Summary
हम photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति रिकवरी (FRAP) और (फ्लिप) photobleaching के लिए भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ते) में chromatin प्रोटीन की गतिशीलता की निगरानी में प्रतिदीप्ति हानि सहित photobleaching तरीकों का वर्णन. Chromatin प्रोटीन गतिशीलता, जो chromatin plasticity के अध्ययन का मतलब है माना जाता है pluripotent कोशिकाओं में बढ़ाया है.
Protocol
1. ES कोशिकाओं चढ़ाना
टी = 0 बजे
MEF चढ़ाना
- कोट रहते 8 अच्छी तरह μ-स्लाइड्स इमेजिंग (ibidi, म्यूनिख, जर्मनी) जिलेटिन या संभाग कवर चश्मे में (लैब - टेक, Rochester, NY) के साथ या गिलास नीचे संस्कृति बर्तन में (MatTek, Ashland, एमए). 5-30 मिनट के लिए छोड़ दो और दूर मुक्त जिलेटिन aspirate.
- बीज MEFs +२२००० / अच्छी तरह से 250 DMEM के μl कुल मात्रा में [10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक]. कोशिकाओं को एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में वृद्धि करने की अनुमति दें.
टी = 6 बजे
ES सेल चढ़ाना
- Aspirate DMEM.
- बीज प्रत्येक 15,000 R1 कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह / 250 ES सेल मीडिया के μl कुल मात्रा में अच्छी तरह से लेपित MEF [10% ईएससी ग्रेड भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 0.1 मिमी nonessential अमीनो एसिड, 0.1 मिमी β के साथ पूरक mercaptoethanol, और 1000 U / मिलीलीटर लेकिमिया निरोधात्मक कारक (LIF)] 30% से 50% संगम अगले दिन प्राप्त करने के लिए.
2. ES कोशिकाओं Transfecting
टी = 24 घंटे
क्षणिक अभिकर्मक
- 250 के साथ μl / अच्छी तरह से ताजा ES सेल मीडिया के ES सेल मीडिया बदलें.
- 1.5 मिलीलीटर बाँझ टेस्ट ट्यूब में, 100 μl सीरम स्वतंत्र मीडिया (Gibco) Opti-सदस्य], तो सीरम स्वतंत्र मीडिया में सीधे 10 μl LT1 अभिकर्मक अभिकर्मक (Mirus) पारगमन जोड़ने जोड़ें. कोमल pipetting द्वारा मिक्स और 5-20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- 1.5 μg GFP संलयन प्लाज्मिड डीएनए (H1e, H1o या HP1) पतला पारगमन-LT1 अभिकर्मक जोड़ें. कोमल pipetting द्वारा मिक्स और कमरे के तापमान पर 15-30 मिनट के लिए सेते हैं.
- 13.5 μl / अभिकर्मक मिश्रण अच्छी तरह से जोड़ें. भंवर 8 μ-स्लाइड्स भी प्रसार सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से. 24 बजे के बाद ताजा ES सेल मीडिया के 250 μl के साथ पुराने ES सेल मीडिया की जगह.
3. FRAP और फ्लिप प्रदर्शन
टी = 48-72 बजे
- प्रयोग किसी भी लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग (CLSM) पर किया जा सकता है है लेकिन एक सामान्य प्रयोग / FRAP फ्लिप के बाद से, कई लगातार छवियों अर्जित कर रहे हैं, यह एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन, जो अधिग्रहण की गति में सक्षम बनाता का उपयोग की सिफारिश की है और यह सुनिश्चित करता है कि कोई अवांछित विरंजन नमूना प्रारंभिक जानबूझकर विरंजन घटना के बाद घटित होगा. यहाँ, हम का उपयोग क्रांति कताई डिस्क confocal प्रणाली (www.Andor.com) Yokogawa CSU एक्स कताई डिस्क सिर के साथ, सलाह देते हैं. इस प्रणाली के एक बिंदु स्कैनिंग प्रणाली के साथ एक विशेष FRAPPA मॉड्यूल का उपयोग कर photobleach दोहरी क्षमता है, और तेजी से वापस प्रकाश स्विच करने के लिए कताई डिस्क छवियों का उपयोग कर इकट्ठा. 3 सबसे आम fluorescing प्रयोगों photobleaching के लिए इस्तेमाल किया प्रोटीन GFP, YFP और चेरी हैं. यदि GFP या YFP उपयोग किया जाता है, एक ~ 488 एनएम लेजर की आवश्यकता है. चेरी के लिए, एक ~ 560 एनएम लेजर का उपयोग करें. सभी मामलों में, हम ठोस राज्य पराबैंगनीकिरण का उपयोग करने की सलाह देते हैं. एक स्वचालित चरण के बाद उपयोगी है, लेकिन आवश्यक नहीं है. के बाद से जीवित कोशिकाओं imaged कर रहे हैं, यह आवश्यक है करने के लिए एक पर्यावरण कक्ष का उपयोग करें (हम एक एलआईएस से उपयोग करते हैं, स्विट्जरलैंड), नियंत्रित ऑक्सीजन, नमी, सीओ 2 और तापमान. FRAP जबकि इमेजिंग न्यूनतम लेजर आवश्यक शक्ति (आमतौर पर 10% के क्षेत्र है, जब प्रतिदीप्ति स्तर पर्याप्त है) के साथ किया जाता है अधिकतम लेजर तीव्रता का उपयोग कर किया जाता है.
उपयुक्त तरंग दैर्ध्य के फ्लोरोसेंट रोशनी के साथ कोशिकाओं के निरीक्षण और एक एक 60x तेल विसर्जन लेंस का उपयोग GFP व्यक्त कक्ष का चयन करें. सही subcellular वितरण सुनिश्चित करें. कभी कभी, जब अभिव्यक्ति के स्तर को भी उच्च रहे हैं, प्रोटीन स्थानीयकरण 'फैल' nucleolus जैसे अन्य डिब्बों को हो सकता है. ऐसे कक्षों का चयन नहीं होना चाहिए. - अब एक इमेजिंग प्रोटोकॉल का सेट: photobleaching पहले 3-5 फ्रेम इकट्ठा, तो euchromatin या heterochromatin (गाढ़ा GFP foci के रूप में देखा) में photobleach और photobleach 90-120 फ्रेम के बाद 250-1000 एमएस अंतराल के साथ, इकट्ठा: H1e GFP, 1000 एमएस H1o, और HP1-GFP, 250 एमएस (अंतराल समय में परिवर्तन के अनुसार प्रोटीन गतिशीलता, जहां अत्यधिक गतिशील प्रोटीन कम अंतराल समय की आवश्यकता के लिए). हम आम तौर पर 20-40 μseconds (1-2 पुनरावृत्तियों) के एक लेजर पल्स के साथ photobleaching के लिए 80-100% लेजर तीव्रता का उपयोग करें, लेकिन इन नंबरों विश्लेषण प्रोटीन और अभिव्यक्ति के स्तर के अनुसार बदल सकते हैं. जब photobleaching उपयुक्त है, तो आप अपने GFP प्रतिदीप्ति में एक "काला छेद" का पालन करना चाहिए. काला छेद धीरे - धीरे प्रतिदीप्ति निम्नलिखित वसूली के साथ फिर से भरा है. हालांकि कताई डिस्क प्रति सेकंड 60 के आसपास छवियों (अच्छा प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ है और जब किसी एकल कक्ष पर zooming) प्राप्त कर सकते हैं, हम ऐसे उच्च कम छवि गुणवत्ता और क्षमता में वृद्धि हुई phototoxicity के कारण गति में सिस्टम का उपयोग नहीं की सिफारिश करते हैं.
- एक फ्लिप प्रयोग के लिए एक अलग इमेजिंग प्रोटोकॉल सेट: विरंजन से पहले 3-5 फ्रेम इकट्ठा, तो उसी जगह पर दोहराया विरंजन जबकि छवियों एकत्रित शुरू. H1e GFP, ब्लीच हर 5 सेकंड H1o GFP, ब्लीच के लिए हर 2 सेकंड के लिए, और HP1-GFP हर 1 सेकंड ब्लीच के लिए. एक ब्लीचघ छवियों को बार - बार इकट्ठा पूरे प्रयोग के दौरान.
- या तो तकनीक के लिए, 20-30 कोशिकाओं पर इस प्रक्रिया को दोहराएँ. सांख्यिकीय प्रयोजनों के लिए अलग अलग दिनों पर अधिमानतः 3 या उससे अधिक बार प्रयोग दोहराएँ. समरूप आबादी और सही सेटिंग्स में, मानक विचलन आम तौर पर कम (<5%) है.
दोनों FRAP और फ्लिप के लिए, और प्रक्षालित क्षेत्र के आकार और आकार वसूली गतिशीलता को प्रभावित करती है और एक प्रयोग के भीतर स्थिर रहना चाहिए. इसके अलावा, जब दो कोशिकाओं की तुलना में कर रहे हैं, समान प्रोटोकॉल और इस्तेमाल किया जाना चाहिए कोशिकाओं को एक ही दिन के रूप में शक्ति लेजर और अन्य शर्तों में उतार - चढ़ाव और प्रयोग के परिणाम प्रभावित हो सकता है पर क्रमिक रूप से विश्लेषण करना चाहिए.
4. FRAP और फ्लिप डेटा विश्लेषण
- सभी FRAP फ्रेम एकत्र प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के आरओआई (आरओआई b = प्रक्षालित क्षेत्र), पृष्ठभूमि क्षेत्र (आरओआई bg), और गैर प्रक्षालित से पहले समय की एक समारोह के रूप में और विरंजन के बाद परमाणु क्षेत्र ( आरओआई नायब). जब प्रक्षालित क्षेत्र नगण्य है पूरे नाभिक सामान्य प्रयोजनों के लिए चुना जा सकता है है.
- हर समय बिंदु के लिए, सूत्र के अनुसार डेटा मानक के अनुसार: (आरओआई ख - आरओआई bg) / (आरओआई नायब - आरओआई bg) / (pbROI ख - pbROI bg) / (pbROI नायब - pbROI bg), पंजाब के पूर्व प्रक्षालित अर्थ. पूर्व ब्लीच छवियों के लिए आप लगभग 1 के एक मूल्य मिलना चाहिए. ब्लीच के बाद पहली छवि ब्लीच गहराई का संकेत होगा. वास्तविक ब्लीच गहराई मूल्य के लिए 1 से मान घटाएँ. हर कोशिका और प्रत्येक प्रयोग से औसतन 20-30 कोशिकाओं के लिए दोहराएँ.
- सभी फ्लिप एकत्र फ्रेम में, गैर प्रक्षालित परमाणु क्षेत्र में प्रतिदीप्ति तीव्रता, और पृष्ठभूमि क्षेत्र (आरओआई = गैर - प्रक्षालित क्षेत्र नायब, आरओआई bg = पृष्ठभूमि) को मापने. फ्लिप डेटा की गणना एक FRAP वक्र समान है, केवल विश्लेषण आरओआई (आरओआई नायब) वास्तविक प्रक्षालित क्षेत्र है, जो गणना के लिए इस्तेमाल नहीं किया है की तुलना में अलग होना चाहिए: (आरओआई नायब - आरओआई bg) / (pbROI नायब - pbROI bg) . यह भी संभव है सामान्य प्रयोजनों के लिए एक पड़ोसी सेल (आरओआई n = पड़ोसी सेल) का उपयोग करें: (आरओआई नायब - आरओआई bg) / (आरओआई n - आरओआई bg) (pbROI नायब - pbROI bg) / / (pbROI पता - pbROI bg ).
डेटा संग्रह के बाद, यह संभव है कंप्यूटर सिमुलेशन के लिए प्रयोगात्मक डेटा फिट. यह एक अच्छा निकटता, मोबाइल अंश, स्थिर अंश और आधा अधिकतम के साथ गणना, अनुमति देता है. यहाँ हम FRAP विश्लेषण के गणितीय और सांख्यिकीय पहलुओं पर चर्चा नहीं और अन्य उत्कृष्ट 4-9 प्रकाशनों के लिए पाठक उल्लेख होगा . ब्लीच गहराई पूर्व ब्लीच संकेत (100%) और ब्लीच के बाद पहली छवि के बीच की दूरी (y-अक्ष पर) को संदर्भित करता है, मोबाइल अंश ब्लीच गहराई और के बीच की दूरी (y-अक्ष पर) को संदर्भित करता है है बरामद संकेत जब कैनेटीक्स एक पठार तक पहुँच जाता है, और स्थिर अंश बरामद संकेत और पूर्व ब्लीच संकेत (100%) के बीच (y-अक्ष पर) दूरी (आंकड़े 1B और 2B देखें) को संदर्भित करता है है. इस विश्लेषण के अलावा, वहाँ अच्छा गणितीय मॉडल के लिए डेटा फिट हैं. एक एकल प्रतिपादक, समीकरण के लिए
जहां टी समय है, एक मोबाइल अंश है, 1-एक स्थिर अंश है और कश्मीर बंद पृथक्करण स्थिरांक है, के लिए डेटा फिट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और बाइंडिंग की बंद दर का एक सीधा अनुमान (कश्मीर बंद) किया जा सकता है एक पैरामीटर, जो संघ की दर की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्राप्त की.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1 ए और बी (बाएं) HP1, H1o (मध्य) और R1 ES कोशिकाओं में H1e (दाएं) के शो प्रतिनिधि FRAP घटता. 1A सादगी और स्पष्टता चित्रा के लिए किसी भी सामान्य और गणना से पहले एक एकल कोशिका के कच्चे डेटा से पता चलता है. पीले वक्र प्रक्षालित क्षेत्र से मेल खाती है है, बैंगनी वक्र गैर प्रक्षालित परमाणु क्षेत्र (जब प्रक्षालित क्षेत्र नगण्य है पूरे नाभिक सामान्य प्रयोजनों के लिए चुना जा सकता है है) के लिए मेल खाती है और लाल रेखा पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति, जो है से मेल खाती है है इस मामले में कम से कम. कार्यक्षेत्र तीर ब्लीच समय का प्रतिनिधित्व करता है. सामान्यीकृत और औसतन डेटा चित्रा 1B में दिखाया गया है. धीमी H1 (नीला) के HP1 (लाल) के साथ तुलना में वसूली पर ध्यान दें. इसके अलावा H1e संस्करण (गहरे नीले) H1o संस्करण (हल्के नीले रंग) की तुलना में धीमी है. मोबाइल और स्थिर भिन्न और ब्लीच गहराई HP1 के लिए संकेत कर रहे हैं.
चित्रा 2 (ए और बी शो प्रतिनिधि FRAP euchromatin तुलना घटताHP1 के (दाएं) R1 ES कोशिकाओं में heterochromatin के साथ) छोड़ दिया है. इसी तरह चित्रा 1, चित्रा 2A किसी एकल कक्ष के कच्चे डेटा से पता चलता है, पीले वक्र प्रक्षालित क्षेत्र से मेल खाती है है, बैंगनी वक्र गैर प्रक्षालित परमाणु क्षेत्र में मेल खाती है, और लाल रेखा पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति से मेल खाती है है. कार्यक्षेत्र तीर ब्लीच समय का प्रतिनिधित्व करता है. सामान्यीकृत और औसतन डेटा चित्रा 2B में दिखाया गया है. धीमी heterochromatin (गहरे लाल) के euchromatin (प्रकाश लाल) के साथ तुलना में वसूली पर ध्यान दें. मोबाइल और स्थिर भिन्न और ब्लीच गहराई euchromatin के लिए संकेत कर रहे हैं.
चित्रा 3. H1o R1 ES कोशिकाओं के एक ठेठ फ्लिप प्रयोग चित्रा 3A (कच्चे, संयुक्त राष्ट्र के सामान्यीकृत डेटा) और बी (normalized और औसतन डेटा) में दिखाया गया है. इस प्रयोग में बैंगनी वक्र गैर प्रक्षालित परमाणु क्षेत्र में मेल खाती है, हरे रंग की लाइन एक पड़ोसी सेल नाभिक से मेल खाती है है और लाल रेखा पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति से मेल खाती है है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
सबसे उपलब्ध तकनीकों के विपरीत, जो सेल आबादी या तय कोशिकाओं, FRAP प्रयोगों से शुद्ध chromatin शामिल chromatin जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन गतिशीलता में बदलाव का पालन करें. हम chromatin प्रोटीन गतिशीलता chromatin plasticity के लिए एक अच्छा संकेत हो पाया. हालांकि, क्योंकि यह fusing GFP के साथ ब्याज की जीन की आवश्यकता है, फ्लोरोसेंट टैग के अलावा प्रोटीन समारोह के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. इस प्रकार, FRAP के साथ आगे बढ़ने से पहले, संलयन प्रोटीन कड़ाई से यह सुनिश्चित करने के अपने मूल समकक्ष के रूप में एक ही गुण और समारोह है परीक्षण करना चाहिए. सोने के मानक के लिए एक पीटकर सेल लाइन में GFP-संलयन के साथ अंतर्जात प्रोटीन समारोह पूरक होगा. हालांकि, पीटकर सेल लाइनों हमेशा उपलब्ध नहीं हैं और कई मामलों में प्रोटीन के अभाव में एक स्पष्ट phenotype नहीं है. फिर भी, एक संलयन प्रोटीन subcellular वितरण, अपनी अभिव्यक्ति के स्तर, अपने बंधन भागीदारों परीक्षण, अंतर्जात के लिए उचित आंशिक प्रतिस्थापन सुनिश्चित प्रोटीन के साथ तुलना में सभी कर सकते हैं.
एक बार सत्यापित, GFP संलयन प्रोटीन ES कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया जाना चाहिए. हमने पाया है कि पारगमन ES कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह से काम करता है और अभिकर्मक क्षमता के 50% से अधिक प्राप्त है. क्षणिक अभिकर्मक सुविधाजनक है, क्योंकि यह सीधे प्रयोग के साथ आगे बढ़ने की अनुमति देता है, लेकिन स्थिर अभिकर्मक अक्सर बेहतर है, ब्याज की संलयन प्रोटीन की उपस्थिति में लंबी अवधि के कोशिकाओं के अस्तित्व को सुनिश्चित करने, और कम और एक समरूप अभिव्यक्ति के स्तर में जिसके परिणामस्वरूप. GFP टैग के साथ प्रोटीन लेबलिंग के अतिरिक्त तरीकों combineering 10 या GFP-फँसाने अंतर्जात जीन GFP / YFP 11 exons, 12 के साथ सीधे. उपयोग BACS में GFP जीन टैगिंग शामिल इन तरीकों में बेहतर कर रहे हैं, संलयन प्रोटीन के रूप में एक अंतर्जात प्रमोटर द्वारा संचालित है, लेकिन हमेशा उपलब्ध नहीं है. ES कोशिकाओं में BACS के अभिकर्मक संभव मानक अभिकर्मक तरीकों का उपयोग कर रहा है. अंत में, टैग chromatin प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों से ES कोशिकाओं को भी इस्तेमाल किया जा सकता है. अधिक बोझिल हालांकि, इस पद्धति जल्दी पारित होने की कोशिकाओं के उपयोग की अनुमति देता है, stably ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं है, जो स्थिर एकीकरण के शुद्ध चयन प्राप्त करने के दीर्घकालिक संवर्धन की आवश्यकता होती है के विपरीत है.
एक बार ब्याज की प्रोटीन का चयन किया गया है, GFP के साथ जुड़े हुए, सत्यापित और ES कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट, वहाँ कई आवश्यक स्थिति है कि एक सफल FRAP प्रयोग के लिए पूरा किया जाना चाहिए रहे हैं: पहला, फ्लोरोसेंट प्रक्षालित हो स्पष्ट रूप से detectable संकेत किसी भी पृष्ठभूमि से अधिक होना चाहिए संकेत, दूसरा, photobleaching तेजी से वसूली की वक्र के विश्लेषण के लिए पर्याप्त अस्थायी समाधान उपलब्ध कराने और वसूली के आधे समय के माप की अनुमति वसूली की अवधि के सापेक्ष होना चाहिए. इसलिए, लेजर विरंजन के लिए इस्तेमाल काफी शक्तिशाली करने के लिए इस की अनुमति होना चाहिए, तीसरे, निगरानी किरण कम तीव्रता के photobleaching को कम करना चाहिए. एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन, photobleaching क्षमताओं (जैसे Andor क्रांति प्रणाली के रूप में में) के साथ सुसज्जित, इसलिए इस उद्देश्य के लिए आदर्श है. अंत में, एक पर्यावरण समुचित विकास की स्थिति में कोशिकाओं रखने चैम्बर माइक्रोस्कोप पर स्थापित किया जाना चाहिए करने के लिए उचित सेल homeostasis सुनिश्चित.
एक प्रमुख सीमा है जब कोर histones का विश्लेषण है कि वे कसकर डीएनए के लिए बाध्य कर रहे हैं, और इसलिए, FRAP प्रयोगों में वे लगभग स्थिर दिखाई देते हैं. कोर histones की पूरी वसूली तक पहुँचने के लिए, FRAP घटता कई घंटे तक पहुँचने चाहिए. चूंकि ES कोशिकाओं संस्कृति में अत्यधिक मोबाइल हैं, यह अनिवार्य रूप से तकनीकी घंटे तक FRAP प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए असंभव है. इस से बचने के लिए, एक 10 मिनट FRAP प्रयोगों के लिए प्रदर्शन और गतिज व्यवहार मिनट से घंटों के लिए एक्सट्रपलेशन कर सकते हैं. कोर histones करने के लिए इसके विपरीत में, सबसे डीएनए बंधनकारी प्रोटीन तेजी से सहयोगी और chromatin से अलग कर देना, सेकंड के क्रम में 1 सबसे कम आधा जीवन में कई मिनट के परिणामस्वरूप. इस पत्र में हम दो डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन एच 1 और HP1, दोनों ES कोशिकाओं में गतिशील का अध्ययन किया है, अभी तक HP1 H1 (के रूप में चित्र 1 में दिखाया गया है) की तुलना में अधिक गतिशील है. ध्यान से, इन दोनों chromatin प्रोटीन कम euchromatin से heterochromatin में गतिशील हैं, इसलिए heterochromatin के photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली धीमी है (के रूप में चित्रा 2 में देखा). heterochromatin में धीमी वसूली की संभावना H1 और HP1 के लिए बाध्यकारी साइटों की एक उच्च एकाग्रता के रूप में अच्छी तरह से आणविक भीड़ को दर्शाता है.
योग करने के लिए, photobleaching प्रयोगों का मतलब है प्रदान करने के लिए जीवित कोशिकाओं में chromatin प्रोटीन की गतिशीलता का अध्ययन, chromatin plasticity को दर्शाती है, जो pluripotent कोशिकाओं में अतिशयोक्तिपूर्ण है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम Meshorer प्रयोगशाला के सदस्यों, खासकर Shai Melcer, आदि Alajem, Edupuganti रघु राम, बड़ी श्री Sailaja, अन्ना Mattout और अल्वा Biran महत्वपूर्ण टिप्पणियों के लिए और एक दैनिक आधार पर मुसीबत शूटिंग photobleaching प्रयोगों के लिए धन्यवाद. EM जोसेफ एच. और बेले आर ब्रौन लाइफ साइंसेज में वरिष्ठ व्याख्याता है और इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (943/09 ISF), इसराइल स्वास्थ्य मंत्रालय (6007) यूरोपीय संघ (IRG - 206,872 और 238,176) द्वारा समर्थित है, इसराइल कैंसर रिसर्च फाउंडेशन, हिब्रू विश्वविद्यालय और इसराइल Psychobiology संस्थान के आंतरिक अनुप्रयोगी चिकित्सा अनुदान.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| Gelatin | Merck & Co., Inc. | 1.04078 | |
| Opti-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 31985 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bio LLC | MIR2300 | |
| 8-well μ-Slides | ibidi | 80826 |
References
- Phair, R. D. Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins. Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).
- Meshorer, E. Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook. Girard, L. , Harvard Stem Cell Institute. Cambridge. (2008).
- Meshorer, E. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP. , Cold Spring Harbor Press. (2009).
- Dundr, M., Misteli, T. Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).
- Ellenberg, J. Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis. J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).
- Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus. Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).
- Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know. Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).
- Phair, R. D., Misteli, T. Kinetic modelling approaches to in vivo imaging. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).
- Poser, I. BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals. Nat Methods. 5, 409-415 (2008).
- Sigal, A. Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells. Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).
- Cohen, A. A. Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug. Science. 322, 1511-1516 (2008).
