Summary
이 프로토콜은 측정하고 분류 P monoesters, P의 diesters 및 무기 P. 같은 토양 인을 최대 96 샘플에 대한 표준 실험실에서 한 번에 측정할 수에 microplate 리더를 활용하여 효소 가수 분해의 높은 처리량 방법을 설명합니다.
Abstract
유기 인 (P) 분자의 많은 종류의 환경 샘플 1 존재합니다. 그들이 colorimetric 시약 2,3와 반응하지 않기 때문에 전통 P 측정이 유기 P 화합물을 감지하지 않습니다. 효소 가수 분해가 (EH) 정확 4,5 환경 샘플에서 유기 P 양식을 특성화를위한 새로운 방법입니다. 이 방법은 인 - 31 핵 자기 공명 분광학 (31 P - NMR) - 고가이며 전문 기술을 필요로 training6 방법으로 정확도상에있다. 우리는 microplate 리더 시스템 7 인 세 클래스 (monoester P, diester의 P 및 무기 P)를 측정할 수 효소 가수 분해 방법을 적응있다. 이 방법은 토양, 퇴적물, manures하고있다면 집중, 수생 샘플에서 P 수종을 측정할 수있는, 빠르고 정확 저렴하고 사용자 친화적인 방법으로 연구자를 제공합니다. 이것은 표준 실험실에서 수행할 수 있습니다 유기 P의 형태와 효소 - lability을 측정하는 유일한 높은 처리량 방법입니다. 결과 데이터는 시스템의 양분 콘텐츠 및 부영 양화 가능성을 연구 과학자로 통찰력을 제공합니다.
Protocol
1. 인 추출
- 0.25 M의 수산화 나트륨 (NaOH, 40.00 g / 몰) + 0.05 M Ethylenediaminetetraacetic의 산 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 292.24 g / 몰)의 1L 솔루션을 준비합니다.
- 50 ML 원뿔 관에서 습식 마른 흙 / 샘플 2g에 NaOH + EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 30 ML을 추가합니다.
- 상온 16 H에 대한 동요와 부화.
- 3 분 3,000 XG를 원심 분리기.
2. 샘플 추출 산도 조정
- 1.5 ML 마이크로 원심 튜브에 0.1 ML의 나누어지는을 전송합니다.
- 2.5 M 아세트산의 산성의 0.017 ML, 0.4 M 아세트산 버퍼 (아세트산 나트륨의 70.5 % [CH 3 쿠나, 82.03 g / 몰]과 초산의 29.5 %, 산도 5.0), 그리고 탈이온수의 0.739 ML.의 0.144 ML 추가
- 조정 추출의 최종 부피는 1 ML되며 최종 산도 5.0 것입니다.
3. 효소 주식 솔루션 준비
- 0.1 M의 아세트산 나트륨 (CH 3 쿠나, 82.03 g / 몰) 솔루션, 산도 5.0 1 L를 준비합니다.
- 최종 농도가 각각 0.5 단위 / ML하는 등 단계 3.1 준비 아세트산 나트륨 버퍼 2 X 10 ML의 산성 인산 가수 분해 효소 주식 솔루션을 준비합니다.
산성 인산 가수 분해 효소는 Triticum aestivum (; GP, 일반적으로 0.5 U MG - 1 고체, EC 3.1.3.2 밀 배아)에서 I를 입력합니다
솔라넘 tuberosum에서 산성 인산 가수 분해 효소 유형 IV - S (감자, PP, 일반적으로 4.6 U MG - 1 고체, EC 3.1.3.2)
활동 * 단위는 1 단위가 37 시간당 솔루션 orthophosphate 1 micromole의 해방로 정의됩니다 공급자 ° C.에 의해 지정 - 중 하나를 ML에 탈이온수 - 이것이 지금 4 저장할 수 있습니다 ° C 나중에 사용하기 위해, Reconstitute은 Penicillium citrinum (NP1, 일반적으로 500 U MG -1 고체 곰팡이)에서 nuclease P1 (EC 3.1.30.1)을 동결 건조된.
- 최종 농도가 2.5 단위 / ML NP1는 그러한 단계 3.2 준비 10 ML 튜브 중 하나에 피펫 NP1은, 부드럽게 여러 번 반전하여 섞는다.
- 30 분 2 인용 10 ML 효소 솔루션 3,000 XG를 원심 분리기.
4. P 보정 곡선 및 제어
- 1 ㎜의 칼륨 인산 1 L (K2HPO4, 174.18 g / 몰) 재고 솔루션을 준비합니다.
- 1.5 ML의 원심 관에 1 ㎜ 인산 칼륨 주식 솔루션 1 ML 추가 일곱 0.5 ML 시리얼 dilutions을 수행합니다.
- 당신이 20 nmol - 0.625 nmol P.까지 7 dilutions를 제공받을 수 있도록 최초의 튜브를 삭제
- 표준 96 - 웰 플레이트의 H - 행 B에 중복 각 관에서 80 μL를 전송합니다.
- 열 11 12이 0 nmol P 교정 포인트입니다.의 로우에 아세트산 나트륨 버퍼 (섹션 3.1) 80 μL를 추가
- 각 열은 11 지금 12 0 nmol 20 nmol 무기 인산염 8 참조 샘플을 포함하고 있습니다.
- 열 10 다음 컨트롤을 포함합니다 :
- 열 10 처음 세 개의 우물을 40μL PP + GP 효소 솔루션 + 40 μL 아세트산 나트륨 버퍼 (섹션 3.1) 추가합니다.
- 40 μL PP + GP + NP1 효소 솔루션 + 다음 세 우물 40 μL 아세트산 나트륨 버퍼를 추가합니다.
- 10 nmol 포도당 - 6 인산를 (C 6 H 11 나 2 O 9 P • xH 2 O, 304.1 g / 몰) 잘 하나와 최종 잘하는 + 40 μL PP + GP 효소 솔루션이 포함된 40 μL 아세트산 나트륨 솔루션 추가 대신 효소 솔루션의 열 열 추가 나트륨 아세테이트 용액 인치
5. 샘플 + 효소 인큐베이션
- 테스트중인 각 예제는 표준 96 - 웰 플레이트 1 행의 최초의 9 웰스를 차지합니다.
- 제 2의 우물 1-9로 산도 - 조정 시료 추출물의 40 μL를 배포 최대 8 행을 인치
- 모든 샘플이 배포되고 나면 *은 PP + GP 효소 컬럼에 솔루션을 1-3, PP + GP + NP1 열 4-6 열을 7-9로 아세트산 나트륨 버퍼 (섹션 3.1에서 준비)합니다. 배포하는 멀티채널 피펫을 사용하여
*이 단계는 모든 샘플은 동일한 배양 시간을 보장하기 위해 신속하게 수행되어야합니다. - 37 96 잘 뚜껑과 부화 샘플과 함께 플레이트 + 효소 솔루션, 컨트롤 및 교정 곡선 정확하게 1 시간 ° C. 표지
6. 발표 및 배경 무기 P의 Colorimetric 측정
- 탈이온수에 다음과 같은 솔루션을 각각 50 ML 준비 :
솔루션 A * : 0.1 M의 아스코르비 산 (C6H8O6, 176.12 g / 몰) + 0.5M trichloroacetic 산 (Cl3CCOOH, 163.39 g / 몰)
솔루션 B : 0.01 M의 암모늄 molybdate ((NH4) 2MoO4, 196.01 g / 몰)
솔루션 C : 0.1 M 나트륨 구연 산염 (HOC (쿠나) (CH2COONa) 2 2H2O, 294.10 g / 몰) + 0.2 M 나트륨 arsenate이 (NaAsO2, 129.91 g / 몰) + 5% 빙초산
(CH3CO2H, 60.05 g / 몰) * 솔루션은 매일 준비되어야합니다. - 솔루션 SDS 25 μL, 100 μL 솔루션을 추가, 솔루션 B 50 μL의 모든 우물에 솔루션 C 20 μL 96 잘 PL에먹었다. 멀티채널 피펫로 빠르게이 작업을 수행합니다.
- 접시 커버하고 실온에서 30 분 알을 품다.
- 모든 조정할 수있는 마이크로 플레이트 판독기에서 850 nm의 흡광도에서를 측정.
7. P 화합물의 분류
- 스프레드 시트 응용 프로그램 (예 : Microsoft Excel의)에 원시 데이터를 가져옵니다.
- X 축에 0-40 nmol의 P와 Y - 축에 중복 흡광도 측정 의미 : 무기 인 교정 곡선을 플롯.
- 선형 회귀를 수행하고 가장 적합한의 라인의 방정식을 찾으십시오.
- 열 1-3 : 직접 보정 적용 곡선을이 배경이되고 무기 P.
- 열 4-6 :. 평균 세중의 샘플 값 및에서 총 흡광도 - 이것이 P hydrolysable P의 monoesters에서 파생되는 컨트롤을 (효소 솔루션 + 배경 무기의 P) 밖으로 뺍니다
- 열 7-9 : 열 4-6에서 빼기의 흡광도 값을 제외하고 7.5과 같은 -이이 hydrolysable P의 diesters에서 P 있습니다.
- 보정 방정식을 적용하여 발표 nmol P로 흡광도 데이터를 변환합니다.
- nmol P는 MG P / 원래 토양 kg으로 관련이 수 발표했다. 또한, 각각의 P 클래스의 비율을 평가하면 데이터를 분석하는 데 유용한 접근법 수 있습니다.
8. 대표 결과 :
colorimetric 화학 후 96 - 웰 플레이트의 빠른 영상 검사 절차가 올바르게 수행되었는지 여부를 단서를 제공합니다. 확인하는 첫번째 것은 접시의 측면 프로필을 검색하여 각 우물에 액체의 수준입니다. 모든 우물의 시약을 정확히 275 μL이 있어야합니다. 다음 시각 세중의 샘플 우물의 색상을 검사 및 교정의 우물 중복. 이러한 기술 복제 파란색 같은 그늘해야합니다. 다음 포도당 - 6 인산염을 포함하는 두 개의 우물에 교정 곡선을 적용하고 확인 그들은 전체 P이를 사용하여 계산된 값을 확인, ICP - 관한 것 또는 다른 방법을 사용하여 측정되어 총 추출 P 후에 무기 P. 모든 10 nmol을 발표 프로토콜은 추출되었다 P의 금액을 초과하지 않습니다.
참고 : 스프레드 시트에 조심해 데이터 관리가 양적 오류 방지 도움이 될 것입니다. 당신은 너무 템플릿을 만들어 한번에 숫자를 많이 다루려고합니다하는 것은 시간을 잘 보낸 것입니다.
그림 1 8. 샘플 (행 AH) 및 보정 곡선 (열 11, 12)에 대한 결과를 보여주는 96 - 웰 플레이트. 컨트롤 열에 10입니다. 열 1-3와 4-6 사이의 색상 강도 증가 분해 diester의 P 화합물에 의한 열 4-6와 7-9 사이에 분해 monoester P 화합물에 의한 것입니다.
그림 2. 높은 처리량 효소 가수 분해를 사용하여 버몬트 토양 샘플의 0.25 M NaOH - 0.05 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 추출물의 P 클래스의 유통. 오차 막대는 표준 편차, N = 3을 나타냅니다.
Discussion
본질적으로, 작은 볼륨을 사용하여 빠른 방법은 큰 관심이 필요합니다. 따라서 가장 중요한 단계는 접시에 pipetting 솔루션을 포함하는 사람입니다. 정확하고 가장 중요한 일관성 피펫 기술이 분석의 성공을 위해 필수적입니다.
NaOH - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 추출 많은 샘플에서 P의 대부분은 세 가지 클래스로 특성화 될 수 있습니다 : orthophosphate, monoester P와 diester P.의 소일스, manures, 퇴적물 또는 NaOH - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 추출물 P가 특징 수를 포함 다른 환경 샘플을 . 환경 샘플에서 P 양식은 반드시 안정되지 않고 샘플 연구자의 군대를 고용하지 않고 손상되기 전에이 기술은 샘플이 특징 보장합니다.
샘플 많은 처리하는 경우이 분석은 특히 적합합니다. 시약의 요구와 공간 요구 사항은 관리 수준 (예 : 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브보다는 50 ML 유리 flasks) 크기를 줄일되었습니다. 이 적응은 또한 폐기물 생산을 제한합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 USGS와 버몬트 워터 자원과 자금을 제공하는 호 연구 센터를 주셔서 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Wheat Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P3627 | |
| Potato Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P1146 | |
| Nuclease P1 | Sigma-Aldrich | N8630 | |
| Potassium Phosphate | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| Glucose-6 Phosphate | Sigma-Aldrich | G7250 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4390 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
| Ammonium Molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Sodium Arsenate | Sigma-Aldrich | S9663 |
References
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