Summary
Um protocolo geral para o estudo da invasão das células do hospedeiro por um agente patogénico, com foco na
Abstract
Aqui vamos descrever a forma como nós estudamos a invasão de células endoteliais humanas por Staphylococcus aureus bacteriana patogênica. O protocolo geral pode ser aplicada ao estudo da invasão celular por praticamente qualquer bactéria cultivável. Os estágios em que aspectos específicos de invasão pode ser estudado, como o papel do rearranjo de actina ou cavéolas, será destacado. Células hospedeiras são cultivadas em frascos e quando estiver pronto para o uso estão semeados em placas de 24 poços contendo lamínulas Thermanox. Usando lamínulas permite posterior remoção das células dos poços para reduzir a interferência de proteínas do soro depositado para os lados dos poços (a que S. aureus seria anexar). As bactérias são cultivadas com a densidade necessária e lavada para remover qualquer proteínas secretadas (toxinas, por exemplo). Lamínulas com camadas confluentes de células endoteliais são transferidos para nova placas de 24 poços contendo meio de cultura fresco antes da adição de bactérias. Bactérias e células são então incubadas juntas para a quantidade necessária de vez em 5% CO 2 a 37 ° C. Para S. aureus este é tipicamente entre 15-90 minutos. Lamínulas Thermanox são removidos de cada bem e dip-lavados em PBS para remover bactérias solto. Se o total bactérias associadas (aderente e internalizadas) devem ser quantificados, lamínulas são então colocados em um poço fresco contendo 0,5% Triton X-100 em PBS. Pipetagem suave leva à completa lise das células e bactérias são enumerados por diluição seriada e plaqueamento em ágar. Se o número de bactérias que invadiram as células é necessário, lamínulas são adicionados aos poços contendo 500 mL meio de cultura de tecidos suplementado com gentamicina e incubação continuou por 1 h, que vai matar todas as bactérias externas. Lamínulas pode então ser lavada, as células lisadas e bactérias enumeradas por plaqueamento em ágar, conforme descrito acima. Se o experimento requer visualização direta, lamelas podem ser fixadas e coradas para microscopia de luz, fluorescência confocal ou ou preparados para microscopia eletrônica.
Protocol
O protocolo a seguir irá descrever o estudo da invasão de células endoteliais por S. aureus, mas teoricamente pode ser usado para estudar invasão celular por qualquer bactéria cultivável. Estágios específicos para S. células endoteliais aureus e são indicados.
1. Preparação de bactérias
- Cultura S. cepas de Staphylococcus de 16/04 h (dependendo da fase de crescimento necessário) em 10 Cérebro-caldo Infusão ml (BHI) a 37 ° C no ar com agitação a 200 rpm. Estas condições de crescimento são específicos para S. aureus e pode precisar ser adaptado para outras bactérias.
- Lavar as bactérias três vezes em meio Modified Dulbecco Águia (DMEM; Invitrogen) por rodadas alternadas de centrifugação a temperatura ambiente (5.000 x g, 10 min), a remoção do sobrenadante da cultura e ressuspensão do pellet bacteriano em um volume equivalente de DMEM. Medir a densidade óptica da suspensão resultante de bactérias que podem ser ajustados conforme a necessidade. Para S. aureus, nós preparamos uma suspensão na OD = 1 600, o que corresponde a ~ 10 9 ufc ml -1.
2. Cultura de células endoteliais
- Cultura da linhagem de células endoteliais EA.hy926 1 em DMEM suplementado com soro fetal bovino (FBS, 10%) e L-glutamina (2 mM) a 37 ° C em 5% CO 2. Alternativamente, agrupados células primárias de veias umbilicais humanas endoteliais (HUVECs) pode ser comprado de Lonza (Basel, Suíça) e cultivadas em meio basal endotelial suplementado com 2% de SFB, extrato de cérebro de bovinos (incluindo a heparina), fator de crescimento endotelial humana e hidrocortisona a 37 ° C em 5% de CO 2 de acordo com as instruções do fabricante (Lonza). Estas condições de crescimento são específicos para estas células e pode precisar ser adaptado para outros tipos de células host.
- Cultivar células endoteliais em frascos de T75 para completar confluência, verificada por olho.
- Prepare as placas de 24 poços para a inserção das lamelas. Pinças finas (chama esterilizado) são necessários para mover as lamelas, que têm uma superfície opaca e um brilhante. Lamínulas lugar nos poços da placa de 24 poços com a superfície opaca virada para cima para permitir a ligação celular.
- Liberar as células do frasco T75 com 3 ml de tripsina-EDTA (0,25%) e adicionar a 10 ml do meio de cultura relevante.
- Adicionar 500 mL de células em suspensão para placas de 24 poços contendo lamínulas de vidro Thermanox. Um frasco T75 confluentes de células desde células suficientes para duas placas de 24 poços, resultando em cerca de 5 × 10 5 células por poço (em 500 mL de médio).
- Incubar as placas por 48 h, como descrito acima, e verificar 100% de células confluência por microscopia de luz invertida.
- Dip-lavagem lamínulas em PBS e adicionar novas placas de 24 poços contendo 490 l contendo DMEM 10% FBS em cada poço.
- Para examinar o papel de determinados processos metabólicos na invasão celular, os inibidores podem ser adicionados a culturas de células de 1 h antes da adição de bactérias e concentrações mantida durante o ensaio. Por exemplo, para determinar o papel do rearranjo de actina em S. aureus invasão das células endoteliais, 50 mM citocalasina D pode ser adicionada, ou para o papel de cavéolas, 5 mM metil-β-ciclodextrina pode ser adicionado.
3. Ensaio de invasão
- Adicionar 10 ml de bactérias lavada (resultando em cerca de 2 × 10 7 ufc ml -1 de S. aureus) a cada poço contendo uma lamela lavado com uma camada confluente de células endoteliais em 490 l contendo DMEM 10% FBS.
- Incubar durante 15-90 minutos a 37 ° C em 5% CO 2.
- Para medir o número total de bactérias associadas com as células (aderente e internalizadas), mergulhe-as lamelas lavar três vezes em PBS e adicione aos poços contendo 500 mL fresco Triton 0,5% X-100 em PBS. Para garantir as células totalmente lisar e liberar todas as bactérias internalizadas, pipetar o várias vezes, apontando a ponta da pipeta directamente na superfície da lamela.
- Enumerar as bactérias por plaqueamento a suspensão líquida (ou diluições deste, sempre que necessário) sobre a superfície de placas de TSA. Desde TX-100 vai lisar muitas bactérias Gram-negativas, saponina pode ser usado em vez 2.
- Para medir o número de bactérias internalizadas, remover o sobrenadante da cultura de cada bactéria unbound bem contendo e substituir com 500 mL DMEM/10% FBS suplementada com 200 mg ml -1 gentamicina. Rotineiramente usamos gentamicina, em vez de lysostaphin aqui como é mais barato e nos permite alternar entre experimentos usando diferentes tipos de bactérias (por exemplo, estafilococos e Lactococci) sem ter que mudar o protocolo experimental.
- Incubar as placas a 37 ° C em 5% de CO 2 por 60 minutos para matar todas as bactérias extracelulares.
- Lavar lamínulas 3 vezes em PBS,lisar e enumerar por plaqueamento em TSA, conforme descrito para o ensaio de adesão acima.
- Em alguns casos, pode ser preferível visualmente contar o número de bactérias por microscopia de luz. Neste caso, e específicos para S. invasão celular aureus, use lysostaphin (10 mg ml -1), em vez de gentamicina para destruir fisicamente as bactérias extracelulares.
- Incubar lamínulas por 20min a 37 ° C em CO 2 na solução lysostaphin, em seguida, lavar e consertar com Cytopath (Cellpath).
- Flood as lamelas com cristal violeta (0,5%, w / v) para 5min.
- Dip-enxágüe em água, ar seco e montagem em lâminas de vidro. O número de bactérias por mm 2 de células endoteliais confluentes podem ser quantificados utilizando microscopia de luz.
4. Resultados representativos:
Expressão de proteínas de ligação a fibronectina (FnBPA e FnBPB) sobre a superfície da S. aureus confere a capacidade de invadir células endoteliais. Trabalho recente redefiniu o domínio de ligação de fibronectina FnBPA 3. Do tipo selvagem (WT) S. aureus 8.325,4 invade células endoteliais com alta eficiência, enquanto que uma cepa falta tanto FnBPA e B (Δ FNB) apresentaram níveis significativamente reduzida de internalização (Figura 1A). Complementação do mutante com um plasmídeo A FNB menos o domínio de ligação de fibronectina (pFnR0) não promover a invasão (Figura 1A). Por outro lado, a complementação do mutante com um plasmídeo FNB inteira Um gene (pFnBA4) restaurado invasão a níveis WT (Figura 1A).
O papel do FnBPA na invasão de células endoteliais também pode ser demonstrada através dos expressão heteróloga Lactococcus lactis host. Expressão de plasmídeo codificado FnBPA em L. lactis (pRM9 9) não aumentar significativamente a adesão às células endoteliais em comparação com as bactérias não expressar FnBPA (CTL) (bares abertos, Figura 1B). Por outro lado, expressando-FnBPA L. lactis invadiram células endoteliais em níveis significativamente mais altos do que a cepa não expressar (bares fechados, Figura 1B).
Experimentos foram realizados quatro vezes em duplicado e os média ± desvio padrão é apresentada. * Representam dados que são estatisticamente diferentes (p = <0,05) da WT ou valores CTL.
Figura 1. Invasão de EA. Hy926 células endoteliais por S. aureus (A) ou L. lactis (B).
Discussion
O ensaio descrevemos baseia-se no ensaio de proteção a gentamicina, que tem sido amplamente utilizada para estudar a invasão das células do hospedeiro por bactérias. Observações da incapacidade dos antibióticos gentamicina e outros para matar as bactérias intracelulares foram utilizados nos primeiros estudos sobre a invasão das células do hospedeiro por bactérias 4-8. O uso de 24, 48 ou mesmo placas de 96 poços permite a geração de grandes quantidades de quantitativos, dados reprodutíveis em um curto período de tempo e de custo relativamente baixo. O ensaio também é atraente, porque não requer equipamento especializado, ele pode ser adaptado para trabalhar com várias bactérias e células, e pode ser usado para estudar o papel dos processos celulares tanto bacterianas e de acolhimento na invasão 9. De fato, desde os primeiros experimentos, o ensaio de proteção gentamicina tem sido amplamente empregada para medir a invasão da célula hospedeira por uma gama de bactérias diferentes, ou mesmo combinações de bactérias 10,11. Embora os princípios fundamentais são os mesmos, muitas variações sutis no método tem sido relatado. Neste artigo descrevemos a nossa versão e indicou onde as modificações podem ser necessários para outras bactérias ou células do hospedeiro. Ao projetar um experimento para medir a invasão da célula hospedeira usando essa abordagem, há uma série de pontos importantes a considerar:
Sensibilidade bacteriana à gentamicina. Isto pode parecer óbvio, mas é importante garantir que a bactéria em estudo é suscetível a gentamicina, na concentração, temperatura e ao longo da duração do tempo a ser utilizado. No caso de insensibilidade, pode ser possível a utilização de outros antibióticos 5. Uma abordagem alternativa pode ser a utilização de enzimas líticas (lysostaphin, mutanolysin, lisozima) 12.
Incubação e inóculo. Ao executar este teste pela primeira vez é importante para estabelecer o período de incubação ideal e inóculo bacteriano a ser utilizado. Portanto, experimentos iniciais deve examinar tanto a adesão e invasão ao longo do tempo (5 min para até 6 h). Também é importante avaliar como a invasão é afetado pela multiplicidade de infecção (MOI, o número de bactérias por célula). Em geral, é melhor usar o menor número possível de bactérias como isso irá reduzir os danos às células em cultura. Importantes diferenças entre cepas podem ser perdidas se os períodos de incubação prolongado ou inóculos grandes são usadas 9,13.
Danos celulares. É importante lavar as bactérias antes da utilização. No entanto, os danos celulares não se restringe à produção de toxinas. Invasão bacteriana, indução de apoptose e interrupção das funções normais celulares podem causar danos celulares. Isso pode levar a penetração de gentamicina na célula, matando as bactérias internalizadas e dando a impressão de que a invasão não ocorreu 14.
Condições de incubação. A temperatura ea composição do meio de cultura pode ter um impacto significativo sobre a invasão. Por exemplo, a invasão de células HeLa por Streptococcus pyogenes é dependente da presença de fibronectina solúvel, que é normalmente presentes no soro 15. Outra consideração é o crescimento bacteriano no meio de cultura durante o curso do experimento.
Cultura e quantificação de bactérias intracelulares. Embora TX-100 não pode matar as bactérias intracelulares, pode inibir o seu crescimento. Como tal, é importante verificar a replicação bacteriana em meios sólidos na presença do detergente. Onde afetados, pode ser possível a utilização de menores concentrações do detergente ou para usar uma alternativa, como saponina. Um benefício do ensaio de proteção gentamicina sobre a coloração violeta cristal e ensaio de microscopia é que é menos trabalhoso, e permite a detecção e diferenciação de sub-populações de bactérias internalizadas. Por exemplo, S. aureus pode produzir tanto um tipo de colônia normal (NCT) ou a variante pequena colônia (SCV) 16, que não seriam distinguíveis por microscopia de células bacterianas individuais. Um benefício da coloração violeta cristal e ensaio de microscopia sobre o ensaio de proteção gentamicina é a aglutinação de células podem ser contabilizadas e que as bactérias intracelulares que digitar um 'viável, mas não cultivável "estado será detectado 17.
Examinar o papel dos processos da célula hospedeira na invasão bacteriana. Muitos estudos têm empregado inibidores da função da célula hospedeira tais como citocalasina D, que interfere com rearranjo de actina. Tais estudos também podem incluir anticorpos que alvejam receptores de superfície celular e knockdown siRNA de genes específicos 18. É de vital importância para assegurar que estes tratamentos não afetam a viabilidade ou a fixação de células em cultura ou ter efeitos tóxicos sobre bactérias.
Futuras direções:
> ONTEÚDO "Porque este ensaio é normalmente realizado em multi-bem placas de cultura de células, é teoricamente possível adaptá-lo a uma operação de rastreio de alto rendimento, que pode envolver o exame de bibliotecas de potenciais inibidores da função das células, anti-infecciosos ou antibióticos projetado para atacar bactérias intracelulares. Alternativamente, essa abordagem pode ser usada para a tela mutante bibliotecas para identificar genes envolvidos na adesão, invasão e sobrevivência intracelular. Em alguns casos, pode ser desejável incluir forças de cisalhamento (fluxo) no sistema modelo, por exemplo, quando a modelagem do endotélio, para mais perto imitar o no ambiente vivo. avanços atuais na concepção e fabrico de células de fluxo e sistemas de cultura de células microfluídicos oferecem a possibilidade de empregar o ensaio de proteção gentamicina na patógeno-hospedeiro modelos que incorporam as forças de cisalhamento.Em resumo, o protocolo aqui descrito é baseado em abordagens similares utilizados por muitos anos. É amplamente aplicável a muitos tipos de células cultivadas e espécies de bactérias e pode gerar grandes quantidades de dados rapidamente ea um custo relativamente pequeno.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust (WT 0.795.880).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 31885-023 | |
| Brain heart infusion | BioChemika | 53286 | |
| F–tal bovine serum | Invitrogen | 10091-148 | |
| HUVECs | Lonza Inc. | CC-2519 | |
| Endothelial basal medium | Lonza Inc. | CC-3121 | |
| Bovine brain extract (including heparin) | Lonza Inc. | CC-4092 | |
| Human endothelial growth factor | Lonza Inc. | CC-4017C | |
| Hydrocortisone | Lonza Inc. | CC-4035C | |
| GA-1000 | Lonza Inc. | CC-4092C | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710 | |
| Lysostaphin | AMBI | LSPN-50 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TKT-210-330P | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Cytopath | TCS Biosciences | HC8595 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | C3886 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| T75 flasks | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 430641 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C2618 | |
| Methyl-B-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | 332615 |
References
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