Summary
En allmän protokoll för att studera invasion av värdceller genom en bakteriell patogen, med fokus på
Abstract
Här kommer vi att beskriva hur vi studerar invasionen av humana endotelceller genom bakteriell patogen Staphylococcus aureus. Det allmänna protokollet kan användas för studier av cellens invasion av nästan alla odlingsbara bakterie. Stegen där specifika aspekter av invasion kan studeras, till exempel vilken roll aktin ombildning eller caveolae, kommer att markeras. Host celler odlas i behållare och när de är färdiga för användning är seedade i 24-brunnars plattor innehåller Thermanox täckglas. Använda täckglas tillåter avlägsnande av celler från brunnarna för att minska störningar från serumproteiner deponeras på sidorna av brunnar (som S. aureus skulle fästa). Bakterier odlas till önskad densitet och tvättas för att ta bort alla utsöndrade proteiner (t.ex. toxiner). Täckglas med sammanflytande skikt av endotelceller överförs till nya 24-brunnars plattor med färska odlingsmedium innan tillsats av bakterier. Bakterier och celler inkuberas därefter ihop för önskad tid i 5% CO 2 vid 37 ° C. För S. aureus detta är vanligtvis mellan 15-90 minuter. Thermanox täckglasen tas bort från varje brunn och doppa-tvättas i PBS för att ta bort lös bakterier. Om de totala tillhörande bakterier (anhängare och internaliserad) skall kvantifieras, är täckglas placeras sedan i en fräsch och som innehåller 0,5% Triton X-100 i PBS. Skonsam pipettering leder till fullständig cellslys och bakterier räknas upp med seriell utspädning och plätering på agar. Om antalet bakterier som har invaderat cellerna behövs, är täckglas tillsätts brunnar med 500 l medelstora vävnadsodling kompletteras med gentamicin och inkubationen fortsatte i 1 h, vilket kommer att döda alla externa bakterier. Täckglas då kan tvättas, lyserade celler och bakterier räknas upp bordläggningen på agar som beskrivs ovan. Om försöket kräver direkt visualisering kan täckglas fastställas och färgas för ljus, fluorescens eller konfokalmikroskopiska eller iordningställda för elektronmikroskop.
Protocol
Följande protokoll kommer att beskriva studiet av endotelceller invasion av S. aureus men kan teoretiskt användas för att studera cellulära invasion av någon odlingsbara bakterie. Skeden är specifika för S. aureus och endotelceller anges.
1. Beredning av bakterier
- Kultur S. aureus stammar för 4-16 timmar (beroende på tillväxt som krävs fas) i 10 ml Brain-Heart Infusion (BHI) buljong vid 37 ° C i luft med skakningar vid 200 rpm. Dessa tillväxt villkor är specifika för S. aureus och kan behöva anpassas till andra bakterier.
- Tvätta bakterier tre gånger i Dulbecco ändrade Eagles medium (DMEM, Invitrogen) av suppleanter rundor centrifugering vid rumstemperatur (5000 x g, 10 min), borttagning av kulturen supernatanten och resuspension av den bakteriella pelleten i en likvärdig kvantitet DMEM. Mät den optiska tätheten på de suspension av bakterier som sedan kan anpassas efter behov. För S. aureus, förbereder vi en suspension vid OD 600 = 1, vilket motsvarar ~ 10 9 cfu ml -1.
2. Endotelceller Kultur
- Kultur endothelial cellinje EA.hy926 1 i DMEM kompletteras med fetalt bovinserum (FBS, 10%) och L-glutamin (2 mm) vid 37 ° C i 5% CO 2. Alternativt kan samlas primära humana navelsträngen ven endotelceller (HUVECs) ha förvärvats från Lonza (Basel, Schweiz) och odlas i endotelceller bassubstratets kompletteras med 2% FBS, bovin hjärna extrakt (inklusive heparin), mänskliga endotelcellstillväxtfaktor och hydrokortison vid 37 ° C i 5% CO 2 enligt tillverkarens anvisningar (Lonza). Dessa tillväxt villkor är specifika för dessa celler och kan behöva anpassas för andra typer värdcell.
- Väx endotelcellerna i T75 flaskor för att slutföra confluency, kontrolleras av ögat.
- Förbered 24-brunnars plattor för införande av täckglas. Fin peang (flamma steriliserad) behövs för att flytta täckglas, som har ett ogenomskinligt och en blank yta. Placera täckglas i brunnarna av 24-brunnar med ogenomskinlig yta uppåt för att möjliggöra cellbindning.
- Befria celler från T75 kolven med 3 ml trypsin-EDTA (0,25%) och tillsätt 10 ml av den relevanta odlingsmedium.
- Tillsätt 500 l återsuspenderad celler till 24-brunnars plattor innehåller Thermanox glas täckglas. En T75 sammanflytande kolv av celler lämnat tillräcklig celler för två 24-brunnars plattor, vilket resulterar i ungefär 5 × 10 5 celler per brunn (i 500 l medium).
- Inkubera plattorna under 48 timmar enligt ovan, och kontrollera 100% cellen confluency med inverterad ljusmikroskop.
- Dip-tvätta täckglas i PBS och lägga till nya 24-brunnars plattor innehåller 490 l DMEM innehåller 10% FBS i varje brunn.
- För att undersöka betydelsen av specifika metaboliska processer i cell invasion, kan hämmare läggas till de odlade cellerna 1 timme före tillsats av bakterier och koncentrationer upprätthålls under analysen. Till exempel, för att avgöra vilken roll aktin ombildning i S. aureus invasionen av endotelceller, kan 50 mikroM cytochalasin D läggas till, eller för rollen som caveolae, 5 mm metyl-β-cyklodextrin kan läggas till.
3. Invasion analys
- Tillsätt 10 l av tvättad bakterier (vilket resulterar i cirka 2 × 10 7 CFU ml -1 S. aureus) till varje brunn som innehåller en tvättad täckglas med ett sammanhängande lager av endotelceller i 490 l DMEM innehåller 10% FBS.
- Inkubera 15-90 minuter vid 37 ° C i 5% CO 2.
- För att mäta det totala antalet bakterier i samband med celler (vidhäftande och internaliserad), DIP-tvätta täckglasen tre gånger i PBS och lägga till nya brunnar med 500 l 0,5% Triton X-100 i PBS. För att säkerställa att cellerna helt Lyse och frige alla internaliserade bakterier, pipett den flera gånger och pekar spetsen på pipetten direkt på ytan av täckglas.
- Räkna bakterierna genom bordläggning flytande suspension (eller utspädningar av denna vid behov) på ytan av TSA tallrikar. Eftersom TX-100 kommer Lyse många gramnegativa bakterier, kan saponin användas i stället 2.
- För att mäta antalet internaliserade bakterier, ta bort den kultur supernatanten från varje brunn som innehåller obundna bakterier och ersätta med 500 l DMEM/10% FBS kompletteras med 200 mikrogram ml -1 gentamicin. Vi använder rutinmässigt gentamicin snarare än lysostaphin här eftersom det är billigare och ger oss möjlighet att växla mellan experiment med olika typer av bakterier (t.ex. stafylokocker och lactococci) utan att behöva ändra den experimentella protokollet.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C i 5% CO 2 i 60 min för att döda alla extracellulära bakterier.
- Tvätta täckglas 3 gånger i PBS,Lyse och räkna med plätering på TSA beskrivs som för vidhäftning analysen ovan.
- I vissa fall kan det vara bättre att visuellt räkna antalet bakterier med ljusmikroskop. I detta fall, och specifika för S. aureus cell invasion, använd lysostaphin (10 mikrogram ml -1) istället för gentamicin att fysiskt förstöra den extracellulära bakterier.
- Inkubera täckglas för 20min vid 37 ° C i CO 2 i lysostaphin lösningen och skölj sedan och fixa med Cytopath (Cellpath).
- Översvämma täckglas med kristallviolett (0,5% w / v) för 5min.
- Dip-skölj i vatten, luft, torr och monteras på objektglas. Antalet bakterier per mm 2 i konfluenta endotelceller kan kvantifieras med ljusmikroskop.
4. Representativa resultat:
Redovisning av fibronektin bindande proteiner (FnBPA och FnBPB) på ytan av S. aureus ger förmågan att invadera endotelceller. Senaste arbete har omdefinierat det fibronektin-bindande domän FnBPA 3. Vildtyp (WT) S. aureus 8325,4 invaderar endotelceller med hög verkningsgrad, medan en stam som saknar både FnBPA och B (Δ FNB) visade signifikant reducerade nivåer av internalisering (Figur 1A). Komplettering av den muterade med en plasmid kodning FNB Ett minus fibronektin-bindande domän (pFnR0) inte främjade invasionen (Figur 1A). Däremot komplettering av den muterade med en plasmid som kodar för hela FNB en gen (pFnBA4) återställas invasion till WT nivåer (Figur 1A).
Roll FnBPA i endotelceller invasion kan också påvisas med hjälp av heterologa uttryck lactis värd Lactococcus. Redovisning av plasmidkodad FnBPA i L. lactis (pRM9 9) inte signifikant förbättrar vidhäftning till endotelceller jämfört med bakterier uttrycka någon FnBPA (CTL) (öppna barer, Figur 1B). Däremot FnBPA som uttrycker L. lactis invaderade endotelceller på betydligt högre nivåer än den icke-uttryckande stam (stängda barer, Figur 1B).
Försök utfördes fyra gånger i två exemplar och medelvärdet ± standardavvikelse presenteras. * Representera data som är statistiskt signifikant skillnad (p = <0,05) från WT eller CTL värden.
Figur 1. Invasion av EA. Hy926 endotelceller av S. aureus (A) eller L. lactis (B).
Discussion
Analysen vi beskriver är baserad på gentamicin skydd-analys som har använts i stor utsträckning för att studera invasion av värdceller av bakterier. Observationer av oförmåga gentamicin och andra antibiotika för att döda intracellulära bakterier som används i tidiga studier på invasionen av värdceller av bakterier 4-8. Användningen av 24, 48 eller ens 96-brunnar tillåter generationen av stora mängder kvantitativa, reproducerbara data i en kort tid och till relativt låg kostnad. Analysen är också intressant eftersom den inte kräver någon specialutrustning, den kan skräddarsys för att arbeta med olika bakterier och celler, och kan användas för att studera betydelsen av både bakterier och värdcell processer i invasionen 9. Ja, eftersom de tidigaste experimenten har gentamicin skydd analysen i stor utsträckning används för att mäta invasion värdcell av en rad olika bakterier eller till och med kombinationer av bakterier 10,11. Även de grundläggande principerna är desamma, många subtila skillnader i metod har rapporterats. I denna artikel har vi beskrivit vår version och visade var ändringar kan vara nödvändiga för andra bakterier eller celler värd. Vid utformning av ett experiment för att mäta invasionen värdcellen som använder denna metod finns det ett antal viktiga punkter att tänka på:
Bakteriell känslighet för gentamicin. Detta kan tyckas självklart, men det är viktigt att se till att bakterien som studeras är mottagliga för gentamicin på koncentration, temperatur och över tidslängden som ska användas. Vid okänslighet, kan det vara möjligt att använda andra antibiotika 5. En alternativ ansats kan vara att använda lytiska enzymer (lysostaphin, mutanolysin, lysozym) 12.
Inkubation och inokulat. När man utför denna analys för första gången är det viktigt att fastställa den optimala inkubationstiderna och bakteriella inokulat som ska användas. Därför bör inledande experiment undersöka både vidhäftning och invasion över tid (5 min till upp till 6 h). Det är också viktigt att bedöma hur invasion påverkas av den mångfald av infektion (MOI, antalet bakterier per cell). I allmänhet är det bäst att använda det minsta antalet bakterier möjligt eftersom detta kommer att minska skador på odlade celler. Viktiga skillnader mellan stammar kan missa om längre inkubationstid eller stora inokulat används 9,13.
Cellskador. Det är viktigt att tvätta bakterier före användning. Dock är cellskador inte begränsad till toxinproduktion. Bakteriell invasion kan induktion av apoptos och störningar av normala cellulära funktioner orsaka alla cellskador. Detta kan leda till penetration av gentamicin in i cellen och dödade internaliserade bakterier och ge intryck av att invasionen inte har inträffat 14.
Ruvning förhållanden. Temperatur och sammansättning odlingsmedium kan ha en betydande inverkan på invasionen. Till exempel är invasionen av HeLa celler av Streptococcus pyogenes beroende av förekomsten av lösliga fibronektin, vilket vanligtvis är närvarande i serum 15. En annan faktor är bakterietillväxt i odlingsmediet under försöket.
Kultur och kvantifiering av intracellulära bakterier. Även om TX-100 inte får döda intracellulära bakterier, kan det hämma deras tillväxt. Som sådan är det viktigt att kontrollera bakteriell replikering på fasta medier i närvaro av rengöringsmedel. Där påverkas, kan det vara möjligt att använda lägre koncentrationer av tvättmedel eller att använda ett alternativt exempel saponin. En fördel med gentamicin skydd analys över kristallviolett färgning och mikroskopi analysen är att det är mindre personalkrävande och det gör att upptäcka och differentiering av delpopulationer av internaliserade bakterier. Till exempel, S. aureus kan producera antingen en vanlig koloni typ (NCT) eller den lilla kolonin variant (SCV) 16, som inte skulle kunna skiljas genom mikroskopi av enskilda bakterieceller. En fördel med kristallviolett färgning och mikroskopi analys över gentamicin skydd analysen är cellen klumpar kan redovisas och att intracellulära bakterier som kommer in en "livskraftig men icke odlingsbara" staten kommer att upptäckas 17.
Undersöka vilken roll processer värdcellens i bakterie invasion. Många studier har anställt hämmare av värdcellens funktion som cytochalasin D, som stör aktin ombildning. Sådana studier kan även innehålla antikroppar som riktar cellytan receptorer och siRNA ÖVERVÄLDIGANDE av specifika gener 18. Det är mycket viktigt att säkerställa att dessa behandlingar inte påverkar lönsamheten eller fastsättning av odlade celler eller har toxiska effekter på bakterier.
Framtida inriktningar:
INNEHÅLL "> Eftersom denna analys vanligen utförs i flera bra plattor cellodling, är det teoretiskt möjligt att anpassa den till en high-throughput screening drift, vilket kan innebära en undersökning av biblioteken i potentiella cell-funktion hämmare, medel mot infektioner eller antibiotika utformade för att rikta intracellulära bakterier. Alternativt kan ett sådant tillvägagångssätt kan användas för att screena muterade bibliotek för att identifiera gener involverade i adhesion, invasion och intracellulär överlevnad. I vissa fall kan det vara önskvärt att skjuvkrafter (flöde) i modellen systemet, till exempel när modellering endotelet, för att närmare efterlikna in vivo-miljö. Aktuella framsteg inom design och tillverkning av flödet celler och mikroflödessystem cellsystem kultur ge möjlighet att anställa gentamicin skydd analysen i värd-patogen modeller som innehåller skjuvkrafter.Sammanfattningsvis är det protokoll som beskrivs här bygger på liknande tillvägagångssätt som används under många år. Det är allmänt tillämpas på många typer av odlade celler och bakteriearter och kan generera stora mängder data snabbt och till relativt låg kostnad.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av Wellcome Trust (WT 0.795.880).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 31885-023 | |
| Brain heart infusion | BioChemika | 53286 | |
| F–tal bovine serum | Invitrogen | 10091-148 | |
| HUVECs | Lonza Inc. | CC-2519 | |
| Endothelial basal medium | Lonza Inc. | CC-3121 | |
| Bovine brain extract (including heparin) | Lonza Inc. | CC-4092 | |
| Human endothelial growth factor | Lonza Inc. | CC-4017C | |
| Hydrocortisone | Lonza Inc. | CC-4035C | |
| GA-1000 | Lonza Inc. | CC-4092C | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710 | |
| Lysostaphin | AMBI | LSPN-50 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TKT-210-330P | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Cytopath | TCS Biosciences | HC8595 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | C3886 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| T75 flasks | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 430641 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C2618 | |
| Methyl-B-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | 332615 |
References
- Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).
- Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells. EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).
- Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper. Nature. 423, 177-181 (2003).
- Magoffin, R. L., Spink, W. W. The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics. J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).
- Mandell, G. L.
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).
- De Melo, M. A., Pechere, J. C. Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells. Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).
- Shaw, J. H., Falkow, S. Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae. Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).
- Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA. PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).
- Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans. Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).
- Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells. Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).
- Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis. Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).
- Schröder, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells. Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).
- Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells. Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).
- Eiff, C. von Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians. Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).
- Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells. Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).
