Summary
פרוטוקול כללית לחקר פלישה של תאים לארח על ידי פתוגן חיידקי, תוך התמקדות
Abstract
להלן נתאר כיצד אנחנו לומדים את הפלישה לתאי אנדותל אנושיים על ידי Staphylococcus aureus חיידקים פתוגנים. פרוטוקול כללי ניתן ליישם מחקר של הפלישה תא החיידק על ידי כמעט כל culturable. שלבי בו היבטים ספציפיים של הפלישה ניתן ללמוד, כגון תפקידה של התארגנות אקטין או caveolae, יהיו מודגשות. תאים מארח מגדלים צלוחיות וכאשר מוכן לשימוש הן seeded לתוך 24 גם צלחות המכילות coverslips Thermanox. שימוש coverslips מאפשר הסרת הבאים של התאים מבארות כדי להפחית מהפרעות חלבונים בסרום מופקדים על הצדדים של בארות (אשר S. aureus היה לצרף). חיידקים גדלים לצפיפות הנדרשת ושטף כדי להסיר כל החלבונים המופרשים (רעלים למשל). Coverslips בשכבות ומחוברות של בתאי האנדותל מועברים 24 גם צלחות חדשות המכילות בינוני תרבות טרי לפני תוספת של חיידקים. חיידקים ותאים מודגרת אז יחד סכום נדרש זמן של 5% CO 2 ב 37 ° C. עבור ס aureus זה הוא בדרך כלל בין 15-90 דקות. Coverslips Thermanox יוסרו גם כל לטבול לרחוץ PBS להסיר חיידקים פנויות. אם חיידקים הקשורים הכולל (חסיד והפנימו) יש לכמת, coverslips ממוקמות אז גם טרי המכיל טריטון 0.5% X-100 ב PBS. Pipetting עדין מוביל להשלים תמוגה תאים וחיידקים הם המנויים על ידי דילול ציפוי סדרתי על אגר. אם מספר חיידקים פלשו התאים נדרשת, coverslips מתווספים בארות המכיל 500 ברקמת μl תרבות בינוני בתוספת גנטמיצין ו הדגירה נמשך 1 שעה, אשר יהרגו את כל החיידקים חיצוני. Coverslips אז יכול להיות שטף, lysed תאים וחיידקים המנויים על ידי ציפוי על אגר כמתואר לעיל. אם הניסוי דורש ראיה ישירה, coverslips ניתן לתקן ומוכתמת עבור במיקרוסקופ אור פלואורסצנטי או confocal או מוכן במיקרוסקופ אלקטרונים.
Protocol
פרוטוקול הבא יתאר את המחקר של הפלישה תא האנדותל ש ' aureus אבל תיאורטית יכול לשמש כדי ללמוד הפלישה הסלולר על ידי חיידק כלשהו culturable. ספציפית ס שלבים בתאי האנדותל aureus ו מסומנים.
1. הכנה של חיידקים
- תרבות S. aureus זנים של 4-16 שעות (תלוי שלב הצמיחה חובה) ב 10 Brain-Heart מרק מ"ל (BHI) עירוי ב 37 מעלות צלזיוס באוויר עם רועד בסל"ד 200. אלה התנאים לצמיחה הן ספציפיות עבור ס aureus ו - ייתכן שיהיה צורך להתאים לחיידקים אחרים.
- לשטוף חיידקים שלוש פעמים בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM; Invitrogen) על ידי סיבובים חלופי של צנטריפוגה בטמפרטורת החדר (5000 x גרם, 10 דקות), הסרת supernatant התרבות resuspension של גלולה חיידקי בהיקף שווה ערך של DMEM. מדוד את צפיפות אופטית של ההשעיה של חיידקים וכתוצאה מכך אשר לאחר מכן ניתן להתאים לפי הצורך. עבור ס aureus, אנו מכינים השעיה על OD 600 = 1, אשר מתאים ~ 10 9 CFU -1 מ"ל.
2. תא האנדותל תרבות
- תרבות קו תא האנדותל EA.hy926 1 ב DMEM בתוספת העובר שור בסרום (FBS; 10%) ו-L-גלוטמין (2 mM) ב 37 ° C ב 5% CO 2. לחלופין, ונקווה העיקרי האדם וריד הטבור לתאי אנדותל (HUVECs) ניתן לרכוש Lonza (באזל, שווייץ) ו בתרבית בינוני הבסיס אנדותל בתוספת 2% FBS, תמצית מוח שור (כולל הפרין), גדילה אנושי גורם האנדותל הידרוקורטיזון ב 37 מעלות 5% CO 2 על פי ההוראות של היצרן (Lonza). אלה התנאים לצמיחה ספציפיים עבור תאים אלה ייתכן שיהיה צורך להתאים את סוגי תאים אחרים המארח.
- לגדול לתאי אנדותל ב T75 צלוחיות להשלים confluency, מאומת על ידי העין.
- הכן את 24 גם צלחות להכנסה של coverslips. מלקחיים פיין (להבה מעוקרים) יש צורך להעביר את coverslips, אשר יש משטח אחד מבריק אטום אחת. המקום coverslips בבארות של צלחת 24 היטב עם משטח אטום כלפי מעלה כדי לאפשר התקשרות לתא.
- שחרר את התאים מן הבקבוק T75 עם 3 מ"ל טריפסין-EDTA (0.25%), ולהוסיף 10 מ"ל של המדיום תרבות הרלוונטיים.
- הוסף 500 μl של תאים resuspended ל 24 גם צלחות המכילות coverslips Thermanox זכוכית. אחת T75 בקבוק ומחוברות של תאים תאים סיפק מספיק עבור שני 24 גם צלחות, וכתוצאה מכך כ 5 × 10 5 תאים לכל טוב (בינוני 500 μl).
- דגירה צלחות עבור 48 שעות כפי שתואר לעיל, ולוודא 100 תא% confluency על ידי מיקרוסקופ אור הפוכה.
- טובלים לשטוף coverslips ב PBS ולהוסיף 24 גם צלחות חדשות המכילות 490 DMEM μl FBS המכיל 10% בכל טוב.
- כדי לבחון את תפקידה של תהליכים מטבוליים ספציפיים הפלישה התא, מעכבי ניתן להוסיף תאים בתרבית 1 שעות לפני תוספת של חיידקים בריכוזים נשמר במהלך assay. לדוגמה, כדי לקבוע את התפקיד של סידור מחדש של אקטין ס הפלישה aureus של בתאי האנדותל, 50 מיקרומטר cytochalasin D ניתן להוסיף, או לתפקיד של caveolae, 5 מ"מ methyl-β-cyclodextrin ניתן להוסיף.
3. הפלישה Assay
- הוסף 10 μl של חיידקים שטף (וכתוצאה מכך כ 2 × 10 7 CFU מ"ל aureus -1 ס) זה טוב המכיל coverslip שטף בשכבה ומחוברות של בתאי האנדותל ב 490 DMEM μl המכיל 10% FBS.
- דגירה של 15-90 דקות 37 ° C ב 5% CO 2.
- כדי למדוד את המספר הכולל של חיידקים הקשורים התאים (חסיד והפנימו), לטבול, לשטוף את coverslips שלוש פעמים PBS ולהוסיף בארות טרי המכיל 500 טריטון 0.5% μl X-100 ב PBS. כדי להבטיח את התאים באופן מלא lyse ולשחרר את כל החיידקים הפנימו, פיפטה מספר פעמים, מצביע על קצה פיפטה ישירות על פני השטח של coverslip.
- ספירת החיידקים על ידי ציפוי ההשעיה נוזלי (או דילולים זה במידת הצורך) על פני השטח של צלחות TSA. מאז TX-100 יהיה lyse רבים חיידקים גראם שליליים, saponin יכול לשמש במקום 2.
- כדי למדוד את מספר החיידקים הפנימו, להסיר את supernatant תרבות מכל המכיל חיידקים מאוגד היטב ולהחליף 500 μl DMEM/10% FBS בתוספת 200 מיקרוגרם מ"ל -1 גנטמיצין. אנו משתמשים באופן שגרתי גנטמיצין ולא lysostaphin כאן כפי שהוא זול יותר מאפשר לנו לעבור בין הניסויים באמצעות סוגים שונים של חיידקים (למשל Staphylococci ו Lactococci) מבלי לשנות את פרוטוקול הניסוי.
- דגירה צלחות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 דקות 60 להרוג את כל החיידקים תאיים.
- לשטוף coverslips 3 פעמים PBS,lyse ו למנות על ידי ציפוי על גבי ה-TSA, כמתואר עבור assay את הידבקות לעיל.
- במקרים מסוימים זה עשוי להיות עדיף על פני חזותית לספור את מספר החיידקים באמצעות מיקרוסקופ אור. במקרה זה, והן ספציפיות ס תא הפלישה aureus, להשתמש lysostaphin (10 מיקרוגרם מ"ל -1) במקום גנטמיצין פיזית להשמיד את החיידקים תאיים.
- דגירה coverslips עבור 20min ב 37 ° C ב-CO 2 בתמיסה lysostaphin, ולאחר מכן לשטוף ולתקן עם Cytopath (Cellpath).
- המבול coverslips עם קריסטל סגול (0.5% w / v) עבור 5min.
- טובלים לשטוף במים, האוויר יבש לעלות על שקופיות הזכוכית. מספר חיידקים לכל מ"מ 2 של בתאי האנדותל ומחוברות ניתן לכמת באמצעות מיקרוסקופ אור.
4. נציג תוצאות:
ביטוי של חלבונים מחייב פיברונקטין (FnBPA ו FnBPB) על פני השטח של ס aureus מקנה את היכולת לפלוש לתאי אנדותל. מחקר שנערך לאחרונה מחדש את תחום פיברונקטין מחייב של FnBPA 3. Wild-type (WT) ס aureus 8325.4 פולש לתאי אנדותל עם יעילות גבוהה, תוך זן חסר הן FnBPA ו-B (Δ fnb) הראו רמות נמוכות משמעותית של internalisation (איור 1A). השלמה של מוטנטים עם fnb קידוד פלסמיד מינוס תחום פיברונקטין מחייבים (pFnR0) לא לקדם פלישה (איור 1A). לעומת זאת, השלמה של מוטנטים בקידוד פלסמיד fnb כל הגן (pFnBA4) משוחזר הפלישה לרמות WT (איור 1A).
תפקידה של FnBPA בפלישה תא האנדותל יכול להיות גם הדגימו באמצעות לארח את הביטוי Heterologous lactis Lactococcus. ביטוי של הפלסמיד המקודד FnBPA ב L. lactis (pRM9 9) לא לשפר באופן משמעותי את הידבקות לתאי אנדותל לעומת חיידקים להביע שום FnBPA (CTL) (ברים פתוחים, 1B איור). לעומת זאת, ל-לבטא FnBPA lactis פלשו לתאי אנדותל ברמות גבוהות משמעותית המתח לא הביע (ברים סגור, 1B איור).
הניסויים בוצעו ארבע פעמים כפולות סטיית תקן ממוצע ± מוצג. * מייצגים נתונים שאינם שונים באופן משמעותי מבחינה סטטיסטית (p = <0.05) מ WT או ערכים CTL.
באיור 1. הפלישה של EA. Hy926 לתאי אנדותל ש ' aureus (א) או ל lactis (B).
Discussion
Assay אנו מתארים מבוסס על assay ההגנה גנטמיצין, אשר נמצאת בשימוש נרחב כדי ללמוד את הפלישה של תאים לארח על ידי חיידקים. תצפיות של חוסר היכולת של אנטיביוטיקה גנטמיצין אחרים כדי להרוג חיידקים תאיים נוצלו במחקרים מוקדם הפלישה של תאים לארח על ידי חיידקים 4-8. השימוש של 24, 48 או אפילו 96-היטב צלחות מאפשרת את הדור של כמויות גדולות של נתונים כמותיים לשחזור בתקופה קצרה של זמן ובעלות נמוכה יחסית. Assay היא גם מושכת משום שהיא אינה מצריכה ציוד מומחה, זה יכול להיות מותאם לעבודה עם חיידקים ותאים שונים, וניתן להשתמש בו כדי ללמוד את התפקיד של תהליכים בתא שני חיידקים מארח בפלישה 9. ואכן, מאז הניסויים המוקדמים, assay ההגנה גנטמיצין הועסק נרחב כדי למדוד תא הפלישה לארח על ידי מגוון של חיידקים שונים או אפילו שילוב של חיידקים 10,11. בעוד עקרונות הליבה זהים, שינויים קלים רבים בשיטת דווחו. במאמר זה תיארנו גרסה שלנו המצוין בו שינויים עשוי להיות נחוץ עבור חיידקים אחרים או לתאי המארח. בעת תכנון ניסוי כדי למדוד את התא המארח הפלישה שימוש בגישה זו יש מספר נקודות חשובות שיש לשקול:
רגישות חיידקים גנטמיצין. זה אולי נראה מובן מאליו, אבל חשוב לוודא את החיידק הנלמד רגיש גנטמיצין בטמפרטורת הריכוז, על משך הזמן לשמש. במקרה של רגישות, יתכן שניתן יהיה להשתמש באנטיביוטיקה אחרת 5. גישה חלופית ניתן להשתמש אנזימים ממס (lysostaphin, mutanolysin, ליזוזים) 12.
דגירה ו inoculum. כאשר ביצוע assay בפעם הראשונה חשוב לקבוע את הזמנים הדגירה אופטימלית inoculum חיידקי לשמש. לכן, הניסויים הראשוניים צריכה לבחון הן את הידבקות הפלישה לאורך זמן (5 דקות של עד 6 שעות). חשוב גם להעריך כיצד הפלישה מושפע ריבוי של זיהום (משרד הפנים, מספר החיידקים לכל תא). באופן כללי עדיף להשתמש במספר הנמוך ביותר של חיידקים האפשרי זה יצמצם נזק תאים בתרבית. הבדלים חשובים בין זנים עשוי לפספס אם תקופות דגירה ממושכת או inocula גדולים משמשים 9,13.
נזק נייד. חשוב לשטוף את החיידקים לפני השימוש. עם זאת, הנזק התאי אינו מוגבל ייצור הרעלן. פלישה חיידקית, אינדוקציה של אפופטוזיס והפרעה תפקודים תאיים נורמליים יכולים לגרום נזק הסלולר. זה יכול להוביל חדירה של גנטמיצין לתוך התא, להרוג חיידקים הפנימו ולתת את הרושם כי הפלישה לא קרה 14.
תנאי דגירה. הטמפרטורה ועל ההרכב של המדיום התרבות יכולה להיות השפעה משמעותית על הפלישה. למשל, פלישה של תאים על ידי הלה pyogenes סטרפטוקוקוס תלוי בנוכחות של פיברונקטין מסיסים, שהוא בדרך כלל קיים בסרום 15. שיקול נוסף הוא התפתחות חיידקים במדיום תרבות במהלך הניסוי.
תרבות וכימות של חיידקים תוך תאיים. למרות TX-100 לא יכול להרוג חיידקים תאיים, היא עלולה לעכב את הצמיחה שלהם. ככזה, הוא חשוב לבדוק שכפול חיידקים על התקשורת מוצק בנוכחות של חומרי ניקוי. איפה השפיע, יתכן שניתן יהיה להשתמש בריכוז נמוך יותר של חומר ניקוי או להשתמש אלטרנטיבה כגון saponin. היתרון של assay הגנה גנטמיצין על מכתים את סגול קריסטל assay מיקרוסקופיה היא כי פחות עבודה אינטנסיבית, והוא מאפשר איתור בידול של תת אוכלוסיות של חיידקים הפנימו. לדוגמה, ס ' aureus יכול לייצר או סוג המושבה רגילה (NCT) או גרסה מושבה קטנה (SCV) 16, אשר לא יהיה להבחין באמצעות מיקרוסקופ בתאי חיידקים בודדים. היתרון של מכתים את סגול קריסטל assay assay במיקרוסקופ על ההגנה גנטמיצין היא clumping התא ניתן להסביר וכי חיידקים תאיים כי הזן 'קיימא אבל לא culturable "המדינה יזוהו 17.
בחינת התפקיד של תהליכי התא המארח בפלישה חיידקי. מחקרים רבים המועסקים מעכבי תפקוד התא המארח כגון cytochalasin D, אשר מפריעה התארגנות אקטין. מחקרים כאלה יכולים לכלול גם נוגדנים היעד על פני קרום התא קולטנים מציאה siRNA של גנים ספציפיים 18. חשוב וחיוני על מנת להבטיח כי טיפולים אלה אינם משפיעים על כדאיות או עיקול של תאים בתרבית או להיות השפעה רעילה על חיידקים.
העתיד כיוונים:
"> ontent בגלל זה assay מבוצע בדרך כלל רב גם צלחות תרבית תאים, זה אפשרי תיאורטית להתאים אותה פעולה תפוקה גבוהה הקרנה, אשר עשויה לכלול בחינה של ספריות של התא לתפקד מעכבי פוטנציאל, אנטי infectives או אנטיביוטיקה נועדה למקד חיידקים תוך תאיים. לחילופין, גישה כזו יכולה לשמש מסך ספריות מוטציה לזהות גנים המעורבים הידבקות, פלישה או הישרדות תאיים. במקרים מסוימים זה עשוי להיות רצוי לכלול כוחות גזירה (זרימה) במערכת מודל, למשל כאשר הדוגמנות האנדותל, כדי לחקות באופן הדוק יותר בסביבת vivo. מקדמות שוטפות בעיצוב וייצור של תאים זרימה microfluidic התרבות מערכות תא לספק את האפשרות של העסקת assay הגנה גנטמיצין in-host הפתוגן מודלים המשלבים כוחות גזירה.לסיכום, פרוטוקול המתואר כאן מבוסס על גישות דומות בשימוש במשך שנים רבות. זה נרחב החלים על סוגים רבים של תאים בתרבית מינים חיידקים יכולים לייצר כמויות גדולות של נתונים במהירות ובעלות נמוכה יחסית.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי קרן Wellcome (WT 0,795,880).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 31885-023 | |
| Brain heart infusion | BioChemika | 53286 | |
| F–tal bovine serum | Invitrogen | 10091-148 | |
| HUVECs | Lonza Inc. | CC-2519 | |
| Endothelial basal medium | Lonza Inc. | CC-3121 | |
| Bovine brain extract (including heparin) | Lonza Inc. | CC-4092 | |
| Human endothelial growth factor | Lonza Inc. | CC-4017C | |
| Hydrocortisone | Lonza Inc. | CC-4035C | |
| GA-1000 | Lonza Inc. | CC-4092C | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710 | |
| Lysostaphin | AMBI | LSPN-50 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TKT-210-330P | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Cytopath | TCS Biosciences | HC8595 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | C3886 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| T75 flasks | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 430641 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C2618 | |
| Methyl-B-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | 332615 |
References
- Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).
- Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells. EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).
- Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper. Nature. 423, 177-181 (2003).
- Magoffin, R. L., Spink, W. W. The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics. J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).
- Mandell, G. L.
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).
- De Melo, M. A., Pechere, J. C. Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells. Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).
- Shaw, J. H., Falkow, S. Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae. Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).
- Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA. PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).
- Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans. Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).
- Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells. Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).
- Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis. Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).
- Schröder, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells. Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).
- Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells. Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).
- Eiff, C. von Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians. Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).
- Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells. Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).
