Summary
Här beskriver vi en kostnadseffektiv teknik för organotypic kultur av vuxna svin näthinnan i sju dagar. Kortfattat var ett sterilt filter papper som används för att lyfta neurala näthinnan av från RPE och placera fotoreceptor sidan uppåt på ett sätt upp av en skräddarsydd monter.
Abstract
Det finns ett erkänt behov av in vitro-modeller som kan ersätta eller minska djurförsök. Svin näthinna har en liknande neuronal struktur för människors näthinnan och är därför en värdefull art för att studera mekanismer för mänskliga retinal skada och degenerativa sjukdomar. Här beskriver vi en kostnadseffektiv teknik för organotypic kultur av vuxna svin näthinnan isolerade från ögon från ett slakteri. Efter att det främre segmentet, var en trephine blad används för att skapa flera neurala näthinnans-Bruch membran-RPE-koroidea-sklera explants från det bakre segmentet av vuxna svin ögon. En bit av sterila filterpapper användes för att lyfta neurala näthinnan borta från Explantation. Filtret papper näthinnan komplex var odlade (fotoreceptor uppåt) på toppen av en insats, som hölls borta från botten av kulturen skålen genom en skräddarsydd monter. Stativet tillåter god cirkulation av substratet till båda sidor av näthinnan. Sammantaget är detta förfarande, reproducerbar, och tillåter bevarande av inhemska näthinnans struktur för minst sju dagar, vilket gör det en användbar modell för en mängd olika morfologiska, farmakologiska och biokemiska studier på däggdjur näthinnan.
Protocol
1. Att göra en skräddarsydd står för insatser cellodling
Basen i en 5 ml pipettspets (ISC BioExpress, # P-3250-19) har en inre diameter 13 mm, som perfekt matchar botten storleken (12,6 mm, yttre diameter) av en 10 mm (innerdiameter) NUNC cell kultur in (8 ìm, polykarbonatmembranfilter, Thermal, # 137.443). För att stativet var pipetten avskuren nära basen för att producera en 6 mm lång ihålig cylinder. Då var bitar bort från sidan av cylindern med hjälp av en flamma uppvärmd kniv för att skapa 3 ben (4 mm i höjd) i en ring (2 mm i höjd), som tog höjden av skären med ca 5 mm.
2. Beredning av sterila filterpapper för fastsättning och kultur svin näthinnan
Whatman 4M Filtrerpapper (Kat nr 1004) blev skuren i en rund form (6,3 mm i diameter) med en liten, trekantig handtag som användes för att flytta filtret papper i ett glasrör för sterilisering eller en gång näthinnan var bifogad (som visas i videon).
3. Beredning av näthinnan explants
Ögon från 5 - till 9-månader gammal, 150-230 kg, var amerikanska Yorkshire grisar från ett lokalt slakteri inom tre timmar enucleation (transporteras på is). Vid ankomsten var ögon rengöras från främmande vävnad, doppad i Betadine-lösning (10% Povidon-jod, Den Purdue Frederique Company, Stamford, CT) och tvättas två gånger i Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM med 1g / l glukos, L-glutamin, och natrium pyruvat, Cellgro-Mediatech Inc., Manasses, VA) kompletterat med 2,5 mikrogram / ml Amfotericin B (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA). Den främre segmentet togs bort, exponera neurala näthinnan. Sex mm trephine blad (Storz Ophthalmic-Bausch & Lomb, Manchester, MO) användes för att skära ekvatorn, full tjocklek bakre segmentet explants. Näthinnan senare skalas av genom att försiktigt använda en bit torrt sterilt filterpapper på ganglion cellager, lyfta av neurala näthinnan, och placera filtret papper med bifogade näthinnan på kultur infoga, fotoreceptorer uppåt. Insatsen var då placeras i odlingsmedium och se till att helt täcka näthinnan, i ett 12-bra kultur skålen (Fisher). Flera explants erhölls rutinmässigt och odlade från en enda öga.
4. Vävnadskultur
Näthinnans vävnad var odlade i Eagles Minimum Essential Medium (MEM, Invitrogen-Gibco-Life Technologies Inc., Rockville, MD), pH 7,4, kompletterat med 0,2 mg / ml glutamin, 10 mikrogram / ml svin insulin, 1 mm pyruvat, 0,1 mm L-askorbinsyra, 100 U / ml penicillin, 100 mikrogram / ml streptomycin och 250 ng / ml amfotericin B (antibiotikum Antimykotika: Sigma, St Louis, MO), och kolsyrat med fuktad 5% CO 2, balans luft, vid 37 ° C. Medium byttes varannan dag.
Vävnad kan användas, behandlas med olika reagenser eller sonder, eller lämnas obehandlade för senare biokemiska eller morfologiska analyser. Avsnittet nedan beskriver förfaranden för att skapa enhetliga full tjocklek retinal tvärsnitt.
5. Sektionering
- Använda en kryostat
- Fix näthinnans vävnad i 4% parafomaldehyde över natten vid 4 ° C;
- Skölj vävnad kort med fosfatbuffrad saltlösning (PBS);
- Ta försiktigt bort vävnad från filterpapper medan den är i PBS i en 35 mm maträtt med hjälp av en dissektion mikroskop;
- Överföring vävnad till 30% sackaros och hålla över natten vid 4 ° C;
- Sug bort den lösningen runt vävnaden, lägga tillräckligt Tissue-Tek medium (oktober Compound 4583) för att täcka vävnaden, och låta det blöta i rumstemperatur i 2 timmar för att genomsyra vävnad;
- Bygg en fyrkantig ram (10 mm x 10 mm, 5 mm höjd) med dentalvax och lägg den runt vävnaden, lägga till fler Tissue-Tek medel för att fylla ramen (se till att vävnadsprovet är platt) och placera i en frys (- 20 ° C) i minst 1 timme;
- Överför frysta provblocket till ett urval plattform (se provblocket är vertikal till plattformen);
- Montera provet plattform i en nedkylda kryostat (-20 ° C, Leica, CM1900) och se till att blocket är vertikal på bladet;
- Ta bort vaxet och ramen blocket innan snittning av vävnaden vid önskad tjocklek;
- Placera avsnitt om gelatin behandlade bilder.
- Använda en Vibratome
- Fix och skölj den vävnad som beskrivits ovan för kryostat;
- Placera vävnaden i förvärmd, smält 4% agar i en liten behållare och förvara vid 4 ° C tills agar stelnar helt;
- Använd en vass kniv att trimma agar i ett litet block med vävnadsprovet insidan;
- Limma provblocket på en vibratome provhållaren med Krazy lim (se till att bit vävnadsprov är vertikal till plattformen av the provhållaren, dvs vinkelrätt mot bladet) och montera hållaren på en vibratome sektionering system (Leica, Serie 1000) med provblocket helt nedsänkt i iskallt vatten;
- Skär provblocket i 50 ìm sektioner och placera dem på gelatin-behandlade bilder med en mjuk borste.
6. Immunohistokemi
Använd någon standardprotokoll. Immunolabeled tjocka sektioner kan visas med en konfokalmikroskop.
7. Representativa resultat:
Morfologi bevarades under den sjudagarsperiod av kultur. Bilder på näthinnan före och efter odling finns i videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vision forskare har etablerat en rad olika retinal kultur system, inklusive organotypic system, för att studera en mängd olika frågor, såsom retinal stamcellstransplantation 1, retinal förnyelse 2, och exogena genuttryck 3-5. Dock är vuxna däggdjur näthinnan svårt att upprätthålla in vitro, främst på grund av hög energi krav fotoreceptorer 6. Koizumi et al. Beskrev en kanin näthinnan organotypic kultur system där syretillförseln för fotoreceptorer har förbättras genom att höja höjden på kulturen in och omskakning av odlingsmedium. De lyckades behålla vuxen näthinnans vävnad i upp till sex dagar 4,5. Kobuch et al. Beskrev ett system perfusion kultur för vuxna svin näthinnan och retinal pigment (RPE) och kunde behålla organotypic vävnaden i minst 10 dagar 7. Men den proceduren för att förbereda näthinnan-RPE-koroidea ark för laboratorie-manipulation komplicerat och krävs specialverktyg. Dessutom krävs varje Explantation sitt eget perfusionen som gör in vitro-kultur av flera vävnadsprover besvärligt. . Kaempf et al skapats en annan organotypic kultur-modellen på vuxna däggdjur neurosensoriska näthinnan i samarbete kultur med RPE men bara visade resultaten för en 3-dagars kultur, den långsiktiga överlevnaden av vävnaden har inte testats 8.
I detta manuskript, beskriver vi en enkel och reproducerbar protokoll för organotypic kultur av vuxna svin neurala näthinnan anta en strategi liknande den som tidigare beskrivits för kanin näthinna 4 med följande funktioner:
- Skapande av en enkel teknik för att göra en egen monter för att öka höjden på kultur infoga, säkerställer god syretillförsel för hela näthinnan Explantation. Använd en 5 ml pipettspets för att skapa stå försäkrar att stativet kan autoklaveras och att höjden kan justeras om så önskas.
- Kultur av näthinnan med ljusmätare skikt uppåt, i motsats till den ganglion cellager. På detta sätt har de fotoreceptorer ökad tillgång till syre och agitation för att ytterligare öka syretillförseln inte är nödvändigt.
- Minimering av mekanisk trauma. De retinala explants är kopplade till sterila filterpapper innan du skalar dem från RPE och sedan odlas på filterpapper och därmed minska mekanisk stress på vävnaden och förebygga näthinnan curling.
- Konsekvens i storleken på näthinnan explants. Eftersom en trephine används för att skapa explants är varje retinal explantation av samma storlek, vilket gör det lätt att jämföra resultaten av olika behandlingar.
- Bevarande av morfologi. Struktur av svin näthinnan i denna kultur systemet förblir intakt i minst sju dagar.
Med tanke på att svin och mänskliga näthinnan är väldigt lika när det gäller cell distribution och morfologi, vaskulär mönster, tjocklek och andra fysiologiska egenskaper 9,10 ger organotypic kultur svin näthinnan en attraktiv djurmodell för att studera yttringar av mänsklig retinal sjukdomar, degeneration, och skador. Detta system kan vara särskilt viktigt i de fall där in vitro-experiment på mänskliga näthinnan är omöjliga att utföra beror delvis på bristen på högkvalitativa mänsklig vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH bidrag EY 012.031 (ET-A), en utmärkelse från FM Kirby Foundation (ET-A), Forskning för att förebygga blindhet, Inc. (MAZ), New Jersey Lions Eye Research Foundation (MAZ) The Eye Institute of New Jersey (MAZ), Joseph J. och Marguerite DiSepio Retina Research Fund (MAZ) och Janice Mitchell Vassar och Ashby Mitchell Fellowship (AMK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal Scientific, Inc. | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1900 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss, Inc. | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | Dako | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 |
References
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3503-3512 (2008).
- Kretz, A., Marticke, J. K., Happold, C. J., Schmeer, C., Isenmann, S. A primary culture technique of adult retina for regeneration studies on adult CNS neurons. Nat Protoc. 2, 131-140 (2007).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).
- Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult mammalian retinas. PLoS One. 2, e221-e221 (2007).
- Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic culture of adult rabbit retina. J Vis Exp. , (2007).
- Ames, A., Li, Y. Y. 3rd, Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. J Neurosci. 12, 840-853 (1992).
- Kobuch, K. Maintenance of adult porcine retina and retinal pigment epithelium in perfusion culture: characterisation of an organotypic in vitro model. Exp Eye Res. 86, 661-668 (2008).
- Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. J Neurosci Methods. 173, 47-58 (2008).
- Guduric-Fuchs, J. Immunohistochemical study of pig retinal development. Mol Vis. 15, 1915-1928 (2009).
- Chandler, M. J., Smith, P. J., Samuelson, D. A., MacKay, E. O. Photoreceptor density of the domestic pig retina. Vet Ophthalmol. 2, 179-184 (1999).
