Summary
यहाँ हम सात दिनों के लिए एक लागत प्रभावी वयस्क सुअर का रेटिना के organotypic संस्कृति के लिए तकनीक का वर्णन. संक्षेप में, एक बाँझ फिल्टर पेपर RPE और एक कस्टम बनाया एक स्टैंड द्वारा उठाए गए डालने पर जगह फोटोरिसेप्टर ऊपर की ओर से तंत्रिका रेटिना लिफ्ट बंद करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
Abstract
इन विट्रो मॉडल में एक मान्यता प्राप्त के लिए मांग है कि जगह या पशु प्रयोगों को कम कर सकते हैं. सुअर रेटिना एक समान मानव रेटिना neuronal संरचना है और इसलिए मानव रेटिना चोट और अपक्षयी रोग के तंत्र के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण प्रजाति है. यहाँ हम वयस्क सुअर का एक बूचड़खाने से प्राप्त आँखों से अलग रेटिना के organotypic संस्कृति के लिए एक लागत प्रभावी तकनीक का वर्णन. पूर्वकाल खंड को हटाने के बाद, एक trephine ब्लेड कई तंत्रिका रेटिना Bruch है वयस्क सुअर आँखों के पीछे खंड से झिल्ली RPE रंजित - श्वेतपटल explants बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. बाँझ फिल्टर पेपर के एक टुकड़े प्रत्येक explant से तंत्रिका रेटिना से लिफ्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. फिल्टर कागज रेटिना जटिल (फोटोरिसेप्टर ऊपर की ओर) एक सम्मिलित करते हैं, जो संस्कृति डिश के नीचे से दूर कस्टम बनाया एक स्टैंड द्वारा आयोजित किया गया था के ऊपर संवर्धित किया गया था. खड़े रेटिना के दोनों पक्षों के लिए संस्कृति के माध्यम से अच्छी परिसंचरण के लिए अनुमति देता है. कुल मिलाकर, यह प्रक्रिया सरल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और कम से कम सात दिन के लिए देशी रेटिना संरचना के संरक्षण परमिट, यह स्तनधारी रेटिना पर morphological, औषधीय, और जैव रासायनिक अध्ययन के एक किस्म के लिए एक उपयोगी मॉडल बनाने.
Protocol
1. सेल संस्कृति आवेषण के लिए एक कस्टम स्टैंड बनाना
एक 5 मिलीलीटर विंदुक टिप (आईएससी BioExpress, पी 3250 के-19 #) के आधार पर 13 मिमी है, जो पूरी तरह से एक 10 मिमी के नीचे (12.6 मिमी, बाहरी व्यास) आकार (भीतरी व्यास) NUNC सेल मैच की एक आंतरिक व्यास है संस्कृति डालने (8 सुक्ष्ममापी, Polycarbonate झिल्ली, थर्मल, +१३७४४३ #). स्टैंड बनाने के लिए, पिपेट बंद बेस के पास काट दिया गया एक 6 मिमी लंबे समय खोखले सिलेंडर का उत्पादन. फिर, टुकड़े सिलेंडर की तरफ से हटा दिया गया एक लौ गर्म (ऊंचाई में 2 मिमी) की अंगूठी, जो लगभग 5 मिमी द्वारा आवेषण की ऊंचाई उठाया के तहत 3 पैर (ऊंचाई में 4 मिमी) बनाने ब्लेड का उपयोग.
2. बाँझ फिल्टर पेपर के लगाव और सुअर रेटिना की संस्कृति के लिए तैयार
वाटमान 4M फ़िल्टर कागज (बिल्ली सं 1004) एक छोटे, त्रिकोणीय संभाल कि एक ग्लास ट्यूब में बंध्याकरण के लिए या एक बार रेटिना संलग्न था फिल्टर पेपर जाने के लिए इस्तेमाल किया गया था के साथ एक गोल आकार (व्यास में 6.3 मिमी) में (के रूप में काट दिया गया वीडियो में दिखाया गया है).
3. रेटिना explants तैयार
5 से आंखें - पुराने, 150-230 एलबीएस 9 महीने के लिए, अमेरिकन यॉर्कशायर सूअरों enucleation के तीन घंटे के भीतर एक स्थानीय वधशाला (बर्फ पर पहुँचाया) से प्राप्त किया गया. आगमन पर, आंखों के बाहरी ऊतक का साफ कर रहे थे, betadine समाधान (10% Povidone आयोडीन, पर्ड्यू Frederique कंपनी, Stamford, सीटी) में डूबा हुआ है और Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (1g / एल ग्लूकोज के साथ DMEM, एल glutamine में दो बार धोया, और सोडियम पाइरूवेट, Cellgro mediatech इंक, Manasses, VA) के 2.5 μg / एमएल Amphotericin बी (Gibco Invitrogen, Carlsbad, सीए) के साथ पूरक है. पूर्वकाल खंड हटाया, तंत्रिका रेटिना को उजागर किया गया था. छह मिमी trephine ब्लेड (Storz ऑप्थाल्मिक Bausch और Lomb, मैनचेस्टर, MO) भूमध्यवर्ती, पूर्ण मोटाई पीछे खंड explants में कटौती करने के लिए इस्तेमाल किया गया. रेटिना बाद नाड़ीग्रन्थि सेल परत पर धीरे सूखी बाँझ फिल्टर पेपर के एक टुकड़े को लागू करने, बंद तंत्रिका रेटिना उठाने, और संस्कृति डालने पर संलग्न रेटिना के साथ फिल्टर पेपर रखने, photoreceptors सामना करना पड़ रहा था से खुली. डालने संस्कृति माध्यम में फिर रखा गया था, पूरी तरह से रेटिना को कवर सुनिश्चित करने के 12 अच्छी तरह से एक संस्कृति डिश (फिशर) में. एकाधिक explants नियमित रूप से प्राप्त किया गया और एक एकल आंख से सुसंस्कृत.
4. टिशू कल्चर
रेटिना ऊतक ईगल के न्यूनतम आवश्यक मध्यम में संवर्धित किया गया था (सदस्य, Invitrogen - Gibco जीवन टेक्नोलॉजीज इंक, रॉकविल, एमडी), पीएच 7.4, 0.2 मिलीग्राम / एमएल glutamine, 10 सुअर का μg / मिलीलीटर इंसुलिन, 1 मिमी पाइरूवेट, 0.1 के साथ पूरक मिमी एल ascorbic एसिड, 100 U / मिलीलीटर पेनिसिलिन, 100 / μg मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 250 एनजी / एमएल amphotericin बी (एंटीबायोटिक Antimycotic: सिग्मा, सेंट लुइस, MO), और humidified 5% सीओ 2, संतुलन हवा के साथ वातित 37 में डिग्री सेल्सियस मध्यम हर दो दिन का आदान - प्रदान किया गया था.
ऊतक, इस्तेमाल किया जा सकता अभिकर्मकों या जांच की एक किस्म के साथ इलाज, या बाद में जैव रासायनिक या morphological विश्लेषण के लिए अनुपचारित छोड़ दिया. अनुभाग के नीचे प्रक्रियाओं का वर्णन करने के लिए संगत पूर्ण मोटाई रेटिना पार वर्गों बनाने.
5. सेक्शनिंग
- एक cryostat का उपयोग
- 4% parafomaldehyde में 4 पर रेटिना ऊतक रातोंरात ठीक डिग्री सेल्सियस;
- ऊतक संक्षिप्त कुल्ला के साथ फॉस्फेट खारा (पीबीएस) buffered;
- ध्यान से फिल्टर पेपर से ऊतक निकालने, जबकि यह एक 35 मिमी एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग पकवान में पीबीएस में है;
- स्थानांतरण 30% sucrose के लिए ऊतक और 4 में रात भर रखने डिग्री सेल्सियस;
- दूर ऊतक के आसपास अतिरिक्त समाधान सक्शन, पर्याप्त ऊतक टेक मध्यम (OCT 4583 यौगिक) जोड़ने के लिए ऊतक कवर, और यह कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सोख करने के लिए ऊतक तर;
- दंत मोम के साथ एक वर्ग फ्रेम (10 मिमी x 10mm, 5 मिमी ऊंचाई) बनाएँ और यह ऊतक के आसपास जगह, अधिक मध्यम ऊतक टेक जोड़ने (यकीन है कि ऊतक का नमूना फ्लैट है) एक फ्रीजर में और फ्रेम जगह को भरने के (- 20 ° C) कम से कम 1 घंटे के लिए;
- एक नमूना मंच (सुनिश्चित करें कि नमूना ब्लॉक मंच करने के लिए खड़ी है) जमी नमूना ब्लॉक स्थानांतरण;
- एक पूर्व ठंडा cryostat में नमूना मंच पर्वत (-20 डिग्री सेल्सियस, Leica, CM1900) और सुनिश्चित करें कि ब्लॉक ब्लेड के लिए खड़ी है;
- मोम और इच्छित मोटाई में ऊतकों सेक्शनिंग से पहले फ्रेम ब्लॉक निकालें;
- जिलेटिन इलाज स्लाइड्स पर वर्गों रखें.
- एक Vibratome का उपयोग
- फिक्स और कुल्ला cryostat के लिए ऊतक के रूप में ऊपर वर्णित;
- पूर्व गर्म, एक छोटे कंटेनर में पिघल 4% अगर में ऊतक प्लेस और पूरी तरह से 4 डिग्री सेल्सियस तक अगर congeals रखने;
- ऊतक अंदर नमूना के साथ एक छोटी सी ब्लॉक में अगर ट्रिम एक तेज ब्लेड का प्रयोग करें;
- गोंद Krazy गोंद के साथ एक vibratome नमूना धारक (सुनिश्चित करें कि ऊतक नमूने का टुकड़ा वीं के मंच करने के लिए खड़ी है पर नमूना ब्लॉकई नमूना धारक, यानी सीधा, ब्लेड के लिए) और नमूना पूरी तरह से बर्फीले पानी में डूबे हुए ब्लॉक के साथ एक vibratome सेक्शनिंग प्रणाली (Leica, 1000 श्रृंखला) पर धारक माउंट;
- नमूना ब्लॉक 50 सुक्ष्ममापी वर्गों में काटें और जिलेटिन इलाज स्लाइड्स पर एक नरम ब्रश के साथ उन्हें जगह.
6. Immunohistochemistry
किसी भी मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करें. Immunolabeled मोटी वर्गों एक confocal खुर्दबीन के साथ देखा जा सकता है है.
7. प्रतिनिधि परिणाम:
आकृति विज्ञान संस्कृति की सात दिन की अवधि के दौरान संरक्षित रखा किया गया था. रेटिना के पहले और बाद संवर्धन छवियाँ वीडियो में उपलब्ध हैं.
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Discussion
विजन शोधकर्ताओं रेटिना संस्कृति प्रणालियों की एक किस्म की स्थापना की है organotypic प्रणाली, रेटिना स्टेम सेल प्रत्यारोपण 1, रेटिना 2 उत्थान, और exogenous जीन अभिव्यक्ति 3-5 जैसे मुद्दों की एक किस्म का अध्ययन सहित . हालांकि, वयस्क स्तनधारी रेटिना इन विट्रो में बनाए रखने के लिए मुश्किल है, मुख्य रूप से 6 photoreceptors के उच्च ऊर्जा की मांग के कारण है. कोइज़ुमी एट अल. एक खरगोश रेटिना organotypic संस्कृति प्रणाली में जो photoreceptors के लिए ऑक्सीजन की आपूर्ति संस्कृति डालने की ऊंचाई को ऊपर उठाने और संस्कृति के माध्यम आंदोलन द्वारा ameliorated किया गया था वर्णित है. वे सफलतापूर्वक के लिए छह दिनों 4,5 वयस्क रेटिना ऊतक बनाए रखा. Kobuch एट अल. वयस्क सुअर का रेटिना और रेटिना वर्णक उपकला (RPE) के लिए एक छिड़काव संस्कृति प्रणाली का वर्णन करने के लिए कम से कम 10 7 दिनों के लिए organotypic ऊतक बनाए रखने में सक्षम थे. हालांकि, प्रयोगशाला हेरफेर के लिए रेटिना RPE - रंजित शीट तैयार करने के लिए प्रक्रिया जटिल और विशेष उपकरणों की आवश्यकता है. इसके अलावा, प्रत्येक explant अपने स्वयं के छिड़काव प्रणाली एकाधिक ऊतक नमूनों बोझिल की इन विट्रो संस्कृति में बनाने की आवश्यकता है. . Kaempf एट अल सफलतापूर्वक वयस्क RPE के साथ स्तनधारी सह संस्कृति में neurosensory रेटिना की एक और organotypic संस्कृति मॉडल बनाया है, लेकिन केवल एक 3 दिन की संस्कृति के लिए नतीजे बताते हैं, ऊतक के दीर्घकालिक अस्तित्व 8 परीक्षण नहीं किया गया था.
इस पांडुलिपि में, हम वयस्क सुअर तंत्रिका रेटिना पहले खरगोश रेटिना 4 के लिए निम्नलिखित विशेषताओं के साथ वर्णित कि इसी तरह के दृष्टिकोण अपनाने के organotypic संस्कृति के लिए एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल का वर्णन:
- संस्कृति डालने की ऊंचाई बढ़ाने के लिए, पूरे रेटिना explant के लिए अच्छा ऑक्सीजन की आपूर्ति सुनिश्चित करने के लिए एक कस्टम स्टैंड बनाने के लिए एक सरल तकनीक का निर्माण. एक 5 मिलीलीटर विंदुक टिप का उपयोग करने के लिए खड़े बनाने का आश्वासन दिया है कि स्टैंड और autoclaved किया जा सकता है कि ऊंचाई समायोजित किया जा सकता है अगर वांछित.
- फोटोरिसेप्टर ऊपर सामना करना पड़ रहा है, नाड़ीग्रन्थि सेल परत करने के लिए विरोध के रूप में परत के साथ रेटिना की संस्कृति. इस रास्ते में, photoreceptors ऑक्सीजन के उपयोग में वृद्धि हुई है, और आंदोलन करने के लिए आगे ऑक्सीजन की आपूर्ति को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक नहीं है.
- यांत्रिक आघात के न्यूनतम. उन्हें RPE से छीलने से पहले बाँझ फिल्टर पेपर के लिए रेटिना explants जुड़े होते हैं और फिर फिल्टर पेपर पर सुसंस्कृत हैं, जिससे ऊतक पर यांत्रिक तनाव को कम करने और रेटिना कर्लिंग को रोकने.
- रेटिना explants के आकार में निरंतरता. क्योंकि एक trephine explants बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है, प्रत्येक रेटिना explant एक ही आकार के है, जिससे विभिन्न उपचार के परिणामों की तुलना करने के लिए इसे आसान बना.
- आकारिकी का संरक्षण. कम से कम सात दिन के लिए इस संस्कृति प्रणाली में सुअर का रेटिना की संरचना बरकरार है.
यह देखते हुए कि सुअर और मानव रेटिना सेल वितरण और आकारिकी, संवहनी पैटर्न, परत मोटाई, और अन्य शारीरिक विशेषताओं 9,10 के मामले में बहुत समान हैं, सुअर रेटिना के organotypic संस्कृति मानव रेटिना रोगों की अभिव्यक्तियों के अध्ययन के लिए एक आकर्षक पशु मॉडल उपलब्ध कराता है, degenerations, और चोटों. इस प्रणाली विशेष रूप से महत्वपूर्ण मामलों में जहां मानव रेटिना पर इन विट्रो प्रयोगों में कारण, भाग में, उच्च गुणवत्ता वाले मानव ऊतक की कमी के लिए प्रदर्शन करने के लिए असंभव है हो सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम NIH अनुदान 012031 EY (एट ए), एफएम Kirby फाउंडेशन (एट ए), अनुसंधान से एक पुरस्कार दृष्टिहीनता, (MAZ) इंक, न्यू जर्सी लायंस नेत्र अनुसंधान फाउंडेशन (MAZ) को रोकने के द्वारा समर्थित किया गया था, न्यू जर्सी (MAZ), यूसुफ जे और गुलबहार DiSepio रेटिना रिसर्च फंड (MAZ), जेनिस और मिशेल वासर और एश्बी मिशेल फैलोशिप (AMK) के नेत्र संस्थान.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal Scientific, Inc. | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1900 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss, Inc. | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | Dako | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 |
References
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