Summary
Bu protokol, ölçmek ve sınıflandırmak P monoesters, P diesters ve inorganik P. olarak toprak fosfor standart bir laboratuvarda tek seferde 96 numune ölçülen olabilir mikroplaka okuyucu kullanır enzimatik hidroliz yüksek verimli bir yöntem açıklanır.
Abstract
Birçok organik fosfor (P) molekülleri türleri, çevre örnekleri 1 mevcuttur . Geleneksel P ölçümleri kolorimetrik reaktifler 2,3 ile reaksiyona girmeyen bu yana, bu organik P bileşikler algılamaz . Enzimatik hidroliz (EH) 4,5 çevre örneklerinde organik P formları doğru olarak tanımlamak için gelişmekte olan bir yöntemdir . Bu yöntem, yalnızca Fosfor-31 Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (31 P-NMR), pahalı ve uzman teknik İÖ6 gerektirir yöntemi doğruluk uydurma . Biz bir mikroplaka okuyucu sistemi 7 fosfor üç sınıf (monoester P diester P ve inorganik P) ölçme yeteneğine sahip bir enzimatik hidroliz yöntemi adapte var. Bu yöntem, toprak, sediment, gübresi ve, konsantre, su örnekleri P türlerini ölçmek için, hızlı, doğru, uygun fiyatlı ve kullanıcı dostu araçları ile araştırmacılar sağlar. Bu standart bir laboratuarda yapılabilir, organik P formları ve enzim-labilite ölçmek için sadece yüksek verimli bir yöntemdir. Ortaya çıkan veriler sistemi besin içeriği ve ötrofikasyon potansiyeli inceleyen bilimciler daha yakından görmemizi sağlar.
Protocol
1. Fosfor Ekstraksiyon
- 0.25 M sodyum hidroksit (NaOH, 40,00 g / mol) + 0.05 M Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA, 292,24 g / mol) 1L bir çözüm hazırlayın.
- 30 ml, 50 ml konik tüp ıslak veya kuru toprak / örnek 2 g NaOH + EDTA çözeltisi ekleyin.
- Ajitasyon ile oda sıcaklığında 16 saat süreyle inkübe edin.
- 3 dakika boyunca 3000 xg santrifüjleyin.
2. Örnek Özü pH Ayarı
- 0.1 mL kısım 1.5 ml mikro santrifüj tüpüne aktarın.
- 2,5 M asetik asit 0.017 ml, 0.144 ml 0.4 M asetat tamponu (sodyum asetat% 70.5 [CH 3 COONa, 82,03 g / mol] ve asetik asit% 29.5, pH 5.0), ve 0,739 mL deiyonize su.
- Ayarlanan özü son hacim 1 ml olacak ve nihai pH 5.0 olacak.
3. Enzim Stok Çözüm Hazırlığı
- 1 L 0,1 M sodyum asetat (CH 3 COONa, 82,03 g / mol) solüsyonu, pH 5.0 hazırlayın.
- Son konsantrasyonları her 0.5 Birimler / mL böyle bir adım 3.1 'de hazırlanan sodyum asetat tamponunda 2 x 10 ml asit fosfataz stok çözelti hazırlayın.
Asit fosfataz Triticum aestivum (GP, genel olarak 0.5 U mg-1 katı, EC 3.1.3.2 buğday tohumu) Tip I
Asit fosfataz Tip IV-S Solanum tuberosum (patates, PP, genel olarak 4.6 U mg-1 katı, EC 3.1.3.2)
* Faaliyet Üniteleri, 1 Adet 37 saatte çözüm ortofosfat 1 micromole kurtuluş olarak tanımlanan tedarikçi ° C ile belirtilir - Biri mL deiyonize su şimdi bu 4 saklanabilir ° C ileride kullanmak için sulandırın Penicillium citrinum (NP1, genellikle 500 U mg -1 katı mantarlar) nükleaz P1 (EC 3.1.30.1) liyofilize.
- Final konsantrasyonu 2.5 Birimler / mL NP1 böyle bir adım 3.2 'de hazırlanan 10 ml tüpler biri haline Pipet NP1 tersini birkaç kez hafifçe karıştırın.
- 30 dakika boyunca iki adet 10 ml enzim çözümleri 3000 xg santrifüjleyin.
4. P Kalibrasyon Eğrisi ve Kontroller
- 1 mM potasyum fosfat 1 L (KH2PO4, 174,18 g / mol) stok solüsyonu hazırlayın.
- 1.5 ml santrifüj tüpüne 1 mM potasyum fosfat stok solüsyonu 1 ml ekleyin ve yedi 0,5 mL seri dilüsyonları gerçekleştirmek.
- 20 nmol-0.625 nmol P. arasında değişen 7 dilüsyonları böylece ilk tüp atın
- Her tüp yinelenen bir standart 96-plaka H - Satır B 80 mcL aktarın.
- 80 mcL sodyum asetat tamponu (bölüm 3.1) Bir satır sütun 11 ve 12-0 nmol P kalibrasyon noktası.
- Her sütun 11 ve 12 şu anda 8 referans örnekleri 0 nmol 20 nmol inorganik fosfat içerir.
- Sütun 10 aşağıdaki denetimleri içerecektir:
- Sütun 10 ilk üç kuyulara 40μL PP + GP enzim çözeltisi + 40 mcL sodyum asetat tamponu (bölüm 3.1) ekleyin.
- 40 mcL PP + GP + NP1 enzim solüsyonu + önümüzdeki üç kuyu için 40 mcL sodyum asetat tamponu ekleyin.
- 10 nmol glukoz-6 fosfat (C 6 H 11 Na 2 O 9 P • XH 2 O, 304.1 g / mol) + iyi biri ve final de 40 mcL PP + GP enzim çözeltisi içeren 40 mcL sodyum asetat çözeltisi ekle Sütun 10 eklemek enzim çözeltisi yerine sodyum asetat çözeltisi.
5. Örnek + Enzim Kuluçka
- Her numune, test edilen standart bir 96-plaka 1 satır ilk 9 kuyu yer alacak.
- Bölüm 2 kuyu 1-9 pH ayarlı örnek özler 40 mcL dağıtın 8 satır.
- Tüm örnekler dağıtıldıktan sonra * PP + GP enzim sütun çözüm 1-3, PP + GP + NP1, sütunlar 4-6 ve sütun 7-9 sodyum asetat tamponu (Bölüm 3.1 hazırlanan). Dağıtmak için bir çok kanallı pipet kullanın
* Bu adım, tüm örneklerde eşdeğer inkübasyon süresi sağlamak için hızlı bir şekilde yapılmalıdır. - Kapak, 37 ° 96-iyi, bir kapak ve inkübe örnekleri ile levha + enzim çözümleri, kontrol ve kalibrasyon eğrisi tam 1 saat ° C
6. Yayımlanan ve Arka Plan İnorganik P Kolorimetrik Ölçümü
- 50 mL deiyonize su aşağıdaki çözümleri her hazırlayın:
Çözüm A *: 0,1 M askorbik asit (C6H8O6, 176,12 g / mol) + 0,5 M trikloroasetik asit (Cl3CCOOH, 163,39 g / mol)
Çözelti B: 0.01 M amonyum molibdat ((NH4) 2MoO4, 196,01 g / mol)
Çözüm: C: 0.1 M sodyum sitrat (HOC (COONa) (CH2COONa) 2 2H2O, 294,10 g / mol) + 0.2 M sodyum arsenat (NaAsO2, 129,91 g / mol) +% 5 buzul asetik asit
(CH3CO2H 60.05 g / mol) Çözüm bir günde hazır olmalıdır. - Çözüm SDS 25 mcL 100 mcL Çözüm, Çözüm B ve 50 mcL ve tüm kuyulara Çözüm C 20 mcL 96-iyi plyedik. Bir çok kanallı pipet ile hızlı bir şekilde yapın.
- Plaka Kapak ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Ayarlanabilir herhangi bir mikro-plaka okuyucu 850 nm'de absorbansı ölçülür.
7. P Bileşiklerin Sınıflandırılması
- Bir elektronik tablo uygulaması (örn. Microsoft Excel) ham veri İthalat.
- X ekseni üzerinde 0 ile 40 nmol P ve y-ekseni üzerinde yinelenen absorbans ölçümleri ortalaması: inorganik fosfor kalibrasyon eğrisi çizilir.
- Lineer regresyon yapın ve en uygun hat denklemi bulmak.
- Sütunlar 1-3: Doğrudan kalibrasyon geçerli eğrisi bu arka plan inorganik P.
- Sütunlar 4-6: Ortalama üç nüsha örnek değerler ve brüt absorbans-P hidrolize P monoesters türetilmiştir denetimleri (enzim çözüm + arka plan inorganik P) dışarı çıkarmak
- - Bu hidrolize P diesters P Sütunlar 7-9: sütun 4-6 çıkarmak absorbans değerleri hariç 7.5 ile aynı.
- Kalibrasyon denklemi uygulanarak tarafından yayımlanan nmol P absorbans verileri dönüştürmek.
- nmol P mg P / kg orijinal toprak geri ilgili olabilir yayınladı. Alternatif olarak, her P sınıfı oranlarda değerlendirilmesi, aynı zamanda veri analizi için yararlı bir yaklaşım olabilir.
8. Temsilcisi Sonuçlar:
Kolorimetrik kimya sonra 96-plaka hızlı bir görsel denetim prosedürü doğru olup olmadığı ipuçları sunacak. Kontrol etmeniz gereken ilk şey, sıvı seviyesi, yan profil, plaka tarama her bir kuyu. Tüm kuyularda reaktiflerin tam olarak 275 mcL olmamalıdır. Sonraki üç nüsha örnek kuyuların renk, görsel olarak incelemek ve kalibrasyon kuyu yinelenen. Bu teknik çoğaltmak aynı gölge mavi olmalıdır. Sonraki glukoz-6 fosfat içeren iki kuyu için kalibrasyon eğrisi uygulamak ve doğrulamak toplam P kullanılarak hesaplanan değerler emin olun, ICP-OES ya da alternatif bir yöntem kullanarak ölçülen toplam çıkarılan P sonra inorganik P. 10 nmol yayınladı protokol çıkarılan P miktarı aşmayın.
Not: Çizelgede Dikkatli veri yönetimi kantitatif hatalarına karşı korunmaya yardımcı olur. Böylece bir şablon oluşturarak, bir defada bir çok sayı ile ilgili olacak harcanan zaman geçirmiş olacak.
Şekil 1. 8 örnekleri (satırlar AH) ve bir kalibrasyon eğrisi (sütunlar 11 ve 12) sonuçları gösteren 96 plaka. Kontroller sütun 10. Sütun 1-3 ve 4-6 arasındaki renk yoğunluğunu arttırmak hidrolize diester P bileşikler nedeniyle, sütun 4-6 ve 7-9 arasında, hidrolize monoester P bileşikleri nedeniyle.
Şekil 2, yüksek verimli enzimatik hidroliz kullanarak Vermont toprak örneği 0.25 M NaOH-0.05 M EDTA özü P sınıfları Dağılımı . Hata çubukları standart sapma, n = 3 göstermektedir.
Discussion
Doğası gereği, küçük hacimlerde kullanarak hızlı bir yöntem büyük dikkat gerektirir. Bu nedenle en kritik adımlar plaka üzerine pipetleme çözümler içeren bu. Doğru, ve en önemlisi, tutarlı bir pipet tekniği bu testin başarısı için çok önemlidir.
NaOH-EDTA çıkarma P Birçok örnekte, en çok üç sınıfa karakterize olmasını sağlayacaktır: ortofosfat, P monoester diester P. Topraklar, gübrenin, sediment veya NaOH-EDTA ekstrakte P karakterize edilebilir içeren herhangi bir diğer çevresel numune . Çevre P formları mutlaka istikrarlı değildir ve örnek bir ordu araştırmacı istihdam gerek kalmadan tehlikeye önce bu tekniği örnekleri karakterize sağlayacaktır.
Bu testte, örneklerin çok sayıda işlenecek uygundur. Reaktif ihtiyaçları ve yönetilebilir bir seviyede (örneğin 1,5 mL mikrosantrifüj tüpler yerine 50 ml cam şişeler) alanı gereksinimleri küçülttüm. Bu uyum, aynı zamanda atık üretimi sınırlar.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz USGS ve Vermont Su Kaynakları ve Lake Araştırmaları Merkezi finansman sağlamak için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Wheat Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P3627 | |
| Potato Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P1146 | |
| Nuclease P1 | Sigma-Aldrich | N8630 | |
| Potassium Phosphate | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| Glucose-6 Phosphate | Sigma-Aldrich | G7250 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4390 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
| Ammonium Molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Sodium Arsenate | Sigma-Aldrich | S9663 |
References
- Turner, B. L., Frossard, E., Baldwin, D. S. Organic phosphorus in the environment. , Cabi Publishing. Wallingford. (2005).
- Murphy, J., Riley, J. P. A modified single solution method for determination of phosphate in natural waters. Anal. Chim. Acta. 27, 31-36 (1962).
- Dick, W. A., Tabatabai, M. A. Determination of orthophosphate in aqueous solutions containing labile organic and inorganic phosphorus compounds. J. Environ. Qual. 6, 82-85 (1977).
- He, Z., Toor, G. S., Honeycutt, C. W., Sims, J. T. An enzymatic hydrolysis approach for characterizing labile phosphorus forms in dairy manure under mild assay conditions. Bioresour. Technol. 97, 1660-1668 (2006).
- He, Z., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Commun. Soil Sci. Plant Anal. 36, 1373-1383 (2005).
- Cade-Menun, B. J. Characterizing phosphorus in environmental and agricultural samples by 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy. Talanta. 66, 359-371 (2005).
- Johnson, N. R., Hill, J. E. Phosphorus species composition of poultry manure-amended soil using high-throughput enzymatic hydrolysis. Soil Sci. Soc. Am. J. 74, 1786-1791 (2010).
