Summary
Demonstreren we een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) methode om factor interacties op weefsel-specifieke genen te identificeren tijdens of na het begin van weefsel-specifieke genexpressie in muis embryonale weefsel. Dit protocol moet worden breed toepasbaar voor de studie van weefsel-specifieke gen activatie als het zich voordoet tijdens de normale embryonale ontwikkeling.
Abstract
Chromatine immunoprecipitatie (chip) is een krachtig hulpmiddel om eiwitten te identificeren: chromatine interacties die plaatsvinden in de context van levende cellen 1-3. Deze techniek is breed benut in weefselkweek cellen, en in mindere mate, in primaire weefsel. De toepassing van chip tot knaagdier embryonaal weefsel, met name in de vroege tijden van ontwikkeling, wordt bemoeilijkt door de beperkte hoeveelheid weefsel en de heterogeniteit van cel-en weefseltypen in het embryo. Hier presenteren wij een methode om ChIP uitvoeren met behulp van een los embryonale dag 8.5 (E8.5) embryo. Afgeschoven chromatine van een enkele E8.5 embryo kunnen worden onderverdeeld in maximaal vijf aliquots, die de onderzoeker voldoende materiaal zorgt voor controle en voor het onderzoek van specifieke eiwitten: chromatine interacties.
We hebben gebruikt deze techniek om te beginnen met eiwitten document: chromatine interacties tijdens de specificatie van weefsel-specifieke genexpressie programma's. De heterogeniteit van de celtypes in een embryo beperkt noodzakelijk de toepassing van deze techniek omdat het resultaat is de detectie van eiwit: chromatine interacties zonder onderscheid te maken of de interacties plaatsvinden in alle, een onderdeel van, of een enkele cel type (s). Echter, onderzoek van weefsel-specifieke genen tijdens of na het begin van weefsel-specifieke genexpressie mogelijk is om twee redenen. De eerste, immunoprecipitatie van weefsel specifieke factoren isoleert noodzakelijk chromatine van het celtype waarin de factor wordt uitgedrukt. Ten tweede moet immunoprecipitatie van coactivatoren en histonen met post-translationele modificaties die worden geassocieerd met gen-activering alleen gevonden worden in genen en regulerende sequenties in de cel type waar het gen wordt of is geactiveerd. De techniek moet van toepassing zijn op de studie van de meeste weefsel-specifieke gen activatie gebeurtenissen.
In het onderstaande voorbeeld wordt beschreven, hebben we gebruik gemaakt E8.5 en E9.5 muizenembryo's aan factor binding aan een spier specifiek gen promoter te onderzoeken. Somieten, die de voorloper weefsels waaruit de skeletspieren van de romp en ledematen vormen, zijn aanwezig op E8.5-9,5 4,5. Myogenin is een regulerende factor die nodig is voor de skeletspieren differentiatie 6-9. De gegevens tonen aan dat myogenin is in verband met haar eigen promoter in E8.5 en E9.5 embryo's. Omdat myogenin is alleen uitgedrukt in somieten in dit stadium van ontwikkeling 6,10, de gegevens blijkt dat myogenin interacties met zijn eigen promotor al hebben plaatsgevonden in de skeletspieren voorloper cellen in E8.5 embryo's.
Protocol
1. Isolatie van embryo's
Opmerking: Alle operaties met betrekking tot muizen moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de toepasselijke dieren verzorging en het gebruik van het beleid en de protocollen
- Controleren op de aanwezigheid van een paring plug in de vrouwelijke muizen de ochtend na de paring en scheiden de bevruchte vrouwtjes van de stud mannen door ze in een andere kooi. Middag van de dag dat de dekking stekker wordt waargenomen wordt beschouwd als embryonale dag 0.5 (E0.5) van ontwikkeling.
- Bij E8.5, (of de gewenste fase, indien verschillend), het offer van de muis met behulp van een goedgekeurde protocol.
- Maak de buik van het dier laten inslapen met 70% ethanol en open de buikholte. De implantatie plaatsen wijst op de aanwezigheid van de ontwikkeling van embryo's worden gezien als een 'kralen aan een snoer "arrangement langs de lengte van elke baarmoeder hoorn (Figuur 1A). Met een schaar, verwijder beide baarmoederhoorns, individueel snijd elke implantatie te scheiden (Figuur 1B) en plaats ze in een 100 mm petrischaaltje met kamertemperatuur (RT) dissectie medium (DMEM, 10% foetaal runderserum, 20 mM HEPES pH 7,4 , 60 ug / ml penicilline, 2 mM streptomycine).
- Met behulp van een tang, verwijdert u elk embryo en de omliggende de slijmvliezen van de baarmoeder weefsel (figuur 1C) en plaats ze in schoon dissectie medium.
- Isoleren individuele embryo's onder een dissectiemicroscoop met behulp van een tang. In dit stadium van ontwikkeling, zijn de embryo's omringd door de pariëtale dooierzak, wat de contacten van de deciduum weefsel, de viscerale dooierzak en het amnion. Het amnion is een transparant membraan dat in direct contact met de embryo. De viscerale dooierzak is gelegen tussen het amnion en de pariëtale dooierzak en is gemakkelijk onderscheiden in E8.5-E9.5 embryo's door de aanwezigheid van prominente bloedvaten die het embryo te voeden. Verwijder elk embryo uit de omringende vliezen en breng individueel naar een nieuwe plaat met dissectie media om overtollig bloed te verwijderen. Het ontwikkelingsstadium kan variëren van embryo tot embryo en tussen de nestjes, vertegenwoordiger van E8.5 embryo's en een vertegenwoordiger E9.5 embryo zijn weergegeven in figuur 1D.
- Overdracht elk embryo tot een 1,5 ml Eppendorf buisje met 200 ul van dissectie media (zoals beschreven in stap 4 hierboven).
2. Homogenisering van de geïsoleerde Embryo
- Voeg 20 eenheden van collagenase type II in een volume van 200 ul (verdund in Fosfaat 1X Dubbecco's gebufferde zoutoplossing, DPBS) aan elke eppendorfbuisje.
- Schud monsters in een 37 ° C schudinrichting bij 100 rpm gedurende 20 min.
- Resuspendeer goed door pipetteren tot klompjes van cellen verstoren.
- Breng de celsuspensie op de top van steriele cel zeef (40 um maaswijdte) geplaatst over een 1,5 ml Eppendorf buis.
- Breng onmiddellijk 600 ul van de ruimtetemperatuur 1X DPBS op de top van de cel zeef om de scheiding af te ronden. Gooi de zeef.
- Centrifugeer monsters bij 4 ° C bij 4000 xg gedurende 5 minuten.
- Giet het supernatans af.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml van RT 1X DPBS.
- Centrifugeer de monsters bij 4000 xg gedurende 1 min bij RT.
- Giet het supernatans af.
- Resuspendeer de pellet in 200 ui van RT dissectie media.
- Tel de embryonale cellen. Er is een gemiddeld 3-5 x 10 6 cells/E8.5 embryo.
3. Cross-link chromatine
- Voeg 5,6 pi van 37% formaldehyde aan de 200 ul monsters voor een uiteindelijke concentratie van 1% formaldehyde.
- Incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij RT.
- Centrifugeer de monsters bij 4 ° C bij 4000 xg gedurende 3 minuten.
- Giet het supernatans af.
- Resuspendeer de cellen met koude 1X DPBS met 80 ul / ml protease-remmer cocktail (PIC).
- Centrifugeer monsters bij 4 ° C bij 4000 xg gedurende 3 minuten.
- Giet het supernatans af. Bij deze stap, de monsters kunnen worden ingevroren bij -80 ° C. De bevroren, verknoopte monsters worden gedurende verscheidene maanden stabiel.
4. Ultrasoonapparaat
- Resuspendeer de cel pellet in 100 ui van RT SDS lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8,1), 10 mM EDTA en 1% SDS met vers toegevoegde PIC op een ui PIC/800 ui totale volume). Bij het opnieuw gesuspendeerd, een extra 100 ul van RT SDS lysis buffer om resuspensie te bevorderen. Meng goed door pipetteren en inversie.
- Incubeer de celsuspensie op ijs gedurende 10 minuten.
- Ultrasone trillingen gelyseerde cellen afschuiving DNA tussen de 200 en 500 baseparen met behulp van een Diagenode Bioruptor ™ UCD200 (5 min x 8 keer: amplitude instellen van 30 sec on/30 seconden uit op hoge (320 Watt) vermogen). De monsters moeten worden omgeven door een ijsslurrie. Sta niet toe dat de monsters op te warmen boven de 4 ° C of te bevriezen. Er zijn vele soorten van sonicators beschikbaar. Sonicatie voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd voor elke ultrasoonapparaat te resulteren in afschuiving van de cross-linked DNA met een lengte van ongeveer 500 bp.
- Centrifugeer gesonificeerd monsters bij 4 ° C bij 14.000 xg gedurende 10 minuten.
- Transfer het supernatant in een schoon eppendorfbuisje pre-gekoeld op ijs.
- Verdeel het gesoniceerd monster in een maximum van 5 aliquots. We hebben empirisch vastgesteld dat een E8.5 embryo kan worden verdeeld in vijf porties. Kleinere of grotere steekproefomvang kunnen dienovereenkomstig worden aangepast. Bij deze stap kan het monster bewaard worden bij -80 ° C tot verder gebruik.
- Reserve een aliquot voor gebruik als input en bewaar bij -20 ° C tot en met stap 6 wanneer de cross-links zal worden teruggedraaid. Verdunnen van de andere fracties 10-voudige in ChIP verdunningsbuffer (16,7 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1,2 mM EDTA, 1,1% Triton X-100, 167 mM NaCl en 0,01% SDS) voorzien van vers toegevoegde PIC op een μl/800 ul buffer.
5. Pre-clearing en Immunoprecipitatie
- Pre-clear de verdunde supernatant met 75 pi van Zalm-Sperm DNA / proteïne A of G Agarose-50% slurry bij 4 ° C, met rotatie, gedurende 1 uur. Het gebruik van een van beide proteïne A of proteïne G kralen moet worden bepaald door het antilichaam worden gebruikt voor de chip. Zo worden bijvoorbeeld eiwit A kralen aanbevolen voor konijnen antilichamen, terwijl proteïne G kralen zijn aanbevolen voor geit antilichamen of muis IgG 1-antilichamen. Voor meer gedetailleerde informatie, zie de aanbevelingen van de kraal fabrikant.
- Centrifugeer bij 4 ° C bij 2500 xg gedurende 1 minuut.
- Breng de bovenstaande om een nieuwe, pre-gekoelde eppendorfbuisje.
- Voeg antilichaam (4 ng / sample) op de pre-gewist aliquot en incubeer overnacht bij 4 ° C met rotatie.
6. Het wassen van de chromatine-eiwit-bead Complex
- Voeg 60 ul van zalmsperma DNA / Proteïne A of G agarose drijfmest in elke flacon en incuberen bij 4 ° C met rotatie gedurende 1 uur. Gebruik dezelfde kraal type dat wordt gebruikt voor pre-clearing in stap 3 hierboven.
- Centrifugeer bij 4 ° C bij 1000 xg gedurende 1 minuut.
- Verwijder voorzichtig het supernatant af en gooi. Houd de DNA-eiwit-bead complex op het ijs.
- Resuspendeer en was het pellet zoals hieronder aangegeven met wassen buffers 1, 2, 3 en 4. Was de buffers 1-3 moeten worden gekoeld tot 4 ° C en wast met deze buffers moeten worden uitgevoerd bij 4 ° C. Wasbuffer 4 moet worden op kamertemperatuur en wast met deze buffer moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. Elke wasbeurt is gedurende 5 minuten met rotatie op de juiste temperatuur. Na elke wasbeurt, centrifuge bij 4 ° C (kamertemperatuur wasbuffer 4 wasbeurten) bij 1000 xg gedurende 1 minuut, dan voorzichtig te zuigen of te verwijderen van de supernatant.
Buffer 1: Lage zout wasbuffer (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100,
150 mM NaCl en 0,1% SDS), 1 ml x 2 wasbeurten.
Buffer 2: High zout wasbuffer (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100,
500 mM NaCl en 0,1% SDS), 1 ml x 2 wasbeurten.
Buffer 3: LiCl zout wasbuffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM EDTA, 1% Igepal-CA630,
0,25 M LiCl en 1% deoxycholinezuur (natriumzout)), 1 x 1 ml wassen.
Buffer 4: TE-buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM EDTA), 1 ml x 2 wasbeurten.
7. Elutie van de chromatine-antilichaam complex
- Resuspendeer de gewassen chromatine-eiwit-bead complex in 250 ul van de vers bereide elutiebuffer (1% SDS, 0,1 M NaHCO 3). Krachtig vortex de steekproef voor 5 sec, daarna incuberen bij RT gedurende 15 min met rotatie.
- Centrifugeer bij 2500 xg gedurende 1 min bij RT en breng het eluaat in een nieuwe eppendorfbuisje.
- Herhaal de stappen 1 en 2, en combineren de eluaten in dezelfde eppendorfbuisje. De eluaten moet worden bewaard bij kamertemperatuur. Na voltooiing van deze stap, kan de eluaten worden opgeslagen bij -20 ° C tot verder gebruik.
8. Reverse Cross-link en Recover DNA
- Voeg 20 pl 5 M NaCl voor 500 il eluaat (40 ul / ml voor de input controle).
- Verwarm de eluaten bij 65 ° C in een waterbad gedurende 4 uur tot 's nachts.
- 10 pi van elk monster (inclusief de controle op de opneming) kan worden uitgevoerd op een 2% agarosegel naast op maat markers spanning 0,1 tot 1 kbp tot het DNA-fragment grootte te controleren. Het DNA wordt weergegeven als een uitstrijkje en niet als een scherpe band. De rest van de monsters kunnen worden ingeleverd bij 65 ° C, terwijl de gel wordt uitgevoerd.
- Herstellen het DNA van elk monster met behulp van een QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Voeg 600 ul QG buffer (geleverd in de kit) om DNA-adsorptie te optimaliseren met het silica membraan in een QIAquick spin-kolom en 200 pl isopropanol in een 500 pi monster. Merk op dat QG buffer een pH-indicator waarmee eenvoudige meting van de pH van het monster bevat. Als de kleur van het monster verandert van geel naar paars (pH> 7,5) na het mengen, voeg 10 ul van 3 M NaAcetate (pH 5,2) op het monster en meng. Dit vermindert de pH van het mengsel aan DNA te binden aan de kralen in de kolom te maximaliseren.
- Voorafgaand aan het laden van de kolom, controleert het mengsel om te bepalen of een SDS neerslag aanwezig is. Als SDS neerslag is opgetreden, moet het monster worden verwarmd in een42 ° C waterbad tot het neerslag verdwijnt.
- Belasting 700 pi van het mengsel in de QIAquick spin-kolom (paars column in de kit) en centrifugeer bij RT bij 14.000 xg gedurende 1 minuut. Gooi de stroom door van de kolom alvorens verder te gaan en herhaal deze stap met de rest van het monster.
- Voeg 500 ul QG buffer om de kolom te wassen. Centrifugeer bij RT bij 14.000 xg gedurende 2 minuten. Gooi de stroom door uit de kolom voordat u verdergaat.
- Was de kolom met 700 ul van PE wasbuffer (meegeleverd in de kit) waaraan ethanol is toegevoegd de instructies van de fabrikant. Centrifugeer bij RT bij 14.000 xg gedurende 1 minuut. Gooi de stroom door uit de kolom voordat u verdergaat.
- Herhaal het centrifugeren stap om volledig te verwijderen van de rest van de PE-buffer uit de kolom. Gooi de stroom door en de collectie buis.
- Elueren DNA uit de kolom in een schoon eppendorfbuisje door de toevoeging van 60 ul EB buffer (elutiebuffer geleverd in de kit).
- Centrifugeer bij kamertemperatuur bij 14.000 xg gedurende 1 minuut. Het geëlueerde DNA kan worden opgeslagen bij -20 ° C tot detectie. Een 260 lezingen van het nuttig toegepaste materiaal meestal geven de concentraties van 90-120 ng / ul, voor een totaal herstel van ~ 6-7 ug per portie. Echter, de A 260/280 verhouding van deze monsters is meestal> 1,8, wat suggereert dat RNA aanwezig is in het monster. Dus de exacte hoeveelheid nuttig DNA kan lager zijn.
9. Analyse van de Hersteld DNA
- SDS kan interfereren met de activiteit van de PCR-Taq-polymerase. SDS moet volledig worden verwijderd voordat het uitvoeren van PCR. Incubeer het DNA op het ijs voor het neerslaan van eventueel resterende SDS en centrifugeer bij 4 ° C bij 14.000 xg gedurende 1 minuut. Breng het supernatant naar een nieuwe eppendorf tube.This stap wordt sterk aanbevolen.
- Het DNA eluaten kan worden opgespoord door conventionele PCR of met behulp van kwantitatieve real-time PCR (Q-PCR) met primers die specifiek zijn voor elke sequentie worden geanalyseerd. 50-10 ui van het totale DNA eluaat kan worden gebruikt voor een PCR-of Q-PCR-reactie. PCR met de input controle kan worden uitgevoerd met een 5-10 voudige verdunning van het DNA vergeleken met het bedrag van de andere monsters. PCR en Q-PCR-condities zal echter variëren, de beperkte hoeveelheid uitgangsmateriaal vereist extra PCR-cycli. Voor conventionele PCR-detectie, raden wij aan te beginnen met 40 cycli en het aanpassen als dat nodig is.
10. Representatieve resultaten
We hebben gebruik gemaakt van deze protocol om ChIP uitvoeren van zowel E8.5 en E9.5 embryo's (figuur 2). De resultaten tonen aan dat myogenin aanwezig is op de myogenin promoter in E8.5 en E9.5 embryo's. ChIP gezuiverde DNA's werden geanalyseerd door conventionele PCR (figuur 2A) en door middel van kwantitatieve real-time PCR (figuur 2B). In tegenstelling, was er geen indicatie van myogenin binding aan de myogenin promoter in de dooierzak, waar myogenin niet wordt uitgedrukt. De interferon-γ (IFNy) promotor, die sequenties die overeenkomen met de myogenin bindingsplaats bevat, werd gebruikt als een negatieve reeks controle. Zoals verwacht, was myogenin niet gebonden aan de IFNy promotor in een van de geteste weefselmonsters. In E8.5 en 9,5 embryo's, is myogenin met name tot uitdrukking in de somieten (figuur 3, 6,10), die de voorlopers van de skeletspieren. Dus de resultaten geven aan dat myogenin is gebonden aan de myogenin promoter in de somieten bij E8.5 en E9.5.
Figuur 1. E8.5 embryo dissectie. (A) Geïsoleerd baarmoeder hoorn (bovenste paneel; sterkere vergroting weergegeven in onderste paneel). (B) baarmoeder hoorn knippen met een schaar aan de individuele implantatie sites die individuele embryo's te scheiden. (C) Embryo's uitsteekt uit baarmoeder weefsel tijdens dissectie. Pijlen geven embryo's nog steeds gedekt door extra-embryonaal weefsel. (D) Twee E8.5 embryo's uit hetzelfde nest. Het embryo aan de linkerkant is niet begonnen met het proces van het omzetten. Het embryo aan de rechterkant ondergaat draaien. Helemaal rechts - vertegenwoordiger van E9.5 embryo.
Figuur 2. ChIP test tonen myogenin binding aan de myogenin promoter in E8.5 en E9.5 embryo's. (Top) conventionele PCR-analyse van 5 ul van DNA gezuiverd uit ChIP experimenten met behulp van een myogenin antilichaam of niet-specifieke IgG werd uitgevoerd met primers die een deel van de myogenin promotor -79 tot 69 ten opzichte versterken naar de startsite van transcriptie die bevat een myogenin bindingsplaats gelegen bij -12 of primers die een deel van de IFNy promoter die een sequentie overeenkomt met de myogenin bindingsplaats gelegen ~ 1075 bp stroomopwaarts van de transcriptie start site bevat versterken. De IFNy gebruikte primer sequenties werden 5'-GCT GAC TCA AGA CCC CGA GGC-3 'en 5'-TGA GGA TGG GGC AGG AGG CC-3'. (Onder) kwantitatieve real-time PCR-analyse van dezelfde monsters gebruikt in de (A). Degegevens worden weergegeven als% van de input + / - standaarddeviatie.
Figuur 3. Myogenin is specifiek tot uiting in de somieten van E8.5 en E9.5 embryo's. Hele monteren in situ hybridisatie van myogenin shows specifieke mRNA-expressie in de somieten. Grootte bar in E8.5 afbeelding - 200 micrometer. Grootte bar in E9.5 afbeelding - 500 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de beschreven ChIP protocol, laten we zien dat de myogene regulator myogenin wordt geassocieerd met de myogenin promotor in de skeletspier voorloper weefsel aanwezig is in enkele E8.5 en E9.5 embryo's. Voorafgaande studies hebben uitgebreid gekarakteriseerd myogenin binding aan E doos met sequenties, te beginnen met de eerste in vitro gel shift experimenten gebruik te maken van in vitro vertaald of bacterieel geproduceerd myogenin en radioactief gemerkt DNA dat codeert voor het relevante deel van de target-gen regulerende sequenties 11-20. Conventionele ChIP studies hebben aangetoond myogenin binding aan de myogenin promoter in weefselkweek modellen voor myogenese 21-24. Echter, er is geen bewijs dat aantoont dat myogenin bindt aan de myogenin promotor tijdens de embryonale ontwikkeling van skeletspieren, hoewel men zou kunnen dat dit het geval later in de embryogenese te voorspellen op basis van de neerwaartse regulatie van myogenin expressie waargenomen in E15.5 tong weefsel van myogenin deficiënte muizen 25. Dus de gegevens levert het bewijs dat de interactie tussen myogenin en de myogenin promotor interactie komt voor in vivo. Een voor de hand liggende toepassing van deze techniek is om het te gebruiken om de fysiologische relevantie van eerdere studies het karakteriseren van weefsel-specifieke gen activatie weefsel uitgevoerd met behulp van cultuur modellen te verifiëren. De meer interessante toepassing is om deze techniek te gebruiken als onderdeel van de initiële karakterisering van een nieuwe of eerder ongekarakteriseerde factor om de fysiologische relevantie van een specifieke interactie voor het uitvoeren van weefselkweek studies ontworpen op het begrijpen van functionele mechanisms.The protocol vast te stellen kan ook worden gebruikt om direct vergelijken eiwit: chromatine interacties die zich op specifieke ontwikkelingsfasen in muismodellen met een aangelegde genetische manipulatie.
We verwachten dat deze methode ook nuttig zijn voor tijdsverloop studies van weefsel-specifieke gen regulatie tijdens de ontwikkeling. Door het beoordelen van specifieke factor: chromatine interacties in verschillende embryonale stadia, kon men het tijdstip waarop de factor interactie eerst voorkomt identificeren, kon bepalen of de interactie werd gehandhaafd binnen en buiten de differentiatie proces of was van voorbijgaande aard, en konden bepalen volgorde van de factor bindend indien meerdere factoren interageren met een specifieke volgorde. Tenslotte zien wij dat het protocol kan worden uitgebreid tot een re-ChIP procedure 26, waarbij de chromatine hersteld van een immunoprecipitatie is aan een tweede immunoprecipitatie onderworpen met een antilichaam tegen een andere factor geacht worden mede-innemende hetzelfde stuk van het chromatine. De re-ChIP-protocol zorgt voor meer overtuigend bewijs dat twee verschillende factoren aanwezig zijn op dezelfde stukken van chromatine, de waarschijnlijke vereiste voor deze wijziging zou een toename van de hoeveelheid van het uitgangsmateriaal.
Een opmerkelijke besef dat kwam van onze inspanningen was dat de beperkte hoeveelheid uitgangsmateriaal niet de belemmering voor succes dat men zou kunnen voorspellen, zeker gezien het feit dat weefselkweek cellen gebaseerde protocollen suggereren vaak beginnen met een homogene populatie van miljoenen of tientallen miljoenen cellen 26,27. Het succes van onze inspanningen spreekt tot de primaire (en vaak oncontroleerbare) verplichting voor antilichamen die in staat is de specifieke immunoprecipitatie van de factor in onderzoek. Zodra een antilichaam is geïdentificeerd als in staat van immunoprecipitatie, de onderzoeker kan de chip assay te optimaliseren door het titreren van de hoeveelheid antilichaam gebruikt. Het is belangrijk op te merken dat meer is niet altijd beter, wij vaak vinden dat er te veel antilichamen, vooral met monsters van beperkte hoeveelheid, resulteert in een hogere achtergrond binding aan irrelevante sequenties. Daarnaast is het gebruik van immunoglobuline fracties of affiniteit-gezuiverde antilichamen vaak resulteren in een lagere achtergrond dan wel gebruik van de antisera. Achtergrond van het controle antilichaam kan vaak worden gemeten door het opnemen van een monster met kralen zonder antilichaam.
We concluderen dat het gebruik van een vroeg stadium van embryo's voor ChIP analyse van eiwitten: chromatine interacties die optreden tijdens de activatie van weefsel-specifieke genen de potentie om belangrijke inzicht te geven in de inductie en het onderhoud van weefsel-specifieke genexpressie programma's rechtstreeks in het kader van ontwikkelingssamenwerking .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de University of Massachusetts Medical School IACUC in te stellen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH R01 GM56244 om ANI, welke fondsen toegekend door de Amerikaanse Terugwinning en Reinvestment Act van 2009 omvat, en door het NIH R01 GM87130 naar JARP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChIP Assay Kit | Upstate, Millipore | 17-295 | |
| Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS |
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 12100-061 | High glucose content |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free |
| Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit |
| Penicillin/streptomycin stock solution | GIBCO, by Life Technologies | 5000 μg/ml concentration | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Salmon sperm DNA /Protein A agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | |
| Normal rabbit IgG | EMD Millipore | 12-370 | |
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | |
| GoTaq Q-PCR master mix | Promega Corp. | A6001 |
References
- Minard, M. E., Jain, A. K., Barton, M. C. Analysis of epigenetic alterations to chromatin during development. Genesis. 47, 559-572 (2009).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19, 425-433 (1999).
- Johnson, K. D., Bresnick, E. H. Dissecting long-range transcriptional mechanisms by chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, 27-36 (2002).
- Yusuf, F., Brand-Saberi, B. The eventful somite: patterning, fate determination and cell division in the somite. Anat Embryol (Berl). 211, Suppl 1. 21-30 (2006).
- Buckingham, M., Bajard, L., Chang, T., Daubas, P., Hadchouel, J., Meilhac, S., Montarras, D., Rocancourt, D., Relaix, F. The formation of skeletal muscle: from somite to limb. J Anat. 202, 59-68 (2003).
- Wright, W. E., Sassoon, D. A., Lin, V. K. Myogenin, a factor regulating myogenesis, has a domain homologous to MyoD. Cell. 56, 607-617 (1989).
- Edmondson, D. G., Olson, E. N. A gene with homology to the myc similarity region of MyoD1 is expressed during myogenesis and is sufficient to activate the muscle differentiation program. Genes Dev. 3, 628-640 (1989).
- Nabeshima, Y., Hanaoka, K., Hayasaka, M., Esumi, E., Li, S., Nonaka, I. Myogenin gene disruption results in perinatal lethality because of severe muscle defect. Nature. 364, 532-535 (1993).
- Hasty, P., Bradley, A., Morris, J. H., Edmondson, D. G., Venuti, J. M., Olson, E. N., Klein, W. H. Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene. Nature. 364, 501-506 (1993).
- Sassoon, D., Lyons, G., Wright, W. E., Lin, V., Lassar, A., Weintraub, H., Buckingham, M. Expression of two myogenic regulatory factors myogenin and MyoD1 during mouse embryogenesis. Nature. 341, 303-307 (1989).
- Brennan, T. J., Olson, E. N. Myogenin resides in the nucleus and acquires high affinity for a conserved enhancer element on heterodimerization. Genes Dev. 4, 582-595 (1990).
- Rosenthal, N., Berglund, E. B., Wentworth, B. M., Donoghue, M., Winter, B., Bober, E., Braun, T., Arnold, H. H. A highly conserved enhancer downstream of the human MLC1/3 locus is a target for multiple myogenic determination factors. Nucleic Acids Res. 18, 6239-6246 (1990).
- Braun, T., Gearing, K., Wright, W. E., Arnold, H. H. Baculovirus-expressed myogenic determination factors require E12 complex formation for binding to the myosin-light-chain enhancer. Eur J Biochem. 198, 187-193 (1991).
- Chakraborty, T., Brennan, T., Olson, E. Differential trans-activation of a muscle-specific enhancer by myogenic helix-loop-helix proteins is separable from DNA binding. J Biol Chem. 266, 2878-2882 (1991).
- French, B. A., Chow, K. L., Olson, E. N., Schwartz, R. J. Heterodimers of myogenic helix-loop-helix regulatory factors and E12 bind a complex element governing myogenic induction of the avian cardiac alpha-actin promoter. Mol Cell Biol. 11, 2439-2450 (1991).
- Brennan, T. J., Chakraborty, T., Olson, E. N. Mutagenesis of the myogenin basic region identifies an ancient protein motif critical for activation of myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 5675-5679 (1991).
- Lassar, A. B., Davis, R. L., Wright, W. E., Kadesch, T., Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D., Weintraub, H. Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo. Cell. 66, 305-315 (1991).
- Chakraborty, T., Brennan, T. J., Li, L., Edmondson, D., Olson, E. N. Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding. Mol Cell Biol. 11, 3633-3641 (1991).
- Cserjesi, P., Olson, E. N. Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products. Mol Cell Biol. 11, 4854-4862 (1991).
- Braun, T., Arnold, H. H. The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties. Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).
- Serna, dela, L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex. Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).
- Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. An initial blueprint for myogenic differentiation. Genes Dev. 19, 553-569 (2005).
- Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters. EMBO J. 25, 502-511 (2006).
- Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis. J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).
- Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle. Dev Biol. 311, 650-664 (2007).
- Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter. Cell. 115, 751-763 (2003).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).
