Summary
Questo protocollo descrive un high-throughput metodo di idrolisi enzimatica che utilizza un lettore per micropiastre per misurare e classificare il fosforo suolo monoesteri P, diesteri P e inorganici P. Fino a 96 campioni possono essere misurati in una sola volta in un laboratorio standard.
Abstract
Molti tipi di fosforo organico (P) molecole presenti in campioni ambientali 1. Tradizionali misure di P non rilevano questi composti organici P, dal momento che non reagiscono con reagenti colorimetrici 2,3. Idrolisi enzimatica (EH) è un metodo emergente per la precisione che caratterizzano le forme P organici in campioni ambientali 4,5. Questo metodo è solo trumped di precisione da Fosforo-31 Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (31 P-NMR)-un metodo che è costoso e richiede tecnica specializzata training6. Abbiamo adattato un metodo enzimatico idrolisi in grado di misurare tre classi di fosforo (monoestere P, P e P inorganico diestere) ad un sistema di lettore di micropiastre 7. Questo metodo fornisce ai ricercatori un mezzo rapido, preciso, economico e di facile utilizzo per misurare la specie P nei suoli, sedimenti, concimi e, se concentrato, campioni acquatici. Questo è l'unico metodo high-throughput per la misurazione delle forme e enzima-labilità di P organico che possono essere eseguite in un laboratorio standard. I dati risultanti fornisce informazioni per gli scienziati studiano contenuto di nutrienti del sistema e il potenziale di eutrofizzazione.
Protocol
1. Estrazione del fosforo
- Preparare una soluzione di 1 litro di 0,25 M di idrossido di sodio (NaOH, 40,00 g / mol) + 0.05 M Etilendiammintetraacetato (EDTA, 292,24 g / mol).
- Aggiungere 30 ml della soluzione di NaOH + EDTA a 2 g di terreno umido o secco / campione in una provetta da 50 ml.
- Incubare con agitazione per 16 ore a temperatura ambiente.
- Centrifuga 3000 xg per 3 minuti.
2. Campione estratto di regolazione del pH
- Trasferire una aliquota 0,1 ml ad un mL 1,5 micro-tubo di centrifuga.
- Aggiungere 0,017 ml di 2,5 M di acido acetico, 0,144 ml di tampone acetato 0,4 M (70,5% di acetato di sodio [CH 3 COONa, 82,03 g / mol] e il 29,5% di acido acetico, pH 5,0), e 0,739 ml di acqua deionizzata.
- Il volume finale dell'estratto regolata sarà di 1 ml e il pH finale sarà 5.0.
3. Enzima Archivi Preparazione soluzione
- Preparare 1 L di 0,1 M di sodio acetato (CH 3 COONa, 82,03 g / mol) soluzione, pH 5.0.
- Preparare 2 x 10 ml di acido soluzioni stock fosfatasi nel buffer di acetato di sodio preparato al passo 3,1 tale che le concentrazioni finali sono ogni 0,5 unità / mL.
Fosfatasi acida tipo I da Triticum aestivum (germe di grano, medico di famiglia, in genere 0,5 U mg-1 solido, EC 3.1.3.2)
Fosfatasi acida Tipo IV-S da Solanum tuberosum (patata, PP, in genere 4,6 mg di U-1 solido, EC 3.1.3.2)
* Le unità di attività sono specificati dal fornitore in cui è definito 1 unità come la liberazione di 1 microgrammo di ortofosfato alla soluzione per ora a 37 ° C. - Ricostituire il liofilizzato nucleasi P1 (CE 3.1.30.1) da Penicillium citrinum (funghi; NP1, in genere 500 U -1 mg solido) in un ml di acqua deionizzata, questo può essere conservato a 4 ° C per un uso futuro.
- Pipettare NP1 in uno dei 10 mL preparato in punto 3.2 in modo che la concentrazione finale è di 2,5 unità / mL NP1, mescolare delicatamente, agitando parecchie volte.
- Centrifugare il 3000 xg due 10 ml di soluzioni di enzimi per 30 minuti.
4. P curva di calibrazione e controlli
- Preparare 1 L di 1 mM fosfato di potassio (K2HPO4, 174,18 g / mol), soluzione madre.
- Aggiungere 1 mL di soluzione 1 mM fosfato di potassio magazzino in una provetta da centrifuga da 1,5 ml ed eseguire sette 0,5 ml di diluizioni seriali.
- Scartare il primo tubo in modo da avere 7 diluizioni che vanno da 20 nmol-0,625 nmol P.
- Trasferire 80 microlitri di ogni tubo in duplice copia alle righe B - H di una piastra standard da 96 pozzetti.
- Aggiungere 80 ml di tampone acetato di sodio (sezione 3.1) alla riga A delle colonne 11 e 12-questo è il punto 0 nmol calibrazione P.
- Ogni colonna 11 e 12 contiene ora 8 campioni di riferimento da 0 a 20 nmol nmol fosfato inorganico.
- Colonna 10 conterrà i seguenti controlli:
- Aggiungi 40μL PP + soluzione enzimatica GP + 40 microlitri di buffer acetato di sodio (punto 3.1) ai primi tre pozzi nella colonna 10.
- Aggiungere 40 microlitri PP + GP + NP1 soluzione enzimatica + 40 microlitri di tampone acetato di sodio per i prossimi tre pozzi.
- Aggiungere 40 microlitri soluzione di acetato di sodio contenente 10 nmol glucosio-6 fosfato (C 6 H 11 Na 2 O 9 P • xH 2 O, 304,1 g / mol) + 40 microlitri PP + soluzione enzimatica GP ad un pozzetto e al bene finale nella colonna 10 aggiungere soluzione di acetato di sodio, invece di soluzione enzimatica.
5. Campione + Enzima Incubazione
- Ogni campione in fase di sperimentazione occuperà i primi 9 pozzi in 1 riga di una piastra standard da 96 pozzetti.
- Distribuire 40 ml di pH modificato estratti di campione dalla sezione 2 a 1-9 nel pozzi fino a 8 righe.
- Dopo che tutti i campioni sono stati distribuiti * utilizzare una pipetta multicanale per distribuire PP + soluzione enzimatica GP alle colonne 1-3, PP + GP + NP1 alle colonne 4-6 e tampone acetato di sodio (preparato in sezione 3.1) alle colonne 7-9.
* Questo passaggio deve essere eseguito rapidamente per assicurare tutti i campioni di ottenere il tempo equivalente di incubazione. - Coprire la piastra a 96 pozzetti con un coperchio e incubare campioni + soluzioni enzima, i controlli e la curva di calibrazione esattamente 1 ora a 37 ° C.
6. Misurazione colorimetrica di Released e P sfondo inorganici
- Preparare 50 ml di ciascuna delle seguenti soluzioni in acqua deionizzata:
Soluzione A *: 0,1 M acido ascorbico (C6H8O6, 176,12 g / mol) + 0,5 M acido tricloroacetico (Cl3CCOOH, 163,39 g / mol)
Soluzione B: 0,01 M molibdato di ammonio ((NH4) 2MoO4, 196,01 g / mol)
Soluzione C: 0,1 M di sodio citrato (HOC (COONa) (CH2COONa) 2 2H2O, 294,10 g / mol) + 0,2 arseniato di sodio M (NaAsO2, 129,91 g / mol) + 5% di acido acetico glaciale
(CH3CO2H, 60,05 g / mol) * Una soluzione deve essere preparata ogni giorno. - Aggiungere 25 microlitri di soluzione di SDS, 100 ml di soluzione A, 20 ml di soluzione B e 50 microlitri e di C soluzione a tutti i pozzetti della 96-ben plmangiò. Farlo rapidamente con una pipetta multicanale.
- Coprire la piastra ed incubare 30 minuti a temperatura ambiente.
- Misurare l'assorbanza a 850 nm, in ogni sintonizzabile micro-placca lettore.
7. Classificazione dei composti P
- Importare dati in un foglio di calcolo (ad esempio Microsoft Excel).
- Tracciare la curva di calibrazione inorganici del fosforo: da 0 a 40 P nmol sulle ascisse e la media delle misurazioni dell'assorbanza duplicati l'asse y.
- Effettuare una regressione lineare e trovare l'equazione della retta di regressione.
- Colonne 1-3: Direttamente applicare la curva di calibrazione, questo è sfondo inorganico P.
- Colonne 4-6: Valori medi del campione triplice copia e sottrarre i controlli (enzima soluzione + P inorganico sfondo) da lordo assorbanza-P questo è derivato da idrolizzabili monoesteri P.
- Colonne 7-9: Stesse 7,5 tranne i valori di assorbanza sottrarre colonne 4-6 - questo è P da idrolizzabili diesteri P.
- Convertire i dati di assorbanza a nmol P rilasciati applicando l'equazione di taratura.
- nmol P rilasciato può essere correlato indietro mg P / kg di suolo originale. In alternativa, valutando le proporzioni di ciascuna classe P può anche essere un approccio utile per analizzare i dati.
8. Rappresentante dei risultati:
Una rapida ispezione visiva della piastra a 96 pozzetti, dopo la chimica colorimetrica offrirà indizi o meno la procedura è stata eseguita correttamente. La prima cosa da controllare è il livello del liquido in ogni pozzetto una scansione del profilo laterale della piastra. Ci dovrebbe essere esattamente 275 ml di reagenti in tutti i pozzetti. Avanti, ispezionare visivamente il colore dei pozzi campione triplice copia e pozzetti di calibrazione. Questi replicano tecnico dovrebbe essere la stessa tonalità di blu. Avanti applicare la curva di calibrazione per i due pozzetti contenenti glucosio-6 fosfato e verificare hanno liberato tutti i 10 nmol di inorganici P. Dopo P totale estratto è stato misurato in ICP-OES o un metodo alternativo, assicurarsi che la P totale valori calcolati utilizzando questa protocollo non superano la quantità di P che è stato estratto.
Nota: attenta gestione dei dati nel foglio di calcolo aiuterà guardia contro gli errori quantitativi. Avrete a che fare con un sacco di numeri in una volta, in modo da creare un modello sarà tempo ben speso.
Figura 1. Un piatto da 96 pozzetti mostrando risultati per 8 campioni (righe AH) e una curva di calibrazione (colonne 11 e 12). I controlli sono nella colonna 10. Aumentare l'intensità del colore tra le colonne 1-3 e 4-6 è dovuto al idrolizzato monoestere composti P, tra le colonne 4-6 e 7-9 è dovuto ai composti idrolizzato P diestere.
Figura 2. Distribuzione delle classi di P in una 0,25 M NaOH-EDTA 0,05 M di estrarre un campione di suolo Vermont con elevato throughput idrolisi enzimatica. Le barre di errore indicano la deviazione standard, n = 3.
Discussion
Per sua natura, un metodo rapido utilizzando piccoli volumi richiede molta cura. Pertanto le fasi più critiche sono quelle che coinvolgono le soluzioni pipettaggio sulla piastra. Accurate e, soprattutto, la tecnica pipetta coerenti sono essenziali per il successo di questo test.
Il NaOH-EDTA estrazione permetterà la maggior parte dei P in molti campioni ad essere caratterizzata in tre classi: ortofosfato, monoestere P e diestere suoli P., concimi, nei sedimenti e ogni altro campione ambientale che contiene NaOH-EDTA estraibili P può essere caratterizzato . P forma in campioni ambientali non sono necessariamente stabili e questa tecnica garantirà campioni sono caratterizzati prima che i campioni sono compromesse senza la necessità di impiegare un esercito di ricercatori.
Questo test è particolarmente utile quando un gran numero di campioni devono essere trattati. I bisogni dei reagenti e requisiti di spazio sono stati ridotti a un livello gestibile (es. provette da 1,5 ml microcentrifuga invece di 50 vasi in vetro ml). Questo adattamento limita anche la produzione di rifiuti.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo l'USGS e Risorse Idriche del Vermont e il lago di Centro Studi per il finanziamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Wheat Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P3627 | |
| Potato Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P1146 | |
| Nuclease P1 | Sigma-Aldrich | N8630 | |
| Potassium Phosphate | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| Glucose-6 Phosphate | Sigma-Aldrich | G7250 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4390 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
| Ammonium Molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Sodium Arsenate | Sigma-Aldrich | S9663 |
References
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