Summary
Aqui nós descrevemos uma técnica de custo-benefício para a cultura de retina organotípicas suína adulto por sete dias. Resumidamente, um papel estéril filtro foi utilizado para levantar a retina neural fora do RPE e do lado coloque fotorreceptoras em cima uma inserção levantadas por um carrinho feito por encomenda.
Abstract
Há uma demanda reconhecida por modelos in vitro que podem substituir ou reduzir a experimentação animal. Retina suína tem uma estrutura semelhante neuronal a retina humana e, portanto, uma espécie valiosa para estudar mecanismos de lesão da retina humana e doenças degenerativas. Aqui nós descrevemos uma técnica de custo-benefício para a cultura de retina organotípicas suína adulto isolado de olhos obtido a partir de um matadouro. Após a remoção do segmento anterior, uma lâmina de trépano foi usado para criar múltiplas retina neural-Bruch membrana-RPE-coróide esclera-explantes do segmento posterior de olhos de porco adulto. Um pedaço de papel filtro estéril foi utilizada para levantar a retina neural off de cada explante. O complexo de papel-filtro retina foi cultivado (lado fotorreceptor para cima) em cima de uma inserção, que foi realizada longe do fundo do prato de cultura por um carrinho feito por encomenda. O stand permite uma boa circulação do meio de cultura para ambos os lados da retina. Globalmente, este procedimento é simples, reprodutível e permite a preservação da estrutura da retina nativo para pelo menos sete dias, tornando-se um modelo útil para uma variedade de estudos morfológicos, farmacológicos e bioquímicos na retina de mamíferos.
Protocol
1. Fazendo uma posição custom-made para inserções de cultura de células
A base de uma pipeta 5 ml ponta (ISC BioExpress, # P-3250-19) tem um diâmetro interno de 13 mm, o que combina perfeitamente com o tamanho inferior (12,6 mm, diâmetro externo) de um de 10 mm (diâmetro interno) de células NUNC inserir a cultura (8 mM, Policarbonato membrana, térmica, # 137443). Para fazer o suporte, a pipeta foi cortada perto da base para produzir de 6 mm longo cilindro oco. Então, as peças foram removidas do lado do cilindro usando uma lâmina chama-aquecido para criar três pernas (4 mm de altura) com um anel (2 mm de altura), que elevou a altura das inserções em cerca de 5 mm.
2. Preparação de papel de filtro estéril para penhora e cultura de retina suína
Whatman 4M papel de filtro (Cat. 1004) foi cortado em uma forma circular (6,3 mm de diâmetro) com uma alça, pequena triangular que foi usado para mover o papel de filtro para um tubo de vidro para esterilização ou uma vez que a retina foi unido (como mostrado no vídeo).
3. Preparação de explantes da retina
Olhos de 5 - a 9 meses de idade, 150-230 lbs, porcos americanos Yorkshire foram obtidas de um abatedouro local dentro de três horas de enucleação (transportadas em gelo). Após a chegada, os olhos foram limpos de tecido estranhos, mergulhados em solução de betadine (10% de povidona-iodo, A Purdue Empresa Frederique, Stamford, CT) e lavadas duas vezes em Modified Dulbecco Eagle Medium (DMEM com 1 g / L de glicose, L-glutamina, e piruvato de sódio, Cellgro-Mediatech Inc., Manassés, VA) suplementado com 2,5 mg / ml anfotericina B (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA). O segmento anterior foi removido, expondo a retina neural. Lâminas de seis milímetros trefina (Storz Ophthalmic-Bausch and Lomb, Manchester, MO) foram usados para cortar equatorial, de espessura total explantes segmento posterior. A retina foi posteriormente tirou delicadamente a aplicação de um pedaço de papel de filtro seco estéril para a camada de células ganglionares, desprendendo-se da retina neural, e colocando o papel de filtro com retina inscritos para a inserção da cultura, fotorreceptores voltada para cima. A pastilha foi então colocado em meio de cultura, certificando-se cobrir totalmente a retina, em uma placa de cultura de 12 poços (Fisher). Explantes múltiplos foram obtidos rotineiramente e cultivadas a partir de um único olho.
4. Cultura de tecidos
O tecido da retina foi cultivada em meio mínimo essencial de Eagle (MEM, Gibco-Invitrogen-Life Technologies Inc., Rockville, MD), pH 7,4, suplementado com 0,2 mg / ml de glutamina, 10 de insulina suína mcg / ml, 1 mM de piruvato, 0,1 mM de ácido L-ascórbico, 100 U / ml de penicilina, estreptomicina 100 mg / ml e 250 ng / ml anfotericina B (antibiótico antimicótico: Sigma, St. Louis, MO), e aerada com umidificado 5% de CO 2, ar, equilíbrio a 37 ° C. Meio foi trocado a cada dois dias.
Tecidos podem ser usados, tratados com uma variedade de reagentes ou sondas, ou deixados sem tratamento para posterior análises bioquímicas ou morfológicas. A seção abaixo descreve os procedimentos para criar consistente espessura total da retina seções transversais.
5. Seccionamento
- Usando um Criostato
- Fix tecido da retina em parafomaldehyde 4% durante a noite a 4 ° C;
- Enxaguar tecido brevemente com tampão fosfato salino (PBS);
- Remova cuidadosamente o tecido do papel de filtro enquanto ele está em PBS em um prato de 35 mm, utilizando um microscópio de dissecação;
- Transferência de tecido para sacarose 30% e manter durante a noite a 4 ° C;
- Sucção afastado o excesso de solução em todo o tecido, adicione suficiente Tissue-Tek médio (OCT Compound 4583) para cobrir o tecido, e deixe de molho em temperatura ambiente por 2 horas a permear o tecido;
- Construir uma moldura quadrada (10 mm x 10mm, 5 mm de altura) com cera dental e coloque-o em volta do tecido; adicionar mais meio Tissue-Tek para preencher o quadro (certifique-se a amostra de tecido é plana) e colocar em um freezer (- 20 ° C) durante pelo menos 1 hora;
- Transferência do bloco de amostra congelada a uma plataforma de amostra (certifique-se o bloco de amostra é vertical para a plataforma);
- Montar a plataforma de exemplo em um criostato pré-resfriado (-20 ° C, Leica, CM1900) e certifique-se o bloco é vertical para a lâmina;
- Remover a cera eo bloco de quadros antes do corte do tecido na espessura desejada;
- Coloque as seções sobre gelatina tratados com slides.
- Usando um Vibratome
- Fix e lavar o tecido, como descrito acima para o Criostato;
- Coloque o tecido em pré-aquecido, agar derretido 4% em um pequeno recipiente e manter a 4 ° C até o agar congela completamente;
- Use uma lâmina afiada para cortar o agar em um pequeno bloco com a amostra de tecido para dentro;
- Bloco cola a amostra em um porta-amostras vibratome com cola Krazy (certifique-se o pedaço de amostra de tecido é vertical para a plataforma de the porta-amostras, ou seja, perpendicular à lâmina) e montar o titular em um sistema vibratome seccionamento (Leica, Série 1000) com o bloco de amostra completamente submerso em água gelada;
- Corte o bloco de amostra em 50 seções mm e colocá-los em gelatina tratados com slides com uma escova macia.
6. Imuno-histoquímica
Usar qualquer protocolo padrão. Immunolabeled de espessura podem ser vistos com um microscópio confocal.
7. Resultados representativos:
Morfologia foi preservada durante o período de sete dias de cultura. Imagens da retina antes e após o cultivo estão disponíveis no vídeo.
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Discussion
Pesquisadores visão criaram uma variedade de sistemas de cultura da retina, incluindo sistemas de organotípicas, para estudar uma variedade de questões, tais como o transplante de células-tronco da retina 1, a regeneração da retina 2, e expressão de genes exógenos 3-5. No entanto, a retina de mamíferos adultos é difícil manter in vitro, principalmente devido à alta demanda de energia dos 6 fotorreceptores. Koizumi et al. Descrito um sistema de cultura de coelho da retina organotípicas em que o suprimento de oxigênio para fotorreceptores foi melhorado através do aumento da altura da inserção da cultura e agitar o meio de cultura. Eles conseguiram manter tecidos adultos da retina por até seis dias 4,5. Kobuch et al. Descrito um sistema de cultura de perfusão para a retina suínos adultos e epitélio pigmentar da retina (EPR) e foram capazes de manter o tecido organotípicas por pelo menos 10 dias 7. No entanto, o procedimento para preparar as folhas de retina, coróide-RPE para a manipulação laboratorial foi complicada e exigiu ferramentas especiais. Além disso, cada explante exigido seu sistema de perfusão próprias decisões em cultura in vitro de amostras de tecidos múltiplos incômodos. . KAEMPF et al criado com sucesso outro modelo de cultura de retina de mamíferos organotípicas adulto neurossensorial em co-cultura com RPE mas apenas mostrou os resultados de uma cultura de 3 dias, a sobrevivência a longo prazo do tecido não foi testado 8.
Neste manuscrito, descrevemos um protocolo simples e reprodutível para a cultura de retina organotípicas suína adulto neural adoptar uma abordagem semelhante ao descrito anteriormente para retina de coelho 4 com as seguintes características:
- Criação de uma técnica simples para fazer um carrinho personalizado para elevar a altura da inserção da cultura, garantindo suprimento de oxigênio bom para o explante retina inteiras. Usando a 5 ml ponta da pipeta para criar o suporte garante que o suporte pode ser autoclavado e que a altura pode ser ajustada, se desejar.
- Cultura da retina com a camada de fotorreceptores virado para cima, ao contrário da camada de células ganglionares. Desta forma, os fotorreceptores tenham maior acesso ao oxigênio e agitação para impulsionar ainda mais o fornecimento de oxigênio não é necessário.
- Minimização do trauma mecânico. Os explantes da retina são anexados ao papel de filtro estéril antes de descascar-los do RPE e depois são cultivadas no papel de filtro, reduzindo o estresse mecânico sobre o tecido e evitar curling retina.
- Consistência no tamanho de explantes de retina. Porque um trépano é utilizado para criar os explantes, cada explante de retina é do mesmo tamanho, tornando mais fácil comparar os resultados de vários tratamentos.
- Preservação da morfologia. Estrutura da retina suína neste sistema de cultura permanece intacta por pelo menos sete dias.
Dado que a retina humana e suína são muito semelhantes em termos de distribuição de células e morfologia, padrão vascular, espessura da camada, e outras características fisiológicas 9,10, a cultura organotípicas de retina suína fornece um modelo animal atrativo para estudar as manifestações de doenças da retina humana, degenerações, e lesões. Este sistema pode ser particularmente importante nos casos em experimentos in vitro na retina humana são impossíveis de realizar, devido, em parte, à falta de alta qualidade tecido humano.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder EY 012.031 (ET-A), um prêmio da Fundação FM Kirby (ET-A), para prevenir a cegueira Research, Inc. (MAZ), The New Jersey Lions Eye Research Foundation (MAZ), O Instituto Eye of New Jersey (MAZ), o J. Joseph e Marguerite Retina DiSepio Research Fund (MAZ), eo Vassar e Janice Mitchell Mitchell Ashby Clube (AMK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal Scientific, Inc. | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1900 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss, Inc. | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | Dako | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 |
References
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