Summary
Detta protokoll beskriver en hög genomströmning metod för enzymatisk hydrolys som använder en mikroplattor läsare för att mäta och klassificera marken fosfor som P monoestrar, P diestrar och oorganiska P. Upp till 96 prov kan mätas på en gång i en standard laboratorium.
Abstract
Många typer av organisk fosfor (P) molekyler finns i miljöprover 1. Traditionella P mätningar inte kan identifiera dessa organiska P-föreningar eftersom de inte reagerar med kolorimetriska reagenser 2,3. Enzymatisk hydrolys (EH) är en framväxande metod för att exakt karakterisera organiska P-former i miljöprover 4,5. Denna metod är bara falska i noggrannhet av fosfor-31 kärnmagnetisk resonans spektroskopi (31 P-NMR)-en metod som är dyr och kräver specialiserade tekniska training6. Vi har anpassat en enzymatisk hydrolys metod som kan mäta tre klasser av fosfor (monoester P, diester P och oorganiskt P) till ett mikroplattor läsare systemet 7. Denna metod ger forskare med en snabb, exakt, prisvärda och användarvänliga sätt att mäta P arter i mark, sediment, gödsel och, om det koncentrerade, vattenlevande prover. Detta är den enda hög genomströmning metod för att mäta former och enzym-labilitet av organiska P som kan utföras i en standard laboratorium. Erhållna data ger inblick i forskare som studerar systemet näringsinnehåll och övergödning potential.
Protocol
1. Fosfor Extraktion
- Förbered en 1L lösning av 0,25 M natriumhydroxidlösning (NaOH, 40,00 g / mol) + 0,05 M EDTA (etylendiamintetraättiksyra, 292,24 g / mol).
- Tillsätt 30 ml av NaOH + EDTA lösning på 2 g våt eller torkad jord / prov i en 50 ml koniska rör.
- Inkubera med agitation för 16 timmar vid rumstemperatur.
- Centrifugera 3000 xgi 3 minuter.
2. Provextraktet pH justering
- Överför en 0,1 mL alikvot till en 1,5 ml mikro-centrifugrör.
- Tillsätt 0,017 ml av 2,5 M ättiksyra, 0,144 mL 0,4 M acetatbuffert (70,5% av natriumacetat [CH 3 COONa, 82,03 g / mol] och 29,5% av ättiksyra, pH 5,0) och 0,739 mL avjoniserat vatten.
- Den slutliga volymen justeras extrakt kommer 1 mL och den slutliga pH-värdet blir 5,0.
3. Enzym stamlösning Förberedelser
- Förbered ett L i 0,1 M natriumacetat (CH 3 COONa, 82,03 g / mol), pH 5,0.
- Förbered 2 x 10 ml sura lösningar fosfatas lager i natriumacetat buffert bereddes i steg 3,1, så att slutliga koncentrationer är var 0,5 enheter / ml.
Surt fosfatas Typ I från Triticum aestivum (vetegroddar, GP, i allmänhet 0,5 U mg-1 fast, EG 3.1.3.2)
Surt fosfatas Typ IV-S från Solanum tuberosum (potatis, PP, i allmänhet 4,6 U mg-1 fast, EG 3.1.3.2)
* Verksamhetsenheter specificeras av leverantören där 1 enhet definieras som befrielsen av 1 mikromol ortofosfat till lösningen per timme vid 37 ° C. - Rekonstituera frystorkad nukleas P1 (EG 3.1.30.1) från Penicillium citrinum (svampar, NP1, allmänt 500 U mg -1 fast) i en ml avjoniserat vatten, detta kan nu lagras vid 4 ° C för framtida bruk.
- Pipettera NP1 till en av de 10 mL rör som bereddes i steg 3,2 så att den slutliga koncentrationen är 2,5 enheter / ml NP1, blanda försiktigt genom att vända flera gånger.
- Centrifugera två 10 ml enzym lösningar 3000 xgi 30 minuter.
4. P kalibreringskurvan och Kontroller
- Förbered 1 L 1 mm kaliumfosfat (K2HPO4, 174,18 g / mol) stamlösning.
- Tillsätt 1 ml av 1 mM kaliumfosfat stamlösningen till ett 1,5 ml centrifugrör och utföra syv 0,5 ml seriespädningar.
- Kasta det första röret så att du har 7 utspädningar från 20 nmol-0,625 nmol s.
- Överför 80 mikroliter från varje rör i två exemplar till rader B - H i en standard 96-brunnar.
- Tillsätt 80 mikroliter av natriumacetat buffert (avsnitt 3.1) enligt rad A i kolumnerna 11 och 12-detta är den 0 nmol P kalibreringspunkt.
- Varje kolumn 11 och 12 innehåller nu 8 referensprover från 0 nmol till 20 nmol oorganiskt fosfat.
- Kolumn 10 kommer att innehålla följande kontroller:
- Lägg 40μL PP + GP enzym lösning + 40 mikroliter natriumacetat buffert (avsnitt 3.1) till de första tre brunnar i kolumn 10.
- Tillsätt 40 mikroliter PP + GP + NP1 enzym lösning + 40 mikroliter natriumacetat buffert för de kommande tre brunnar.
- Tillsätt 40 mikroliter natriumacetatlösning innehållande 10 nmol glukos-6 fosfat (C 6 H 11 Na 2 O 9 P • xH 2 O, 304,1 g / mol) + 40 mikroliter PP + GP enzym lösning till ett bra och till den slutliga väl i kolumn 10 Lägg natriumacetatlösning istället för enzym lösning.
5. Exempel + Enzyme Inkubering
- Varje prov testas kommer att ockupera de första nio brunnar i en rad i en standard 96-brunnar.
- Fördela 40 mikroliter av pH-justerade provextrakt från avsnitt 2 i brunnarna 1-9 i upp till 8 rader.
- Efter alla prover har distribuerats * Använd en flerkanalspipett att distribuera PP + GP enzym lösning kolumner 1-3, PP + GP + NP1 till kolumner 4-6 och natriumacetat buffert (upprättad i avsnitt 3.1) till kolumner 7-9.
* Detta steg måste utföras snabbt för att försäkra alla prover får motsvarande inkubationstid. - Täck 96-brunnar med lock och prover inkubera + enzym lösningar, kontroller och kalibreringskurvan exakt 1 timme vid 37 ° C.
6. Kolorimetriska Mätning av Släppt och bakgrund Oorganisk P
- Förbered 50 ml av var och en av följande lösningar i avjoniserat vatten:
Lösning A *: 0,1 M askorbinsyra (C6H8O6, 176,12 g / mol) + 0,5 M triklorättiksyra (Cl3CCOOH, 163,39 g / mol)
Lösning B: 0,01 M ammoniummolybdat ((NH4) 2MoO4, 196,01 g / mol)
Lösning C: 0,1 M natriumcitrat (HOC (COONa) (CH2COONa) 2 2H2O, 294,10 g / mol) + 0,2 M natriumarsenat (NaAsO2, 129,91 g / mol) + 5% isättika
(CH3CO2H, 60,05 g / mol) * Lösning A skall beredas dagligen. - Tillsätt 25 mikroliter av lösning SDS, 100 mikroliter av lösning A, 20 mikroliter av lösning B och 50 mikroliter och Lösning C till alla brunnar i 96-håls plåt. Gör detta snabbt med en multikanalpipett.
- Täck plattan och inkubera 30 minuter vid rumstemperatur.
- Mät absorbansen vid 850 nm i alla avstämbara mikro-plattläsaren.
7. Klassificering av P Föreningar
- Importera rådata till ett kalkylprogram (t.ex. Microsoft Excel).
- Rita den oorganiska kurvan fosfor kalibrering: 0 till 40 nmol P på x-axeln och medelvärdet av dubbla absorbansmätningar på y-axeln.
- Utför en linjär regression och hitta ekvationen för linjen för bästa passform.
- Kolumnerna 1-3: direkt tillämpliga kalibreringskurvan-Det här är bakgrunden oorganiskt s.
- Kolumnerna 4-6: Genomsnittlig tre exemplar prov värderingar och subtrahera kontroller (enzym lösning + bakgrunden oorganiskt P) från brutto absorbans-Det här är P kommer från hydrolyserbar P monoestrar.
- Kolumnerna 7-9: Samma som 7,5 utom subtrahera absorbansen värden från kolumner 4-6 - det här är P från hydrolyserbar P diestrar.
- Konvertera absorbans data till nmol P frigörs genom tillämpning av kalibreringsekvationen.
- nmol P frigörs kan relateras tillbaka till mg P / kg ursprungliga jord. Alternativt kan bedöma proportioner för varje P-klassen också vara en användbar metod för att analysera data.
8. Representativa resultat:
En snabb visuell kontroll av 96-brunnar efter kolorimetriska kemi kommer att erbjuda ledtrådar om huruvida förfarandet utfördes korrekt. Det första man måste kontrollera är nivån på vätskan i varje brunn genom att skanna sidan profilen av plattan. Det ska vara exakt 275 mikroliter av reagenser i alla brunnar. Därefter visuellt inspektera färgen på brunnar tre exemplar prov och dubbla kalibrering brunnar. Dessa tekniska replikera ska vara samma nyans av blått. Nästa ansöka kalibreringskurvan med de två brunnar som innehåller glukos-6 fosfat och kontrollera de släppte alla 10 nmol av oorganiska P. Efter det totala extraherade P har mätts med hjälp av ICP-OES eller en alternativ metod, se till att den totala P-värden som beräknas med denna protokollet inte överstiger den mängd P som utvanns.
Observera: Noggrann datahantering i kalkylbladet kommer att skydda mot kvantitativa fel. Du kommer att ha att göra med en massa siffror på en gång, så att skapa en mall kommer att finnas tid väl spenderade.
Figur 1. En 96-brunnar visar resultat för 8 prover (rader AH) och en kalibreringskurva (kolumner 11 och 12). Kontrollerna är i kolumn 10. Färgintensitet ökning mellan kolumnerna 1-3 och 4-6 beror på att hydrolyseras monoester P föreningar, mellan kolumnerna 4-6 och 7-9 beror på att hydrolyseras föreningar diester P.
Figur 2. Fördelning av P-klasser i en 0,25 M NaOH-0,05 M EDTA utdrag av ett Vermont jordprov med hög genomströmning enzymatisk hydrolys. Felstaplar visar standardavvikelse, n = 3.
Discussion
Genom sin natur kräver en snabb metod med små volymer stor omsorg. Därför är de mest kritiska stegen är sådana som pipettera lösningar på plattan. Exakt, och viktigast, konsekvent pipett teknik är avgörande för framgången med denna analys.
Den NaOH-EDTA extraktion gör de flesta av P i många prover som ska präglas i tre klasser: ortofosfat, monoester P och diestrar P. marklära, gödsel, sediment eller andra miljö-prov som innehåller NaOH-EDTA-extraherbara kan P karaktäriseras . P former i miljöprover är inte nödvändigtvis stabila och denna teknik kommer att se prover kännetecknas innan proven äventyras utan att behöva anställa en armé av forskare.
Denna analys är särskilt lämplig när ett stort antal prover som ska bearbetas. Reagenset behov och utrymmeskrav har skalats ner till en hanterbar nivå (t.ex. 1,5 mL mikrocentrifugrör än 50 ml kolvar glas). Denna anpassning begränsar också produktionen av avfall.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar USGS och Vermont vattenresurser och sjön Studies Center för att tillhandahålla finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Wheat Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P3627 | |
| Potato Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P1146 | |
| Nuclease P1 | Sigma-Aldrich | N8630 | |
| Potassium Phosphate | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| Glucose-6 Phosphate | Sigma-Aldrich | G7250 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4390 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
| Ammonium Molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Sodium Arsenate | Sigma-Aldrich | S9663 |
References
- Turner, B. L., Frossard, E., Baldwin, D. S. Organic phosphorus in the environment. , Cabi Publishing. Wallingford. (2005).
- Murphy, J., Riley, J. P. A modified single solution method for determination of phosphate in natural waters. Anal. Chim. Acta. 27, 31-36 (1962).
- Dick, W. A., Tabatabai, M. A. Determination of orthophosphate in aqueous solutions containing labile organic and inorganic phosphorus compounds. J. Environ. Qual. 6, 82-85 (1977).
- He, Z., Toor, G. S., Honeycutt, C. W., Sims, J. T. An enzymatic hydrolysis approach for characterizing labile phosphorus forms in dairy manure under mild assay conditions. Bioresour. Technol. 97, 1660-1668 (2006).
- He, Z., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Commun. Soil Sci. Plant Anal. 36, 1373-1383 (2005).
- Cade-Menun, B. J. Characterizing phosphorus in environmental and agricultural samples by 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy. Talanta. 66, 359-371 (2005).
- Johnson, N. R., Hill, J. E. Phosphorus species composition of poultry manure-amended soil using high-throughput enzymatic hydrolysis. Soil Sci. Soc. Am. J. 74, 1786-1791 (2010).
