Summary
Wir zeigen eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-Methode, um Wechselwirkungen zwischen Faktoren bei Gewebe-spezifische Gene während oder nach dem Einsetzen der Gewebe-spezifische Gen-Expression in embryonalen Maus-Gewebe zu identifizieren. Dieses Protokoll sollte allgemein anwendbar für die Untersuchung von Gewebe-spezifische Genaktivierung, wie es während der normalen Embryonalentwicklung auftritt.
Abstract
Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Protein zu identifizieren: Chromatin-Wechselwirkungen, die im Kontext von lebenden Zellen 1-3 auftreten. Diese Technik wurde in großem Umfang in Gewebekulturzellen ausgebeutet und in geringerem Maße, in primärem Gewebe. Die Anwendung des ChIP mit Nagetier-embryonalen Gewebe, insbesondere in den frühen Zeiten der Entwicklung ist durch die begrenzte Menge an Gewebe und die Heterogenität der Zell-und Gewebetypen des Embryos kompliziert. Hier präsentieren wir eine Methode, um ChIP durchführen mit einem dissoziierten Embryonaltag 8,5 (E8.5) Embryo. Geschert Chromatin aus einem einzigen Embryo E8.5 können unterteilt werden in bis zu fünf Portionen, die die Ermittler genügend Material ermöglicht Kontrollen und für die Untersuchung von spezifischen Protein: Chromatin-Wechselwirkungen.
Wir haben diese Technik genutzt, um zu beginnen, um Protein-Dokument: Chromatin-Wechselwirkungen bei der Spezifikation von Gewebe-spezifischen Genexpression Programme. Die Heterogenität der Zelltypen im Embryo notwendig schränkt die Anwendung dieser Technik, weil das Ergebnis ist der Nachweis von Protein: Chromatin-Wechselwirkungen ohne Unterscheidung, ob die Wechselwirkungen treten in allen, eine Teilmenge von oder einem Zelltyp (s). Allerdings ist die Untersuchung von Gewebe-spezifischer Gene während oder nach dem Einsetzen der Gewebe-spezifische Genexpression möglich aus zwei Gründen. Zunächst Immunpräzipitation von gewebespezifischen Faktoren nicht unbedingt isoliert Chromatin aus dem Zelltyp, wo der Faktor ausgedrückt. Zweitens sollte Immunpräzipitation von Ko-Aktivatoren und Histonen mit post-translationale Modifikationen, die mit Gen-Aktivierung assoziiert sind nur bei Genen und Genprodukten regulatorische Sequenzen in die Zelle Typ, bei dem das Gen wird gefunden werden oder wurde aktiviert. Die Technik sollte für das Studium der meisten Gewebe-spezifische Genaktivierung Veranstaltungen.
Im Beispiel unten beschrieben, verwendeten wir E8.5 und E9.5 Maus-Embryonen zu Faktor Bindung an ein Skelettmuskel spezifischen Gen-Promotor zu untersuchen. Somiten, die eine Vorstufe Gewebe, aus denen die Skelettmuskeln des Rumpfes und der Gliedmaßen bilden, sind an E8.5-9.5 4,5 präsentieren. Myogenin ist ein regulierender Faktor für die Skelettmuskulatur Differenzierung 6-9 erforderlich. Die Daten zeigen, dass Myogenin mit seinen eigenen Promotor in E8.5 und E9.5 Embryonen verbunden ist. Da Myogenin ist nur in Somiten in diesem Stadium der Entwicklung 6,10 ausgedrückt, zeigen die Daten, die Myogenin Interaktionen mit ihren eigenen Promotor haben bereits in der Skelettmuskulatur Vorläuferzellen in E8.5 Embryonen aufgetreten.
Protocol
1. Isolierung von Embryonen
Hinweis: Sämtliche Geschäfte mit Mäusen sollten in Übereinstimmung mit den entsprechenden Tierpflege und Nutzungsrichtlinien und Protokolle durchgeführt werden
- Überprüfen Sie das Vorhandensein eines passenden Stecker in die Buchse Maus am Morgen nach der Paarung und Trennung der begatteten Weibchen aus dem Deckrüden, indem man sie in einem anderen Käfig. Noon der Tag, an dem Gegenstecker beobachtet wird, gilt als Embryonaltag 0,5 (E0.5) der Entwicklung.
- An E8.5 (oder die gewünschte Stufe, falls abweichend), Opfer der Maus mit einem genehmigten Protokoll.
- Wet den Bauch des Tieres eingeschläfert mit 70% Ethanol und öffnen Sie die Bauchhöhle. Die Implantation Seiten auf das Vorhandensein von Embryonen sind als "Perlen auf einer Schnur" Anordnung entlang der Länge der einzelnen Uterushorn (Abbildung 1A) gesehen. Mit einer Schere, entfernen Sie beide Uterushörner, schneiden Sie jeden Implantationsstelle einzeln zu trennen (Abbildung 1B) und legen Sie sie in eine 100 mm Petrischale mit Raumtemperatur (RT) Dissektion (DMEM, 10% fötalem Rinderserum, 20 mM HEPES pH 7,4 , 60 pg / ml Penicillin, 2 mM Streptomycin).
- Mit einer Pinzette entfernen jedem Embryo und dem umgebenden Membranen aus dem Uterus-Gewebe (Abbildung 1C) und legen Sie sie in frische Dissektion Medium.
- Isolieren einzelner Embryonen unter einem Binokular mit einer Pinzette. In diesem Stadium in der Entwicklung werden die Embryonen durch die parietalen Dottersack, die Kontakte der deciduum Gewebe, das viszerale Dottersack und Amnion. Umgeben Das Amnion ist eine transparente Membran, die in direktem Kontakt mit dem Embryo. Die viszerale Dottersack liegt zwischen dem Amnion und der parietalen Dottersack und ist leicht in E8.5-E9.5 Embryonen durch die Anwesenheit von prominenten Blutgefäße, die den Embryo ernähren zu unterscheiden. Nehmen Sie jedes Embryo aus den umliegenden Membranen und Transfer individuell in eine neue Platte mit Dissektion Medien, um überschüssiges Blut zu entfernen. Die Entwicklungsphase kann vom Embryo zum Embryo und zwischen den Würfen variieren; Vertreter E8.5 Embryonen und ein Vertreter E9.5 Embryonen sind in Abbildung 1D gezeigt.
- Übertragen Sie jede Embryo zu einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 200 ul der Dissektion Medien (beschrieben in Schritt 4 oben).
2. Homogenisierung der isolierten Embryo
- Fügen Sie 20 Einheiten Collagenase Typ II in einem Volumen von 200 ul (verdünnt in 1X Dubbecco die Phosphate Buffered Saline; DPBS) zu jedem Eppendorf-Röhrchen.
- Schütteln Sie Proben in einem 37 ° C Schüttler bei 100 rpm für 20 min.
- Resuspendieren und durch Pipettieren zu Klumpen von Zellen zu zerstören.
- Übernehmen Sie die Zellsuspension auf der Oberseite des sterilen Zellsieb (40 um Maschenweite) über ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gegeben.
- Unmittelbar gelten 600 ul der Raumtemperatur 1X DPBS am oberen Rand der Zelle Sieb, um die Trennung zu vervollständigen. Entsorgen Sie das Sieb.
- Centrifuge Proben bei 4 ° C bei 4000 xg für 5 min.
- Überstand verwerfen.
- Das Pellet in 1 ml RT 1X DPBS.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 4000 xg für 1 min bei RT.
- Überstand verwerfen.
- Das Pellet in 200 ul RT Dissektion Medien.
- Zählen Sie die embryonalen Zellen. Es ist ein durchschnittliches 3-5 x 10 6 cells/E8.5 Embryo.
3. Cross-Link Chromatin
- Add 5,6 ul 37% Formaldehyd, die 200 ul Proben für eine Endkonzentration von 1% Formaldehyd.
- Inkubieren Proben für 10 min bei RT.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 4 ° C bei 4000 xg für 3 min.
- Überstand verwerfen.
- Resuspendieren der Zellen mit kaltem 1X DPBS mit 80 ul / ml Protease-Inhibitor-Cocktail (PIC).
- Centrifuge Proben bei 4 ° C bei 4000 xg für 3 min.
- Überstand verwerfen. In diesem Schritt können die Proben bei -80 ° C eingefroren werden Die gefrorenen, vernetzten Proben sind über mehrere Monate stabil.
4. Beschallung
- Zellpellet in 100 ul RT SDS Lysepuffer (50 mM Tris-HCl (pH 8,1), 10 mM EDTA und 1% SDS mit frisch hinzu PIC bei 1 ul ul PIC/800 Gesamtvolumens). Wenn resuspendiert, fügen Sie eine zusätzliche 100 ul RT SDS Lysepuffer Resuspension zu fördern. Gut mischen durch Pipettieren und Inversion.
- Inkubieren Sie die Zellsuspension auf Eis für 10 min.
- Ultraschallbad lysierten Zellen zu scheren DNA zwischen 200 und 500 Basenpaaren mit einem Diagenode Bioruptor ™ UCD200 (5 min x 8 Mal: Einstellung der Amplitude von 30 sec on/30 sec off auf hohe (320 Watt) Leistung). Die Proben sollten durch eine Eisbrei umgeben sein. Lassen Sie die Proben auf über 4 ° C warm oder zu frieren. Es gibt viele Arten von sonicators zur Verfügung. Beschallung Bedingungen sollten für jeden Sonicator optimiert werden, um in das Scheren des vernetzten DNA auf einer Länge von ca. 500 bp ergeben.
- Centrifuge beschallt Proben bei 4 ° C bei 14000 xg für 10 min.
- Transfer der Überstand in ein frisches Eppendorf-Röhrchen auf Eis vorgekühlt.
- Teilen Sie die beschallte Probe in maximal 5 Portionen. Wir haben empirisch festgestellt, dass eine E8.5 Embryonen in 5 Aliquots aufgeteilt werden kann. Kleinere oder größere Probenmengen kann entsprechend skaliert werden. Bei diesem Schritt kann die Probe bei -80 ° C gelagert werden bis zur weiteren Verwendung.
- Reserve ein Aliquot für die Verwendung als Eingang und bei -20 ° C bis Schritt 6, wenn das Cross-Links aufgelöst werden. Verdünnen Sie die anderen Aliquots 10-fach in ChIP-Verdünnungspuffer (16,7 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1,2 mM EDTA, 1,1% Triton X-100, 167 mM NaCl und 0,01% SDS) mit frisch hinzu PIC bei 1 μl/800 ul Puffer.
5. Pre-Clearing-und Immunpräzipitation
- Pre-clear die verdünnte Überstand mit 75 ul Lachs-Sperma DNA / Protein A oder G Agarose-50% Gülle bei 4 ° C, mit der Rotation für 1 Stunde. Verwenden Sie entweder Protein A oder Protein G Kügelchen durch den Antikörper für die Chip verwendet werden bestimmt sein sollte. Zum Beispiel sind Protein-A-Perlen für Kaninchen-Antikörper empfohlen, während Protein G Kügelchen für Ziegen-Antikörper oder Maus IgG 1-Antikörper empfohlen. Nähere Informationen finden Sie unter den Empfehlungen der Raupe Herstellers.
- Zentrifuge bei 4 ° C bei 2500 xg für 1 min.
- Übertragen Sie den Überstand auf eine neue, vorgekühlte Eppendorf-Röhrchen.
- Add-Antikörper (4 pg / Probe), die bereits geklärten Aliquot und inkubieren Nacht bei 4 ° C mit Rotation.
6. Das Waschen des Chromatin-Protein-Bead-Komplex
- Add 60 ul Salmon Sperm DNA / Protein A oder G-Agarose Suspension in jedes Fläschchen und inkubieren Sie bei 4 ° C mit Rotation für 1 Stunde. Verwenden Sie die gleiche Art Wulst für Pre-Clearing im obigen Schritt 3 verwendet.
- Zentrifuge bei 4 ° C bei 1000 xg für 1 min.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen. Halten Sie die DNA-Protein-Bead-Komplex auf dem Eis.
- Resuspendieren und waschen das Pellet wie unten mit Waschpuffer 1, 2 gerichtet, 3 und 4. Wash-Puffer 1-3 gekühlt bis 4 ° C und Waschen mit dieser Puffer bei 4 durchgeführt werden sollte ° C. Waschpuffer 4 sollte bei Raumtemperatur und wäscht mit diesem Puffer werden sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Jeder waschen für 5 Minuten mit einer Rotation bei der entsprechenden Temperatur. Nach jedem Waschen, Zentrifuge bei 4 ° C (Raumtemperatur Waschpuffer 4 Waschgänge) bei 1000 xg für 1 min, dann vorsichtig absaugen oder entfernen Sie den Überstand.
Puffer 1: Low Salz Waschpuffer (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100,
150 mM NaCl und 0,1% SDS), 1 ml x 2 Wäschen.
Buffer 2: High Salz Waschpuffer (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100,
500 mM NaCl und 0,1% SDS), 1 ml x 2 Wäschen.
Buffer 3: LiCl Salz Waschpuffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM EDTA, 1% IGEPAL-CA630,
0,25 M LiCl und 1% Desoxycholsäure (Natriumsalz)), 1 ml x 1 zu waschen.
Buffer 4: TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM EDTA), 1 ml x 2 Wäschen.
7. Die Elution der Chromatin-Antikörper-Komplex
- Resuspendieren gewaschen Chromatin-Protein-Bead-Komplex in 250 ul frisch zubereiteten Elutionspuffer (1% SDS, 0,1 M NaHCO 3). Kräftig Wirbel der Probe für 5 Sekunden, dann bei RT für 15 min mit Rotation inkubiert.
- Zentrifuge bei 2500 xg für 1 min bei RT und übertragen Sie die Eluat in ein neues Eppendorf-Röhrchen.
- Wiederholen Sie die Schritte 1 und 2 und die Eluate miteinander kombinieren in der gleichen Eppendorf-Röhrchen. Die Eluate sollte bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Nach Abschluss dieser Schritt kann die Eluate bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung gespeichert werden.
8. Reverse-Cross-Link und Recover DNA
- Fügen Sie 20 ul 5 M NaCl für 500 ul Eluat (40 ul / ml für die Eingabe-Steuerung).
- Erhitzen Sie die Eluate bei 65 ° C im Wasserbad für 4 h bis über Nacht.
- 10 &mgr; l jeder Probe (einschließlich der Eingabe-Steuerung) kann auf einem 2% Agarosegel neben Größenmarkern Spanning 0,1 bis 1 kbp der DNA-Fragmentgröße Prüfung ausgeführt wird. Die DNA wird als ein Abstrich erscheinen und nicht eine scharfe Bande. Der Rest der Proben bei 65 belassen werden ° C, während das Gel läuft.
- Wiederherstellen der DNA aus jeder Probe mit Hilfe eines QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Add 600 ul Puffer QG (im Lieferumfang des Kits) zur DNA-Adsorption mit der Silica-Membran in einer QIAquick Spin-Säule und 200 ul Isopropanol in einem 500 ul Probe zu optimieren. Beachten Sie, dass QG Puffer ein pH-Indikator ermöglicht eine einfache Bestimmung des pH-Wertes der Probe enthält. Wenn die Farbe der Probe von gelb bis violett (pH> 7,5) nach dem Mischen, fügen Sie 10 ul 3 M NaAcetate (pH 5,2) auf die Probe und mischen. Dies reduziert den pH-Wert der Mischung auf DNA-Bindung an die Perlen in der Spalte zu maximieren.
- Vor dem Beladen der Säule, prüfen Sie die Mischung, um festzustellen, ob eine SDS Niederschlag vorhanden ist. Wenn SDS Niederschläge aufgetreten ist, sollte die Probe in einem erwärmt werden42 ° C Wasserbad, bis der Niederschlag verschwindet.
- Legen Sie 700 ul der Mischung in die QIAquick Spin-Säule (lila Säule im Kit) und Zentrifuge bei RT bei 14000 xg für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch aus der Säule, bevor Sie fortfahren und wiederholen Sie diesen Schritt mit dem Rest der Probe.
- Add 500 ul QG Puffer auf die Säule zu waschen. Zentrifuge bei RT bei 14000 xg für 2 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch aus der Säule, bevor Sie fortfahren.
- Die Säule wird mit 700 ul PE Waschpuffer (im Lieferumfang des Kits), auf die Ethanol wurde hinzugefügt, wie vom Hersteller angewiesen. Zentrifuge bei RT bei 14000 xg für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch aus der Säule, bevor Sie fortfahren.
- Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt vollständig zu entfernen den Rest der PE-Puffer von der Säule. Verwerfen Sie den Durchfluss durch und das Sammelrohr.
- Eluieren DNA aus der Säule in ein frisches Eppendorf-Röhrchen durch Zugabe von 60 ul EB-Puffer (Elutionspuffer im Kit mitgeliefert).
- Zentrifuge bei Raumtemperatur bei 14000 xg für 1 min. Die eluierte DNA kann bei -20 ° C bis zur Erkennung gespeichert werden. A 260 Lesungen des gewonnenen Materials in der Regel weisen Konzentrationen von 90-120 ng / ul, für eine vollständige Erholung von ~ 6-7 ug pro Aliquot. Allerdings ist das A 260/280 Ratio dieser Proben in der Regel> 1,8, was darauf hindeutet, dass RNA in der Probe vorhanden ist. So ist die genaue Menge der verwerteten DNA kann niedriger sein.
9. Die Analyse der DNA Recovered
- SDS kann mit der Aktivität der Taq-Polymerase PCR stören. SDS sollte vollständig, bevor PCR entfernt werden. Inkubieren Sie die DNA auf Eis zu fällen restliche SDS und Zentrifuge bei 4 ° C bei 14000 xg für 1 min. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Eppendorf tube.This Schritt wird dringend empfohlen.
- Die DNA-Eluate kann entweder durch konventionelle PCR oder durch quantitative real-time PCR (Q-PCR) mit Primern spezifisch für jede zu analysierende Sequenz erkannt werden. 10.05 ul von Gesamt-DNA-Eluat kann für eine PCR oder Q-PCR-Reaktion verwendet werden. PCR mit dem Eingang Steuerung kann mit einer 5-10 fachen Verdünnung der DNA verglichen mit der Menge der anderen Proben durchgeführt werden. PCR-und Q-PCR-Bedingungen variieren, erfordert jedoch die begrenzte Menge an Ausgangsmaterial zusätzliche PCR-Zyklen. Für die konventionelle PCR-Nachweis, empfehlen wir, beginnend mit 40 Zyklen und Anpassung wie nötig.
10. Repräsentative Ergebnisse
Wir haben dieses Protokoll verwendet, um ChIP von beiden E8.5 und E9.5 Embryonen (Abbildung 2) durchzuführen. Die Ergebnisse zeigen, dass Myogenin auf dem Myogenin Promotor in E8.5 und E9.5 Embryonen ist. ChIP gereinigt DNAs wurden durch konventionelle PCR (Abbildung 2A) und durch quantitative real-time PCR (Abbildung 2B) analysiert. Im Gegensatz dazu gab es keine Anzeichen von Myogenin Bindung an die Myogenin Promotor in den Dottersack, wo Myogenin nicht exprimiert wird. Die Interferon-γ (IFN &ggr;)-Promotor, die Sequenzen passend zum Myogenin Bindungsstelle enthält, wurde als negative Ablaufsteuerung eingesetzt. Wie erwartet, war Myogenin nicht auf die IFNy Promotor in jeder der Gewebeproben getestet gebunden. , Die die Vorläufer der Skelettmuskulatur sind; In E8.5 und 9,5 Embryonen ist Myogenin speziell in den Somiten (6,10 Abb. 3) ausgedrückt. So die Ergebnisse zeigen, dass Myogenin die Myogenin Promotor in der Somiten bei E8.5 und E9.5 gebunden ist.
Abbildung 1. E8.5 Embryonen Dissektion. (A) Isolierte Uterushorn (oben; höherer Vergrößerung im unteren Bereich, gezeigt). (B) Uterushorn mit einer Schere schneiden auch auf individuellen Nidationsstellen mit einzelnen Embryonen zu trennen. (C) Embryonen ragt aus uterine Gewebe während der Präparation. Pfeile markieren Embryonen noch von extra-embryonalen Gewebe bedeckt. (D) Zwei E8.5 Embryonen aus dem gleichen Wurf. Der Embryo auf der linken Seite hat nicht den Prozess der Umwandlung begonnen. Der Embryo auf der rechten Seite wird derzeit dreht. Ganz rechts - Vertreter E9.5 Embryonen.
Abbildung 2. ChIP-Assay demonstriert Myogenin Bindung an die Myogenin Promotor in E8.5 und E9.5 Embryonen. (Top) Konventionelle PCR-Analyse von 5 ul der DNA von Chip-Experimente mit einem Myogenin Antikörper oder unspezifische IgG wurde mit Primern, die einen Teil der Myogenin Förderer von -79 bis +69 relativ zum Start der Transkription verstärken durchgeführt gereinigt, dass enthält eine Myogenin Bindungsstelle bei -12 oder Primer, dass ein Teil der IFNy Promotor, der eine Sequenz passend zum Myogenin Bindungsstelle befindet ~ 1075 bp stromaufwärts von der Transkriptions-Startstelle enthält verstärken entfernt. Die IFNy Primersequenzen verwendet wurden 5'-GCT GAC TCA AGA CCC CGA GGC-3 'und 5'-TGA GGA GGC TGG AGG AGG CC-3'. (Bottom) Quantitative Real-time PCR-Analyse der gleichen Proben in (A) verwendet. DieStandardabweichung - Daten werden als% des Eingangs + / aufgetragen.
Abbildung 3. Myogenin ist speziell in den Somiten von E8.5 und E9.5 Embryonen geäußert. Whole mount in situ Hybridisierung von Myogenin zeigt spezifische mRNA-Expression in den Somiten. Größe bar in E8.5 Bild - 200 um. Größe bar in E9.5 Bild - 500 um.
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Discussion
In der beschriebenen ChIP-Protokoll zeigen wir, dass die myogene Regler Myogenin mit dem Myogenin Promotor in der Skelettmuskulatur Vorläuferzellen Gewebe in einzelne E8.5 und E9.5 Embryonen verbunden ist. Frühere Studien haben ausführlich Myogenin Bindung an E-Box enthält Sequenzen aus, beginnend mit dem ersten in vitro Gel-Shift-Experimente unter Verwendung in vitro übersetzt oder bakteriell produzierten Myogenin und radioaktiv markierten DNA-Codierung der relevante Teil der Zielgen regulatorische Sequenzen 11-20. Herkömmlichen Chip-Studien haben Myogenin Bindung an die Myogenin Promotor in Gewebekultur-Modelle für Myogenese 21-24 gezeigt. Es gibt jedoch keinen Beweis dafür, dass Myogenin bindet an den Myogenin Promoter während der embryonalen Entwicklung der Skelettmuskulatur, wenn man vorhersagen könnte dies der Fall später in der Embryogenese basiert auf der Down-Regulation der Myogenin Ausdruck in E15.5 Zunge Gewebe aus Myogenin beobachtet demonstriert defizienten Mäusen 25. So die Daten belegt, dass die Interaktion zwischen Myogenin und die Myogenin Promoter Interaktion in vivo auftritt. Eine naheliegende Anwendung dieser Technik ist, es zu benutzen, um die physiologische Relevanz der früheren Studien charakterisieren Gewebe-spezifische Genaktivierung Gewebe unter Verwendung von Kultur-Modellen zu überprüfen. Je mehr interessante Anwendung ist diese Technik als Teil der ersten Charakterisierung eines neuen oder bisher nicht charakterisierter Faktor für die physiologische Relevanz einer spezifischen Wechselwirkung vor der Durchführung Gewebekultur Studium an Verständnis funktioneller mechanisms.The Protokoll, festzustellen, verwenden, können ebenfalls verwendet werden, um direkt zu vergleichen Protein: Chromatin auftretenden Wechselwirkungen zu bestimmten Entwicklungsstadien in Maus-Modellen mit einem technischen Genmanipulation.
Wir gehen davon aus, dass diese Methode auch für die Zeit natürlich Studien von Gewebe-spezifischen Genregulation während der Entwicklung nützlich. Durch die Bewertung spezifischer Faktor: Chromatin-Wechselwirkungen bei verschiedenen embryonalen Stadien, könnte man den Zeitpunkt, an dem der Faktor Interaktion erfolgt zunächst zu identifizieren, könnte feststellen, ob die Interaktion während und nach der Differenzierung Prozess wurde beibehalten oder mehr vorübergehender Natur, und könnte die Bestimmung Reihenfolge der Faktor verbindlich, wenn mehrere Faktoren, die mit einer bestimmten Reihenfolge zu interagieren. Schließlich planen wir, dass das Protokoll zu einem re-ChIP Verfahren 26, wobei das Chromatin aus einer Immunpräzipitation wieder zu einer zweiten Immunpräzipitation mit einem Antikörper gegen einen anderen Faktor angenommen, dass die Zusammenarbeit, die die gleiche Stück von Chromatin unterzogen ausgedehnt werden könnten. Die re-ChIP-Protokoll bietet mehr schlüssig nachweist, dass zwei verschiedene Faktoren auf dem gleichen Stück von Chromatin sind, die wahrscheinlich Voraussetzung für diese Änderung würde eine Erhöhung der Menge des Ausgangsmaterials werden.
Eine bemerkenswerte Erkenntnis, dass aus unseren Bemühungen kam, war, dass die begrenzte Menge an Ausgangsmaterial nicht das Hindernis für den Erfolg, dass man vorausgesagt haben, zumal die Gewebekultur Zelle basierte Protokolle und schlagen oft mit einer homogenen Bevölkerung von Millionen oder zehn Millionen ab Zellen 26,27. Der Erfolg unserer Bemühungen spricht für die primäre (und oft unkontrollierbaren) Voraussetzung für die Antikörper, die spezifische Immunpräzipitation des Faktors untersucht. Sobald ein Antikörper als fähig Immunpräzipitation identifiziert wird, kann der Prüfer dem ChIP-Assay durch Titration die Menge der verwendeten Antikörper zu optimieren. Es ist wichtig zu beachten, dass mehr nicht immer besser ist, finden wir häufig, dass zu viel Antikörper, vor allem mit Proben von begrenzte Menge, führt zu einer höheren Hintergrund Bindung an irrelevant Sequenzen. Darüber hinaus der Immunglobulin-Fraktionen oder affinitätsgereinigten Antikörper verwenden häufig in unteren Hintergrund Ergebnis als nicht Verwendung von Antiseren. Hintergrund von der Kontroll-Antikörper können häufig durch die Aufnahme einer Probe mit Perlen ohne Antikörper gemessen werden.
Wir schließen daraus, dass die Verwendung von Embryonen im Frühstadium für ChIP Analyse von Protein: Chromatin-Wechselwirkungen, die bei der Aktivierung von Gewebe-spezifische Gene auftreten hat das Potenzial, wichtige Einblicke in die Einleitung und Aufrechterhaltung von Gewebe-spezifische Gen-Expression-Programme bieten direkt im Kontext der Entwicklung .
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Disclosures
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der University of Massachusetts Medical School IACUC gesetzt durchgeführt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH R01 GM56244 zu ANI, die Gelder durch den American Recovery and Reinvestment Act of 2009 ausgezeichnet umfasst, und durch den NIH R01 GM87130 zu Jarp
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChIP Assay Kit | Upstate, Millipore | 17-295 | |
| Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS |
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 12100-061 | High glucose content |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free |
| Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit |
| Penicillin/streptomycin stock solution | GIBCO, by Life Technologies | 5000 μg/ml concentration | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Salmon sperm DNA /Protein A agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | |
| Normal rabbit IgG | EMD Millipore | 12-370 | |
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | |
| GoTaq Q-PCR master mix | Promega Corp. | A6001 |
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