Summary
כאן אנו מתארים שיטה חסכונית לתרבות organotypic של הרשתית חזירי הבוגרת במשך שבעה ימים. בקצרה, נייר סינון סטרילי שימש להרים את הרשתית העצבית מן הרשתית ואת photoreceptor מקום על הצד להוסיף שהעלו לעמוד מחוייט.
Abstract
יש ביקוש מוכר במודלים חוץ גופית זה יכול להחליף או לצמצם את הניסויים בבעלי חיים. הרשתית חזירי יש מבנה עצבי דומה הרשתית האנושית ולכן הוא זן בעל ערך לחקר המנגנונים של פגיעה ברשתית האנושית מחלה ניוונית. כאן אנו מתארים שיטה חסכונית לתרבות organotypic של הרשתית חזירי מבוגר מבודד מעיני המתקבל מטבחיים. לאחר הסרת פלח קדמי, להב המקדחה נעשה שימוש כדי ליצור מספר רב של עצבי הרשתית, ברוך קרום הרשתית, דמית העין, בלובן העין של explants מן קטע האחורי של העיניים חזירי מבוגר. פיסת נייר סינון סטרילי שימש להרים את הרשתית העצבית מן explant כל אחד. המתחם מסנן נייר הרשתית היה מתורבת (צד photoreceptor ומעלה) על גבי להוסיף, שהתקיים הרחק בתחתית הצלחת לעמוד על ידי תרבות מחוייט. לעמוד מאפשרת זרימת טוב של המדיום תרבות על שני הצדדים של הרשתית. ככלל, הליך זה הוא פשוט, לשחזור, ומאפשרת שימור של מבנה הרשתית יליד לפחות שבעה ימים, מה שהופך אותו מודל שימושי עבור מגוון רחב של מחקרים מורפולוגיים, תרופתי, ו ביוכימי על הרשתית יונקים.
Protocol
1. ביצוע לעמוד בהזמנה אישית עבור מוסיף תרבית תאים
הבסיס של 5 מ"ל פיפטה קצה (ISC BioExpress, # P-3250-19) הוא בעל קוטר פנימי של 13 מ"מ, אשר בהחלט מתאים לגודל התחתון (12.6 מ"מ, קוטרו החיצוני) של 10 מ"מ (קוטר פנימי) תא NUNC הכנס תרבות (8 מיקרומטר, פוליקרבונט הממברנה, תרמי, # 137443). כדי להפוך את העמדה, פיפטה נותק סמוך לבסיס כדי לייצר גליל 6 מ"מ חלול ארוך. ואז, הוסרו חלקים מהצד של גליל באמצעות להב להבה מחוממים כדי ליצור 3 רגליים (4 מ"מ גובה) תחת טבעת (2 מ"מ גובה), אשר העלה את גובה הכנסות על ידי כ 5 מ"מ.
2. הכנת נייר סינון סטרילי עבור התקשרות והתרבות של הרשתית חזירי
Whatman 4M נייר סינון (חתול מס '1004) נחתך לצורה עגולה (6.3 מ"מ קוטר) עם ידית, משולש קטן ששימש להעברת הנייר לסנן לתוך שפופרת זכוכית עבור עיקור או פעם הרשתית צורף (כמו המוצג בסרטון).
3. הכנת explants רשתית
עיניים מ - 5 חודשים-9 הישן, 150-230 ק"ג, אמריקן חזירים יורקשייר התקבלו שחיטה מקומית בתוך שלוש שעות של enucleation (מועבר על הקרח). עם ההגעה, העיניים נוקו של רקמת זרים, טבול פתרון בבטאדין (10% Povidone-יוד, החברה פרדריק פרדו, סטמפורד, CT) ורחץ פעמיים השתנה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM עם גלוקוז 1g / L, L-גלוטמין, ו pyruvate נתרן, Cellgro-mediatech Inc, Manasses, VA) בתוספת 2.5 מיקרוגרם / מ"ל amphotericin B (Gibco-Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה). פלח קדמי הוסר, חשיפת הרשתית העצבית. ששת מ"מ להבים המקדחה (Storz עיניים, באוש לומב, מנצ'סטר, MO) שימשו לחתוך המשוונית, עובי מלא explants קטע האחורי. הרשתית היה קלופים לאחר מכן את ידי בעדינות החלת פיסת נייר יבש מסנן סטרילי על שכבת תא הגנגליון, מרימים את הרשתית העצבית, ומעמידים את הנייר עם מסנן הרשתית מחוברים על להכניס את התרבות, photoreceptors פונה כלפי מעלה. הכנס הושם מכן לתוך בינוני תרבות, והקפד לכסות באופן מלא את הרשתית, בצלחת 12 גם תרבות (פישר). Explants מרובים הושגו שגרתי תרבותי מן העין אחת.
4. רקמות תרבות
רקמת הרשתית היה בתרבית בינוני Essential Minimum הנשר (ממ, Invitrogen-Gibco-Life טכנולוגיות בע"מ, Rockville, MD), pH 7.4, בתוספת 0.2 מ"ג / מ"ל גלוטמין, 10 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין חזירי, pyruvate 1 מ"מ, 0.1 L-חומצה אסקורבית מ"מ, 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו 250 ng / ml amphotericin B (אנטיביוטי Antimycotic: Sigma, סנט לואיס, מיזורי), ואת סודה עם 5% CO 2 humidified, האוויר איזון, בשעה 37 ° C. בינוני הוחלפה כל יומיים.
רקמות יכול לשמש, מטופלים עם מגוון רחב של חומרים כימיים או בדיקות, או מטופל עבור ניתוחים ביוכימיים או מורפולוגיים הבאים. הקטע שלהלן מתאר את הנהלים כדי ליצור עקביות עובי הרשתית מלא חתכים.
5. חתך
- שימוש cryostat
- תיקון רקמת הרשתית ב parafomaldehyde 4% בין לילה ב 4 מעלות צלזיוס;
- יש לשטוף את רקמת בקצרה עם פוספט שנאגרו מלוחים (PBS);
- בזהירות להסיר את הרקמה מנייר מסנן בזמן שהוא ב-PBS בצלחת 35 מ"מ באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה;
- העברת רקמות סוכרוז 30% ולשמור לילה ב 4 מעלות צלזיוס;
- יניקה משם את הפתרון עודף סביב הרקמה, להוסיף מספיק רקמות-Tek בינוני (מתחם אוקטובר 4583) כדי לכסות את הרקמה, ולתת לו להשרות בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות לחדור רקמות;
- בניית מסגרת רבועה (10 מ"מ x 10 מ"מ, גובה 5 מ"מ) עם שעווה שיניים למקם אותו סביב הרקמה; להוסיף יותר רקמות-Tek בינוני כדי למלא את המסגרת (לוודא את דגימת רקמות שטוחה) ומניחים במקפיא (- 20 ° C) לפחות שעה 1;
- מעבירים את גוש מדגם קפוא פלטפורמה מדגם (לוודא לחסום מדגם אנכי לבמה);
- הר פלטפורמה מדגם cryostat מראש מקורר (-20 ° C, לייקה, CM1900) ולוודא לחסום הוא אנכי להב;
- הסרת שעווה לחסום מסגרת לפני חתך את הרקמה על עובי הרצוי;
- מניחים את הסעיפים על ג'לטין שטופלו שקופיות.
- שימוש Vibratome
- תקן ולשטוף את הרקמה כפי שתואר לעיל עבור cryostat;
- הנח את רקמת לתוך אגר, מחומם מראש 4% מומס במיכל קטן ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד נקרש אגר לחלוטין;
- השתמש בלהב חד לחתוך את אגר לגוש קטן עם מדגם רקמות בפנים;
- ההדבקה מדגם בלוק על בעל מדגם vibratome בדבק מגע עם דבק (לוודא את פיסת רקמה מדגם אנכי לפלטפורמה של הדואר בעל המדגם, כלומר, בניצב להב) ואת הר בעל חתך על מערכת vibratome (לייקה, סדרה 1000) עם לחסום את המדגם שקוע לחלוטין במי קרח;
- חותכים את גוש מדגם לתוך 50 מיקרומטר חלקים ומניחים אותם על ג'לטין שטופלו שקופיות עם מברשת רכה.
6. אימונוהיסטוכימיה
השתמש בכל הפרוטוקול הסטנדרטי. חלקים עבים Immunolabeled ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ confocal.
7. נציג תוצאות:
מורפולוגיה השתמרה במשך שבעת הימים של התרבות. תמונות של הרשתית לפני ואחרי culturing זמינים הווידאו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
החוקרים Vision הקימו מגוון רחב של מערכות תרבות ברשתית, כולל מערכות organotypic, ללמוד מגוון רחב של נושאים, כגון תא גזע השתלת רשתית 1, התחדשות הרשתית 2, ביטוי גנים אקסוגניים 3-5. עם זאת, הרשתית יונקים בוגרים קשה לשמור במבחנה, בעיקר בשל אנרגיה גבוהה לדרישות photoreceptors 6. קואיזומי et al. תיאר מערכת ארנב רשתית תרבות organotypic שבה אספקת החמצן עבור photoreceptors היה להשתפר על ידי העלאת גובה להכניס את תרבות להסעיר את המדיום לתרבות. הם שמרו בהצלחה רקמת הרשתית מבוגר עד שישה ימים 4,5. Kobuch et al. תיאר מערכת התרבות זלוף עבור הרשתית חזירי מבוגרים אפיתל הפיגמנט ברשתית (הרשתית) והם מסוגלים לשמור על רקמת organotypic במשך לפחות 10 ימים 7. עם זאת, ההליך להכנת הרשתית, הרשתית, דמית העין יריעות מניפולציה מעבדה היה מסובך נדרש כלים מיוחדים. בנוסף, נדרש כל explant מערכת זלוף משלה מה שהופך בתרבות במבחנה של דגימות רקמה מרובים מסורבלת. . Kaempf ואח' נוצר בהצלחה מודל אחר תרבות organotypic של הרשתית מבוגר נוירו יונקים בתרבות בשיתוף עם הרשתית אלא רק הראה תוצאות לתרבות 3 ימים, את ההישרדות לטווח ארוך של הרקמה לא נבדק 8.
בכתב היד הזה, אנו מתארים פרוטוקול פשוט לשעתקו לתרבות organotypic של הרשתית חזירי מבוגר עצביים לאמץ גישה דומה לזה שתואר קודם לכן עם התכונות הבאות עבור הרשתית ארנב 4:
- יצירה של טכניקה פשוטה לעשות עמדה אישית להעלות את גובה להכניס את התרבות, כדי להבטיח אספקת חמצן טובה explant הרשתית כולה. בעזרת קצה 5 מ"ל פיפטה כדי ליצור את לעמוד מבטיח כי ניתן לעמוד autoclaved וכי גובה ניתן להתאים לפי הצורך.
- תרבות של הרשתית עם שכבת photoreceptor כלפי מעלה, לעומת שכבת תא גנגליון. בדרך זו, photoreceptors גדלו גישה חמצן, תסיסה נוספת להגביר את אספקת החמצן אינה הכרחית.
- מזעור הטראומה מכני. Explants הרשתית מחוברים נייר מסנן סטרילי לפני קילוף מהם הרשתית, ולאחר מכן הם מתורבתים על נייר הסינון, ובכך להפחית את הלחץ המכני על הרקמה ומניעת סלסול הרשתית.
- עקביות בגודל של explants הרשתית. מכיוון המקדחה משמש כדי ליצור את explants, כל explant הרשתית הוא בגודל זהה, ובכך קל להשוות את התוצאות של הטיפולים השונים.
- שימור מורפולוגיה. מבנה הרשתית חזירי במערכת זו התרבות נשאר שלם לפחות שבעה ימים.
בהתחשב בכך חזירי ו הרשתית האדם דומים מאוד מבחינת חלוקת התא, מורפולוגיה, דפוס וסקולרית, עובי השכבה, מאפיינים פיזיולוגיים אחרים 9,10, תרבות organotypic של הרשתית חזירי מספק מודל החיה אטרקטיבי עבור הלומדים גילויים של מחלות רשתית האדם, degenerations, ופציעות. מערכת זו עשויה להיות חשובה במיוחד במקרים בהם בניסויים במבחנה על הרשתית האדם ניתן לבצע עקב, בין השאר, חוסר רקמה באיכות גבוהה האנושי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק EY 012,031 (ET-A), פרס קרן קירבי FM (ET-A), מחקר למניעה, עיוורון Inc (MAZ), ניו ג'רזי האריות Eye Research Foundation (MAZ), מכון עיניים של ניו ג'רזי (MAZ), את ג'יי ג'וזף מרגריט DiSepio רשתית מחקר קרן (MAZ), ואת מיטשל ג'ניס ואסאר ואשבי מיטשל Fellowship (AMK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal Scientific, Inc. | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1900 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss, Inc. | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | Dako | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 |
References
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3503-3512 (2008).
- Kretz, A., Marticke, J. K., Happold, C. J., Schmeer, C., Isenmann, S. A primary culture technique of adult retina for regeneration studies on adult CNS neurons. Nat Protoc. 2, 131-140 (2007).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).
- Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult mammalian retinas. PLoS One. 2, e221-e221 (2007).
- Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic culture of adult rabbit retina. J Vis Exp. , (2007).
- Ames, A., Li, Y. Y. 3rd, Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. J Neurosci. 12, 840-853 (1992).
- Kobuch, K. Maintenance of adult porcine retina and retinal pigment epithelium in perfusion culture: characterisation of an organotypic in vitro model. Exp Eye Res. 86, 661-668 (2008).
- Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. J Neurosci Methods. 173, 47-58 (2008).
- Guduric-Fuchs, J. Immunohistochemical study of pig retinal development. Mol Vis. 15, 1915-1928 (2009).
- Chandler, M. J., Smith, P. J., Samuelson, D. A., MacKay, E. O. Photoreceptor density of the domestic pig retina. Vet Ophthalmol. 2, 179-184 (1999).
