF1α, et le plasmide SAMU-E1B-EGFP-PT2KXIG.
4. Préparez-EF1α GFF-PT2KXIG et UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG ADN plasmidique en utilisant GenEluteTM HP plasmidique Midiprep Kit (Sigma).
5. Les plasmides sont ensuite concentrées par acétate de sodium / éthanol précipitations à la concentration finale de 1-2 pg / pl dans 10 mM Tris · Cl (pH 8,5).
6. Mélanger les deux plasmides et diluer avec sans nucléase H2O à une concentration finale de 500 ng / ul pour chaque plasmide. Ajout de rouge de phénol (dilué 1 / 10 volume total) à la solution est préférée pour la visualisation de la livraison. Conserver la solution d'ADN sur la glace.
7. Juste avant l'électroporation, backloading l'aiguille d'injection avec 2 ul solution d'ADN et d'ajuster le volume d'injection à 2 nl.

3. L'électroporation

1. Un microscope de dissection stero (Zeiss Stemi 2000 avec un grossissement maximal de 50x), une pression d'injection d'air (Narishige IM 300 microinjecteur), deux micromanipulateurs (WPI M3301R, Instruments de précision mondiale, Sarasota, Floride, USA), et un stimulateur électrique (SD9 carrés d'impulsion stimulateur, Herbe Tlefactor, West Warwick, Rhode Island, USA) sont mis en place comme dans la Figure 1A.
2. Pour monter les embryons, immerger deux embryons dans 1% à bas point de fusion d'agarose. Puis retirer immédiatement les embryons de l'agarose avec une pipette en verre.
3. Placer les embryons sur un couvercle de plastique inversé plat de Petri en gouttes individuelles d'agarose. Orienter les embryons doucement avec une sonde à fibre à une position dorsale-up avant l'agarose se solidifie pour que le prosencéphale est accessible à la fois les électrodes et l'aiguille de microinjection (figure 1B). Les embryons doivent être montés dans chaque agarose gouttes.
4. Manipuler les électrodes avec le micromanipulateur gauche. Insérer les électrodes dans l'agarose comme indiqué dans la figure 1B. Personnalisé en platine iridié électrodes bipolaires en parallèle 125 mm de diamètre et espacés de 500 um d'intervalle sont utilisés pour l'électroporation (FHC, catalogue # PBSA0575).
5. Insérez l'aiguille de microinjection dans le ventricule du cerveau antérieur et injecter mélange d'ADN 4NL, comme découlant de liquide rouge et le gonflement du ventricule peuvent être observés.
6. Immédiatement, une impulsion de 28,5 V à 1 milliseconde durables a été appliquée manuellement. Ensuite, on inverse la polarité et d'appliquer une plus 28,5 V impulsion de durée de 1 milliseconde. Cela se traduira par l'étiquetage de mosaïque de cellules du cerveau antérieur bilatérale du progénitrices neurales.
7. Après électroporation de 10 embryons, ajouter 5ml moyenne embryonnaires pour couvrir les embryons et le zeste de l'agarose avec un couteau de microchirurgie pour libérer les embryons.
8. Transfert des embryons électroporées à un plat frais de 30 ml de milieu embryonnaire contenant 0,003% et PTU incuber à 28,5 ° C.

4. Montage et imagerie time-lapse en direct

1. Environ 4 heures après l'électroporation, le signal de l'EGFP est observable si vu sous un microscope à épifluorescence dissection.
2. Cinq heures après l'électroporation, sélectionner les embryons à la mosaïque, mais très forte expression de l'EGFP dans la région du cerveau antérieur.
3. Transfert des embryons sélectionnés pour 10ml embryonnaire milieu contenant PTU 0,003%.
4. Ajouter 420 ul tricaïne stock (4mg/ml) à l'embryon t 10ml moyenneso anesthésier les embryons.
5. Pour monter les embryons, immerger une embryon dans 0,8% d'agarose à faible point de fusion. Puis retirer immédiatement l'embryon de l'agarose avec une pipette en verre et le lieu de l'embryon au centre d'une boîte de culture à fond de verre 35mm (MatTek Corporation, partie # P35GC-1.5-10-C, www.glass-bas dishes.com ) .
6. Orienter les embryons doucement avec une sonde à fibre à une position dorsale-up avant l'agarose se solidifie.
7. Placer le plat bien sur la scène à température contrôlée du microscope confocal, comme indiqué dans la figure 1C (Nous utilisons un microscope Nikon C1 spectrale confocale avec haut-droite objectifs). Réglez la température à 28,5 ° C.
8. Ajouter 3ml 28,5 ° C préchauffé moyenne embryonnaire contenant 0,003% PTU pour couvrir l'embryon. L'embryon est maintenant prêt pour l'imagerie.
9. Effectuer imagerie time-lapse vivre avec un intervalle fixe en utilisant un objectif de l'eau de trempage.

5. Les résultats représentatifs

Montre la figure 2 sont sélectionnés les cadres d'une imagerie time-lapse direct confocale de l'embryon électroporées des EF1α-GFF + SAMU-E1B-EGFP à 22 HPF.

Figure 1. Appareillage set-up. (A) L'assemblée des équipements d'électroporation: l'herbe SD9 carrée pouls stimulateur (i), le micromanipulateur gauche (ii), les électrodes (iii), le Zeiss loupe binoculaire (iv), l'aiguille d'injection (v), le droit de micromanipulateur (vi) et l'IM 300 Narishige microinjecteur (vii). (B) La position relative des électrodes (i), le ventricule du cerveau antérieur (ii) et l'aiguille d'injection (iii). Notez la solution d'ADN de couleur rouge a été injecté dans le ventricule du cerveau antérieur. (C) L'Assemblée de l'imagerie en direct sur Nikon microscope confocal C1: le régulateur de température (i), l'eau plongeant objectif len (ii) et l'embryon électroporées intégré dans agarose bas point de fusion dans une boîte de culture à fond de verre (iii) (D ) Image tirée d'une aiguille et de coupe pour micro-injection d'ADN.

Figure 2. Cadres sélectionnés d'un 18-heures imagerie time-lapse direct confocale de l'embryon électroporation avec EF1α-GFF + SAMU-E1B-EGFP à 22 HPF. La surface du ventricule est sur le côté bas de chaque trame d'image. La barre d'échelle représente 10 um.

Discussion

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour imagerie time-lapse en direct de cellules progénitrices neurales au niveau clonal dans le prosencéphale poisson zèbre en développement. Nous avons testé et modifié les protocoles existants électroporation ^4-6 pour génétiquement et par fluorescence étiquette individuelle des cellules progénitrices neurales. Un arbre lignée composée de cellules par clonage progéniture connexes peuvent être mis en place depuis seulement quelques cellules ont été marqués avec un peu de tension relativement faible de l'électroporation. En plus de l'EGFP, les cellules progénitrices neurales peuvent être étiquetés subcellularly avec diverses protéines fluorescentes en remplaçant simplement EGFP avec d'autres marqueurs fluorescents. Par exemple, si EF1α-GFF a été co-électroporation avec UAS-E1B-memberane-EGFP et UAS-E1B-H2B-MRFP, les membranes de cellules progénitrices individuels seront étiquetés avec la protéine fluorescente verte tandis noyau sera étiqueté avec la protéine fluorescente rouge. La plupart des cellules progénitrices étiquetés sont en bonne santé comme en témoigne le développement général des embryons normaux et l'apoptose électroporées quelques observées pendant imagerie en temps réel. Il est également essentiel d'utiliser une faible concentration d'agarose pour monter l'embryon et d'utiliser un laser de puissance minimale lors de l'imagerie confocale direct pour maintenir les cellules saines. La technique actuelle peut également être appliquée à d'autres parties du système nerveux central tels que le cerveau postérieur et la moelle épinière. Cependant, cette technique ne peut être appliquée sur les embryons de moins de 18 HPF, puisque les constructions d'ADN doivent être injectées dans le ventricule pour l'électroporation.