Summary
Biz fare embriyonik doku doku-spesifik gen ekspresyonu başlangıcı sırasında veya sonrasında doku spesifik genlerin faktör etkileşimleri belirlemek için yöntem bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) göstermektedir. Bu protokol, normal embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkan doku-spesifik gen aktivasyon çalışması için yaygın olarak uygulanabilir olmalıdır.
Abstract
1-3 canlı hücreler bağlamında ortaya çıkan kromatin etkileşimleri: Kromatin immunoprecipitation (ChIP) protein tanımlamak için güçlü bir araçtır. Bu teknik yaygın birincil doku, doku kültürü hücrelerinde daha az bir ölçüde istismar ve olmuştur. ChIP kemirgen embriyonik gelişimin erken dönemlerinde özellikle doku, uygulaması, sınırlı miktarda doku ve embriyonun hücre ve doku tiplerinin heterojenite karmaşıktır. Burada ayrışmış bir embriyonik gün 8.5 (E8.5) embriyo kullanarak ChIP gerçekleştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Kromatin etkileşimleri tek bir E8.5 embriyo makaslanmış kromatin beş alikotları, denetimleri ve özel protein soruşturma için müfettiş yeterli malzeme sağlar içine kadar bölünmüş olabilir.
Özellikleri, doku-spesifik gen ekspresyonu programlar sırasında kromatin etkileşimleri: Biz protein belge başlamak için bu tekniği kullanmış olması. Kromatin etkileşimleri tüm etkileşimler meydana olsun ayrım yapmadan, bir alt kümesidir, ya da tek bir hücre tipi (ler): Sonuç protein saptanması, çünkü bir embriyo hücre tiplerinin heterojenite mutlaka bu tekniğin uygulama kısıtlar. Ancak, sırasında doku spesifik genlerin incelenmesi veya doku belirli bir gen ekspresyonu başlangıcını izleyen iki nedenden dolayı mümkün. İlk olarak, doku spesifik faktörlerin immunoprecipitation mutlaka faktör ifade edilen hücre tipi kromatin izole eder. İkincisi, gen aktivasyonu ile ilişkili olan post-translasyonel modifikasyonlar içeren koaktivatörleri ve histon, immunoprecipitation sadece gen olan hücre tipi genler ve gen düzenleyici dizileri olmalıdır ya da aktif olmuştur. Tekniği, doku-spesifik gen aktivasyonu olayları incelemek için geçerli olmalıdır.
Örneği aşağıda tarif edilen, bağlayıcı faktör incelemek için bir iskelet kas belirli bir gen promoter E8.5 ve E9.5 fare embriyoları kullanılmıştır. E8.5-9.5 4,5 Somitlerin, gövde, kol ve bacakların iskelet kaslarının formunu hangi habercisi dokularda bulunur. Myogenin iskelet kası farklılaşması 6-9 için gerekli düzenleyici bir faktör. Myogenin E8.5 ve E9.5 embriyolar kendi organizatörü ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Myogenin sadece 6,10 gelişme bu aşamada Somitlerin ifade olduğundan, veri kendi organizatörü myogenin etkileşimleri zaten E8.5 embriyolar iskelet kas öncü hücrelerinde meydana gelmiş olduğunu göstermektedir.
Protocol
1. Embriyoların izolasyonu
Not: fareler içeren tüm işlemler uygun hayvan bakımı ve kullanım ilkeleri ve protokolleri doğrultusunda yapılmalıdır
- Sabah çiftleşmeden sonra dişi fare, bir çiftleşme fişi varlığı için kontrol edin ve onlara farklı bir kafese koyarak damızlık erkek evlendirilen kadın ayrı. Çiftleşme fişi görülmektedir gün Noon embriyonik gelişim günde 0.5 (E0.5) olarak kabul edilir.
- E8.5, (ya da istenen sahne, eğer farklıysa), onaylı bir protokolü kullanarak fare kurban.
- % 70 etanol ile ötenazi hayvanın karın Islak ve karın boşluğu açmak. Gelişmekte olan embriyolar varlığını gösteren uygulama yerlerinin her rahim boynuz uzunluğu boyunca (Şekil 1A) bir ipe boncuk "düzenleme" olarak görülüyor. Makaslar kullanılarak, hem de rahim boynuzları kaldırmak ayrı ayrı ayrı her implantasyon sitesi kesmek (Şekil 1B) ve oda sıcaklığında (RT) içeren bir 100 mm petri koyun diseksiyonu orta (DMEM,% 10 fetal sığır serumu, 20 mM HEPES pH 7.4 60 mcg / ml penisilin, 2 mM streptomisin).
- Forseps kullanarak, rahim dokusu (Şekil 1C) her embriyo ve çevresindeki membranlar kaldırmak ve taze diseksiyonu orta koyun.
- Forseps kullanarak bir diseksiyon mikroskop altında bireysel embriyolar izole edin. Geliştirme Bu aşamada, embriyoların, paryetal yolk kesesi, rehber deciduum doku, visseral yolk kesesi ve amniyon. Ile çevrili Amniyon embriyo ile doğrudan temas halinde olan şeffaf bir zar. Visseral sarısı kesesi, amnion ve paryetal yolk kesesi arasında yer alır ve kolayca E8.5-E9.5 embriyolar embriyo beslemek önde gelen kan damarlarının varlığı ile ayırt edilir. Çevresindeki membranlar, her embriyo çıkarın ve aşırı kan çıkarmak için diseksiyon medya içeren yeni bir plaka içine ayrı ayrı transferi. Gelişimsel aşamada, embriyo embriyoya litre arasında değişebilir; temsilcisi E8.5 embriyo ve bir temsilcisi E9.5 embriyo Şekil 1D gösterilmiştir.
- 200 ul diseksiyonu medya (yukarıdaki 4. adımda açıklandığı gibi) içeren 1.5 ml Eppendorf tüp her embriyo transferi.
2. İzole Embriyo, Homojenizasyon
- Her Eppendorf tüpüne 200 ul hacmi (DPBS 1X Dubbecco Fosfat seyreltilmiş Tamponlu Salin) 20 adet kollajenaz tip II ekleyin.
- 37 ° C çalkalayıcı numune 100 rpm'de 20 dakika süreyle hafifçe sallayın.
- Hücre kümeleri bozabilir pipetleme iyi süspanse edin.
- Hücre süspansiyonu, 1.5 ml Eppendorf tüp üzerine yerleştirilir steril hücre süzgeç (40 mikron mesh boyutu) üstüne sürün.
- Ayrımını tamamlamak için oda sıcaklığında hücre süzgeç üstüne 1X DPBS 600 ul hemen geçerlidir. Süzgeç atın.
- 4 örnekleri Santrifüj ° C, 5 dakika için 4000 xg'de.
- Süpernatantı atın.
- RT 1X DPBS 1 ml pelletini tekrar.
- Örnekleri oda sıcaklığında 1 dakika için 4000 xg'de santrifüjleyin.
- Süpernatantı atın.
- 200 RT diseksiyon medya ul pelletini tekrar.
- Embriyonik hücre sayımı. Ortalama 3-5 x 10 6 cells/E8.5 embriyo vardır.
3. Çapraz bağlantı Kromatin
- % 1 lik formaldehit nihai konsantrasyonu 200 ul örnekleri% 37 formaldehit 5.6 ul ekleyin.
- Örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
- 4 ° C ile 3 dakika 4000 xg'de numuneleri santrifüjleyin.
- Süpernatantı atın.
- 80 ul / ml proteaz inhibitörü kokteyl (PIC) içeren soğuk 1X DPBS hücreleri yeniden süspanse edin.
- 4 örnekleri Santrifüj ° C, 3 dakika 4000 xg'de.
- Süpernatantı atın. Bu aşamada, numuneler -80 dondurulmuş ° C Dondurulmuş, çapraz örnekleri, birkaç ay boyunca stabildir.
4. Sonikasyon
- RT SDS lizis tamponu (taze eklendi PIC 1 ul PIC/800 ul toplam hacmi 50 mM Tris-HCl (pH 8.1), 10 mM EDTA ve% 1 SDS) 100 ul hücre pelletini tekrar. Yeniden süspanse, RT SDS lizis tamponu tabanda teşvik etmek için ek bir 100 ul ekleyin. Pipetleme ve tersine çevirerek iyice karıştırın.
- 10 dakika buz üzerinde hücre süspansiyonu inkübe edin.
- 200 ile 500 basepairs Diagenode Bioruptor kullanarak kesme DNA parçalanmış hücreleri sonikasyon ™ UCD200 (5 dak x 8 kez 30 sn on/30 sn: yüksek (320 watt) güç genlik ayarı). Örnekleri bir buz bulamaç çevrili olmalıdır. Örnekler 4 ° C üzerinde sıcak veya dondurmak için izin vermeyin. Kullanılabilir sonicators birçok türü vardır. Yaklaşık 500 bp uzunluğunda çapraz bağlı DNA makaslama sonucu her sonikatör Sonikasyon koşulları için optimize edilmelidir.
- 4 sonicated örnekleri Santrifüj ° C'de 10 dakika süreyle 14000 xg'de.
- Ttaze bir Eppendorf tüp buz üzerinde önceden soğutulmuş süpernatant ransfer.
- 5 alikotları maksimum sonicated örnek bölün. Ampirik bir E8.5 embriyo 5 alikotları ayrılabilir olduğunu tespit ettik. Küçük veya büyük örneklem büyüklüğü buna göre ölçeklendirilebilir. Bu aşamada, örnek -80 ° C daha sonra kullanmak kadar saklanabilir.
- Rezerv çapraz bağ tersine dönecek kadar -20 ° C adım 6 giriş ve deposu olarak kullanmak için bir kısım. Seyreltik 1 μl/800 taze eklendi PIC içeren ChIP seyreltme tamponu (16.7 mM Tris-HCl (pH 8.1), 1.2 mM EDTA,% 1.1 Triton X-100, 167 mM NaCl ve% 0,01 SDS) 10 kat, diğer alikot ul tampon.
5. Ön temizleme ve Immunoprecipitation
- Pre-açık Salmon-Sperm DNA / Protein 4 A veya Agaroz G-50% bulamaç ° C, döndürme, 1 saat 75 ul ile seyreltilmiş süpernatant. A veya Protein G boncuk ChIP için kullanılacak antikor tespit edilmelidir iki Protein kullanın. Örneğin, protein G boncuk keçi antikorları veya fare IgG 1 antikorlar için önerilen ise protein A boncuk, tavşan antikorları için önerilir. Daha ayrıntılı bilgi için, boncuk üreticisi tarafından yapılan tavsiyelere bakın.
- 4 ° C'de 1 dakika için 2500 xg'de santrifüjleyin.
- Yeni bir ön soğutmalı Eppendorf tüp süpernatantı aktarın.
- Önceden temizlenmiş kısım antikor (4 mikrogram / örnek) ekleyin ve 4 gece inkübe ° C dönüş.
6. Çamaşır Kromatin-protein-boncuk Kompleksi
- 4 ° C rotasyon ile 1 saat süreyle inkübe içine her şişe ve Somon Sperm DNA / Protein A veya G agaroz bulamaç 60 ul ekleyin. 3. adımda ön temizleme için kullanılan aynı boncuk türü kullanın.
- 4 ° C'de 1 dakika için 1000 xg'de santrifüjleyin.
- Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın. DNA-protein-boncuk kompleksi buz üzerinde tutun.
- Süspanse edin ve yıkama tamponlar 1, 2 ile aşağıda yönettiği pelet, 3, ve 4 yıkayın. 1-3, 4 ° C ve bu tamponlar ile yıkama yapılmalıdır 4 soğutulmuş olmalıdır tamponlar ° C yıkayın Tampon 4 oda sıcaklığında yapılmalıdır oda sıcaklığında ve bu tamponu ile yıkar olmalıdır yıkayın. Her yıkama uygun sıcaklık rotasyon ile 5 dakika boyunca. 4 ° C (4 yıkama yıkama tamponu oda sıcaklığında) 1 dakika için 1000 xg'de her yıkama, santrifüj, daha sonra dikkatlice aspire veya süpernatantı kaldırmak.
Tampon 1: Düşük tuz yıkama tamponu (20 mM Tris-HCl (pH 8.1), 2 mM EDTA,% 1 Triton X-100,
150 mM NaCl ve% 0.1 SDS), 1 ml x 2 yıkar.
Tampon 2: Yüksek tuz yıkama tamponu (20 mM Tris-HCl (pH 8.1), 2 mM EDTA,% 1 Triton X-100,
500 mM NaCl ve% 0.1 SDS), 1 ml x 2 yıkar.
Tampon 3: LiCl tuz yıkama tamponu (10 mM Tris-HCl (pH 8.1), 1 mM EDTA,% 1 IGEPAL-CA630
0.25 M LiCl ve% 1 deoxycholic asit (sodyum tuzu)), 1 ml x 1 yıkama.
Tampon 4: TE tamponu (10 mM Tris-HCl (pH 8.1), 1 mM EDTA), 1 ml x 2 yıkar.
7. Kromatin-antikor Kompleksi, Elüsyon
- Taze hazırlanmış elüsyon tamponu (1% SDS, 0.1 M NaHCO 3) 250 ul yıkanmış kromatin-protein-boncuk kompleks tekrar 5 saniye sonra rotasyon ile 15 dakika oda sıcaklığında inkübe şiddetle vorteks örnek.
- 1 dakika için 2500 xg'de RT Santrifüj ve yeni bir Eppendorf tüp içine eluat aktarmak.
- 1. ve 2. adımları tekrarlayın ve aynı Eppendorf tüp Eluatlar birleştirmek. Eluatlar oda sıcaklığında tutulmalıdır. Eluatlar bu adımın tamamlanmasından sonra, daha sonra kullanmak kadar -20 ° C'de saklanabilir.
8. Ters Cross-Link ve DNA Kurtar
- 500 ul eluat (giriş kontrolü için 40 ul / ml) 20 ul 5 M NaCl ekleyin.
- Bir gecede 4 saat süreyle su banyosunda 65 ° C Eluatlar ısıtın.
- (Giriş kontrolü de dahil olmak üzere) her bir numune 10 ul DNA parçası boyutunu kontrol etmek için 0.1 ile 1 kbç kapsayan boyutu işaretleri yanında% 2 agaroz jel üzerinde çalıştırılabilir. DNA bir karalama olarak görünür ve keskin bir grup değil. Örneklerin geri kalanı 65 bırakılabilir ° C jel çalışırken.
- QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti (Qiagen) kullanılarak her örnek DNA kurtarın. QIAquick spin kolon ve 500 ul örnek içine izopropanol 200 ul silika membran ile DNA adsorpsiyon optimize etmek için 600 ul QG tampon (kit verilen) ekleyin. QG tampon numunenin pH kolay belirlenmesi sağlayan bir pH indikatörü içerdiğini unutmayın. Numunenin rengi mor sarı çıkarsa (pH> 7.5) karıştırıldıktan sonra, 3 M NaAcetate 10 ul örnek ve karıştırmak için (pH 5.2) ekleyebilirsiniz. Bu sütunda boncuk bağlayıcı DNA en üst düzeye çıkarmak için karışımın pH azaltır.
- Sütun yüklemeden önce, herhangi bir SDS çökelti olup olmadığını belirlemek için karışımı kontrol edin. SDS yağış meydana gelmişse, örnek bir ısıtılmalıdır.42 ° C su banyosu çökelti kaybolana kadar.
- Karışımı 700 ul QIAquick spin kolon (kit mor sütun) içine yerleştirin ve oda sıcaklığında 1 dakika süreyle 14000 xg'de santrifüj. Devam etmeden önce sütun üzerinden akış atın ve numunenin geri kalanı ile bu adımı tekrarlayın.
- Sütun yıkamak için 500 ul QG tampon ekleyin. 2 dakika süreyle 14000 xg'de RT santrifüjleyin. Devam etmeden önce sütun üzerinden akış atın.
- Sütun üretici tarafından talimat olarak etanol eklendiği PE yıkama tamponu 700 ul (kit verilen) ile yıkayın. 1 dakika için 14000 xg'de RT santrifüjleyin. Devam etmeden önce sütun üzerinden akış atın.
- Sütun PE tampon kalanı tamamen kaldırmak için santrifüj adımı yineleyin. Üzerinden akışı ve toplama tüpüne atın.
- 60 ul EB tampon (elüsyon tampon kiti) ekleyerek, yeni bir Eppendorf tüp içine sütun Zehir DNA.
- Oda sıcaklığında 1 dakika süreyle 14000 xg'de santrifüjleyin. Elue edilmiş DNA tespiti kadar -20 ° C'de saklanabilir. Kurtarılan malzemenin genellikle 260 okuma ~ kısım ortalama 6-7 ug toplam kurtarma için 90-120 ng / ul konsantrasyonları göstermektedir. Ancak, RNA örnek olduğunu düşündüren bu örnekler A 260/280 oranı, genellikle> 1.8. Böylece atık DNA tam miktarı düşük olabilir.
9 - Kurtarılan DNA Analizi
- SDS PCR Taq polimeraz aktivitesini engelleyebilir. SDS PCR performans önce tamamen çıkarılmalıdır. 14000 xg'de 1 dakika için 4 herhangi bir kalıntı SDS ve santrifüj ° C çöktürmek için buz üzerinde DNA inkübe edin. Yeni bir eppendorf tube.This adım süpernatant transfer şiddetle tavsiye edilir.
- DNA Eluatlar geleneksel PCR ile analiz edilmesi için her sırası için spesifik primerler ile kantitatif gerçek zamanlı PCR (Q-PCR) tarafından da tespit edilebilir. Toplam DNA eluat 5-10 ul bir PCR veya Q-PCR reaksiyonu için kullanılıyor olabilir. PCR ile giriş kontrolü, diğer örneklerin miktarı ile karşılaştırıldığında DNA 5-10 kat seyreltme yapılabilir. Ancak, PCR ve Q-PCR koşulları değişecektir, başlangıç materyalinin sınırlı miktarda ek PCR döngüsü gerektirir. Konvansiyonel PCR için 40 döngü ile başlayan ve gerektiği şekilde ayarlanması önerilir.
10 Temsilcisi Sonuçlar
Biz E8.5 ve E9.5 embriyolar (Şekil 2) hem de ChIP gerçekleştirmek için bu protokol kullandık. Myogenin E8.5 ve E9.5 embriyolar myogenin organizatörü mevcut olduğunu göstermektedir. ChIP saflaştırılmış DNA'lar geleneksel PCR (Şekil 2A) ve kantitatif gerçek zamanlı PCR (Şekil 2B) tarafından analiz edildi. Buna karşılık, myogenin ifade değildir yolk kesesi, myogenin organizatörü bağlayıcı myogenin hiçbir belirti yoktu. Interferon-γ (IFNγ) myogenin bağlayıcı site eşleşen dizileri içeren organizatörü, negatif bir dizi kontrol olarak kullanıldı. Beklendiği gibi, myogenin test edilen doku örneklerinde herhangi bir IFNγ organizatörü bağlı değildi. Iskelet kas öncüleri; E8.5 ve 9.5 embriyolar myogenin özellikle hücre grubu (6,10 Şekil 3) ifade edilir. Böylece sonuçları myogenin E8.5 ve E9.5 Somitlerin myogenin organizatörü bağlı olduğunu göstermektedir.
Şekil 1 E8.5 embriyo diseksiyonu. (A) İzole uterin horn (üst panel, alt panel gösterilen yüksek büyütme). (B) uterin horn, bireysel embriyoları içeren bireysel uygulama yerleri ayrı makasla kesilir. (C) Embriyolar Diseksiyon sırasında rahim dokusundan çıkıntılı. Oklar embriyoların hala ekstra embriyonik doku ile kaplı işareti. (D) İki aynı çöp E8.5 embriyolar. Soldaki embriyo dönüm süreci başlamamıştır. Sağdaki embriyo dönüm geçiyor. Uzak sağ temsilcisi E9.5 embriyo.
Şekil 2 ChIP tahlil E8.5 ve E9.5 embriyolar myogenin organizatörü bağlayıcı myogenin gösteren. Myogenin antikor veya non-spesifik IgG transkripsiyon başlangıç sitesine myogenin organizatörü -79 - 69 göreli bir kısmını yükseltmek primerler ile yapıldı kullanarak ChIP deneylerden elde edilen arıtılmış DNA 5 ul (Üst) Konvansiyonel PCR analizi -12 veya IFNγ organizatörü ~ 1075 bp upstream transkripsiyon başlangıç sitesinde yer alan myogenin bağlayıcı site ile eşleşen bir dizi içeren bir kısmını yükseltmek primerler bulunan bir myogenin bağlayıcı site içermektedir. IFNγ astar dizileri GAC TCA AGA CCC CGA GGC-3 've 5'-TGA GGA TGG GGC AGG AGG CC-3', 5'-GCT edildi. (A) kullanılan aynı örneklerinin (Alt) Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR analizi.standart sapma - veri giriş + / -% olarak çizilir.
Şekil 3 Myogenin E8.5 ve E9.5 embriyolar Somitlerin ifade edilir. Tüm montaj myogenin in situ hibridizasyon Somitlerin spesifik mRNA ekspresyonu gösterir. 200 mikron - E8.5 görüntü Boyut bar. E9.5 görüntü Boyut bar - 500 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Açıklanan ChIP protokolde, miyojenik regülatör myogenin tek E8.5 ve E9.5 embriyolar bulunan, iskelet kas habercisi dokusunda myogenin organizatörü ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Önceki çalışmalar yoğun, 11-20 hedef gen düzenleyici dizilerinin ilgili kısmı kodlama in vitro tercüme veya bakteriyel myogenin ve radyoaktif DNA kullanan in vitro jel vardiya deneylerde ilk başlayan, dizileri içeren E kutusuna bağlayıcı myogenin belirlemiştir . Konvansiyonel ChIP çalışmaları, Miyogenesis 21-24 doku kültürü modelleri myogenin organizatörü için bağlayıcı myogenin göstermiştir . Ancak, bir myogenin E15.5 dil doku gözlenen myogenin ifade aşağı düzenleme dayalı bu embriyogenez daha sonra söz konusu tahmin olabilir ama bu myogenin, embriyonik iskelet kas gelişimi sırasında myogenin organizatörü bağlandığını gösteren hiçbir kanıt yoktur eksikliği olan farelerde 25. Böylece veri myogenin ve myogenin promotor etkileşimi arasındaki etkileşimin in vivo olarak oluşur dair kanıt sağlar. Bu tekniğin bariz bir uygulama, önceki çalışmaların doku-spesifik gen aktivasyonu doku kültür modellerinde yapılan karakterize fizyolojik önemi doğrulamak için kullanmaktır. Daha ilginç uygulama, fonksiyonel mechanisms.The protokol anlamak tasarlanmış doku kültürü çalışmaları gerçekleştirmeden önce belirli bir etkileşim fizyolojik önemi belirlemek için yeni bir ya da daha önce uncharacterized bir faktör ilk karakterizasyonu parçası olarak bu tekniği kullanmak için de kullanılabilir tasarlanmış bir genetik manipülasyon içeren fare modellerinde belirli gelişim aşamalarında oluşan kromatin protein etkileşimleri: doğrudan karşılaştırabilirsiniz.
Biz bu yöntemi de gelişim sırasında doku spesifik gen regülasyonu zaman ders çalışmaları için yararlı olacağını tahmin ediyoruz. Belirli bir faktörün değerlendirilmesinde farklı embriyonik aşamada kromatin etkileşimler, bir faktör etkileşimi ilk meydana geldiği zaman noktası tanımlamak, etkileşim boyunca ve farklılaşma sürecinin dışında tutulan veya doğada daha geçici olup olmadığını belirlemek, ve tespit olabilir faktörü bağlayıcı sırasına göre birden çok faktöre belirli bir sıra ile etkileşim halinde. Son olarak, protokolü bir immunoprecipitation kurtarıldı kromatin ortak işgal kromatin aynı parça olduğuna inanılan farklı bir faktör karşı bir antikor ile ikinci bir immunoprecipitation tabi sayede yeniden ChIP prosedürün 26 uzatılabilir öngörülüyor. Yeniden ChIP protokol kromatin aynı parçaları üzerinde iki ayrı faktör mevcut olduğunu daha kesin bir kanıt sağlar; bu değişiklik için olası gereksinim başlangıç materyalinin miktarda bir artış olacaktır.
Çabalarımız gelen olağanüstü bir gerçekleşme, başlangıç materyalinin sınırlı miktarda bir doku kültürü hücre tabanlı protokoller genellikle homojen bir nüfusa sahip milyonlarca, on milyonlarca başlayan öneririz, özellikle de verilen tahmin olabilir ki başarı için engel olmadığını hücreleri 26,27. Çabalarımızın başarı için birincil faktör soruşturma altında belirli immunoprecipitation yeteneğine antikorları (ve genellikle kontrol edilemeyen) gereksinimi konuşuyor. Antikor immunoprecipitation yeteneğine sahip olarak tanımlanır sonra, araştırmacı, kullanılan antikor miktarı titre ChIP tahlil optimize edebilirsiniz. Her zaman daha iyi değildir dikkat etmek önemlidir; sık sık, özellikle sınırlı miktarda, daha arka planda ilgisiz dizileri için bağlayıcı sonuçlar örnekleri çok fazla antikor bulmak. Buna ek olarak, antiserumlar kullanımı daha sık alt arka planda immünglobulin kesirler veya afinite saflaştırılmış antikorlar kullanın. Arka plan kontrol antikor genellikle herhangi bir antikor olmadan boncuklar içeren bir örnek de dahil olmak üzere gauged olabilir.
Doku spesifik genlerin aktivasyonu sırasında meydana gelen kromatin etkileşimleri doğrudan gelişme bağlamında, doku-spesifik gen ekspresyonu programları indüksiyonu ve idamesinde önemli bir anlayış sağlamak için bir potansiyele sahiptir: Biz protein ChIP analiz için erken evre embriyoları kullanılarak olduğu sonucuna .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
University of Massachusetts Medical School IACUC tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.
Acknowledgments
Bu çalışma 2009 yılı Amerikan Kurtarma ve yeniden yatırım Yasası ile verilen fonların ANI R01 GM56244 NIH tarafından desteklenen ve NIH R01 GM87130 JARP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChIP Assay Kit | Upstate, Millipore | 17-295 | |
| Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS |
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 12100-061 | High glucose content |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free |
| Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit |
| Penicillin/streptomycin stock solution | GIBCO, by Life Technologies | 5000 μg/ml concentration | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Salmon sperm DNA /Protein A agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | |
| Normal rabbit IgG | EMD Millipore | 12-370 | |
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | |
| GoTaq Q-PCR master mix | Promega Corp. | A6001 |
References
- Minard, M. E., Jain, A. K., Barton, M. C. Analysis of epigenetic alterations to chromatin during development. Genesis. 47, 559-572 (2009).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19, 425-433 (1999).
- Johnson, K. D., Bresnick, E. H. Dissecting long-range transcriptional mechanisms by chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, 27-36 (2002).
- Yusuf, F., Brand-Saberi, B. The eventful somite: patterning, fate determination and cell division in the somite. Anat Embryol (Berl). 211, Suppl 1. 21-30 (2006).
- Buckingham, M., Bajard, L., Chang, T., Daubas, P., Hadchouel, J., Meilhac, S., Montarras, D., Rocancourt, D., Relaix, F. The formation of skeletal muscle: from somite to limb. J Anat. 202, 59-68 (2003).
- Wright, W. E., Sassoon, D. A., Lin, V. K. Myogenin, a factor regulating myogenesis, has a domain homologous to MyoD. Cell. 56, 607-617 (1989).
- Edmondson, D. G., Olson, E. N. A gene with homology to the myc similarity region of MyoD1 is expressed during myogenesis and is sufficient to activate the muscle differentiation program. Genes Dev. 3, 628-640 (1989).
- Nabeshima, Y., Hanaoka, K., Hayasaka, M., Esumi, E., Li, S., Nonaka, I. Myogenin gene disruption results in perinatal lethality because of severe muscle defect. Nature. 364, 532-535 (1993).
- Hasty, P., Bradley, A., Morris, J. H., Edmondson, D. G., Venuti, J. M., Olson, E. N., Klein, W. H. Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene. Nature. 364, 501-506 (1993).
- Sassoon, D., Lyons, G., Wright, W. E., Lin, V., Lassar, A., Weintraub, H., Buckingham, M. Expression of two myogenic regulatory factors myogenin and MyoD1 during mouse embryogenesis. Nature. 341, 303-307 (1989).
- Brennan, T. J., Olson, E. N. Myogenin resides in the nucleus and acquires high affinity for a conserved enhancer element on heterodimerization. Genes Dev. 4, 582-595 (1990).
- Rosenthal, N., Berglund, E. B., Wentworth, B. M., Donoghue, M., Winter, B., Bober, E., Braun, T., Arnold, H. H. A highly conserved enhancer downstream of the human MLC1/3 locus is a target for multiple myogenic determination factors. Nucleic Acids Res. 18, 6239-6246 (1990).
- Braun, T., Gearing, K., Wright, W. E., Arnold, H. H. Baculovirus-expressed myogenic determination factors require E12 complex formation for binding to the myosin-light-chain enhancer. Eur J Biochem. 198, 187-193 (1991).
- Chakraborty, T., Brennan, T., Olson, E. Differential trans-activation of a muscle-specific enhancer by myogenic helix-loop-helix proteins is separable from DNA binding. J Biol Chem. 266, 2878-2882 (1991).
- French, B. A., Chow, K. L., Olson, E. N., Schwartz, R. J. Heterodimers of myogenic helix-loop-helix regulatory factors and E12 bind a complex element governing myogenic induction of the avian cardiac alpha-actin promoter. Mol Cell Biol. 11, 2439-2450 (1991).
- Brennan, T. J., Chakraborty, T., Olson, E. N. Mutagenesis of the myogenin basic region identifies an ancient protein motif critical for activation of myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 5675-5679 (1991).
- Lassar, A. B., Davis, R. L., Wright, W. E., Kadesch, T., Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D., Weintraub, H. Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo. Cell. 66, 305-315 (1991).
- Chakraborty, T., Brennan, T. J., Li, L., Edmondson, D., Olson, E. N. Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding. Mol Cell Biol. 11, 3633-3641 (1991).
- Cserjesi, P., Olson, E. N. Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products. Mol Cell Biol. 11, 4854-4862 (1991).
- Braun, T., Arnold, H. H. The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties. Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).
- Serna, dela, L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex. Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).
- Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. An initial blueprint for myogenic differentiation. Genes Dev. 19, 553-569 (2005).
- Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters. EMBO J. 25, 502-511 (2006).
- Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis. J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).
- Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle. Dev Biol. 311, 650-664 (2007).
- Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter. Cell. 115, 751-763 (2003).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).
