胚性幹細胞を生体内でクロマチン蛋白質のダイナミクスを測定するアッセイ（FRAP＆FLIP）を光退色

Summary

我々は、光退色後蛍光回復（FRAP）や胚性幹（ES）細胞におけるクロマチン蛋白質の動態を監視する（FLIP）光退色で蛍光の損失を含む光退色の方法を説明します。クロマチン可塑性を研究する手段の一つであると考えられているクロマチン蛋白質のダイナミクスは、多能性細胞で強化されています。

Abstract

光退色後蛍光回復（FRAP）や光退色で蛍光損失（FLIP）が良好な空間分解能と時間分解能を持つ生体細胞内の蛋白質のダイナミクスの研究を可能にします。ここでは、FRAP及びマウス胚性幹（ES）細胞のH1とHP1、を含む、クロマチンタンパク質のFLIPアッセイを、実行する方法について説明します。 FRAP実験で、細胞は緑色蛍光タンパク質（GFP）またはその誘導体（YFP、CFP、チェリー、など）を融合させた目的のタンパク質で、どちらか一過性または安定的に、トランスフェクトされています。トランスフェクト、蛍光細胞では、強烈な焦点レーザービームは、興味の比較的小さい領域（ROI）を漂白剤。レーザーの波長は、融合に使用する蛍光蛋白質に応じて選択されます。レーザー光が不可逆的にROI内の分子の蛍光シグナルを漂白剤と、すぐに漂白以下、漂白地域における蛍光シグナルの回復 - 無漂白の分子と漂白分子の交換によって媒介は - タイムラプスイメージングを使用して監視されます。生成された蛍光回復曲線は、タンパク質の流動性に関する情報を提供しています。蛍光分子が不動であれば、何蛍光回復は観察されません。補完的なアプローチでは、光退色における蛍光損失（FLIP）は、レーザービームは、繰り返し同じ場所を漂白し、信号強度は、他の場所で蛍光を発する細胞で測定されます。 FLIPの実験では、したがって、信号の減衰ではなく、蛍光の回復を測定し、タンパク質の移動度と同様に細胞区画を行き来し蛋白質を決定するのに便利です。一時的な結合は、クロマチン関連タンパク質の一般的なプロパティです。各クロマチン蛋白質の主要な割合が定常状態での任意の時点でクロマチンにバインドされていますが、バインディングは一時的であり、ほとんどのクロマチンタンパク質は、秒の順番で滞留時間で、クロマチン上で高い離職率を持っている。これらのプロパティは、ゲノムの式¹に高い可塑性を発生させるために重要です。退色実験は、特にクロマチンタンパク質の動的な交換が（ヘテロクロマチンタンパク質1（HP1）、リンカーヒストンH1とコアヒストンを含む）以上であるES細胞、で、それゆえクロマチン構造蛋白質のGFP融合バージョンを使用してクロマチン可塑性を決定するために特に有用です。 ^2,3分化細胞に比べて。

Protocol

1。 ES細胞をめっき

T = 0時間
MEFのメッキ

1. コー​​トライブイメージングμ-スライド8ウェル（ibidi、ミュンヘン、ドイツ）ゼラチンまたはチャンバーカバーガラスで（ラボ- Tek社、ロチェスター、ニューヨーク州）とやガラス底培養皿で（マテック、アッシュランド、マサチューセッツ州）。 5〜30分放置し、遊離ゼラチンを離れて吸引除去する。
2. シード22000 MEFを/ウェルのDMEMを250μlの総容量で[10％ウシ胎児血清（FBS）を添加した]。細胞は組織培養インキュベーター（37℃、5％CO2）で成長することができます。

T = 6時間
ES細胞のメッキ

3. DMEMを吸引除去する。
4. ES細胞の培地250μlの総体積で15,000 R1細胞/ウェルでうまく被覆種子各MEFの[10％ESC -グレードウシ胎児血清（FBS）、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mMの非必​​須アミノ酸、0.1mMのβ-を添加したメルカプトエタノール、および1000 U / mlの白血病抑制因子（LIF）]、翌日30％〜50％コンフルエントに取得する。

2。 ES細胞のトランスフェクション

T = 24時間
一過性トランスフェクション

1. 250μL/ウェル、新鮮なES細胞のメディアのES細胞の培地を交換してください。
2. 1.5 mlの滅菌試験管に、100μlの無血清培地[のOpti - MEM（Gibco社）]、その後、直接無血清培地に10μlのトランジット- LT1トランスフェクション試薬（Mirus）を追加を追加。穏やかなピペッティングにより混和し、5〜20分間室温でインキュベートする。
3. 希薄化後のトランジット- LT1試薬に1.5μgのGFP融合プラスミドDNA（H1E、H1oまたはHP1）を追加します。穏やかなピペッティングにより混和し、15〜30分間室温でインキュベートする。
4. トランスフェクション混合物の13.5μl/ウェルを追加。さらに分散性を確保するためにμ-スライド8ウェル渦巻き。 24時間後には、新鮮なES細胞の培地を250μlと古いのES細胞培地を交換してください。

3。 FRAPやFLIPの実行

T = 48〜72時間

1. 実験は、任意の共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）で実行することができますが、通常のFRAP / FLIP実験で以来、多くの連続した​​画像が取得され、それが買収の速度を可能にしないし、その何を確実に​​回転するディスク共焦点顕微鏡を、使用することをお勧めします。漂白望ましくないサンプルは、最初の意図的な白化現象は、次の発生します。ここで、我々は、横河電機CSU - X回転するディスクのヘッドを、ディスク共焦点システム（www.Andor.comを）回転革命を使用することをお勧めします。このシステムは、ポイントスキャンシステムで特殊なFRAPPAモジュールを使用して、そして急速に回転するディスクを使用して画像を収集するためにバックライトを切り替えるには光退色に二重の能力を持っています。実験の光退色に使用する3最も一般的な蛍光タンパク質はGFP、YFPとチェリーです。 GFPまたはYFPが使用されている場合は、〜488 nmのレーザーが必要です。チェリーの場合は、〜560nmのレーザーを使用してください。すべてのケースでは、我々は固体レーザを使用することをお勧めします。自動ステージを持つことは有用ですが、必須ではありません。生きた細胞が撮像されているので、それは酸素、湿度、CO ₂と温度を制御する、（私たちはLIS、スイスからいずれかを使用）環境室を使用することが不可欠です。 FRAPは、イメージングが（通常10％の面積で、蛍光レベルが十分なとき）に必要な最小限のレーザーパワーで行われている間、最大レーザー強度を使用して実行されます。
   適切な波長の蛍光灯の光で細胞を観察し、60X油浸レンズを用いてGFPを発現する細胞を選択する。正しい細胞内分布を確認してください。時折、発現レベルが高すぎるときに、タンパク質の局在化は、核小体などの他の区画に"スピル"があります。このような細胞が選択されるべきではない。
2. 今イメージングプロトコルを設定します：ユークロマチンまたはヘテロクロマチン（要約GFP巣として表示）にし、退色前に退色3から5フレームを収集し、250から1000ミリ秒の間隔で、光退色後の90から120フレームを収集してください。H1E - GFP、1000 MS、H1oとHP1 - GFP、250ミリ秒（非常に動的な蛋白質は、短い間隔の時間を必要とする蛋白質のダイナミクスに応じてインターバル時間の変更、）。我々は通常、20〜40μseconds（1-2の繰り返し）のレーザーパルスで光退色に対して80〜100％のレーザー強度を使用しますが、これらの数値は、分析タンパク質と発現レベルに応じて変更することができます。退色が適切な場合、あなたはGFPの蛍光で"ブラックホール"を観察する必要があります。ブラックホールは徐々に蛍光次の回復と再充填されている。回転するディスクは1秒間に60前後の画像（良い蛍光強度を持つとする場合、単一のセルにズームイン）まで得ることができますが、我々は低画質と潜在的な増加光毒性に起因するような高速でシステムを使用することはお勧めしません。
3. FLIP実験では、別の撮像プロトコルを設定する：画像を収集中に同じ場所に漂白を繰り返し開始し、漂白の前に3から5フレームを収集する。 H1o - GFP、漂白のためのH1E - GFP、漂白剤ごとに5秒、毎2秒のため、とHP1 - GFP漂白剤毎に1秒のため。漂白剤D実験全体を通して何度も画像を収集する。
4. どちらの手法の場合、20〜30細胞にプロセスを繰り返します。統計上の目的のために、できれば別の日に、実験を3回以上繰り返す。均質な集団と正しい設定では、標準偏差は通常低い（<5％）。
   FRAPやFLIPの両方に対して、漂白領域の大きさや形状は、回復のダイナミクスに影響を与え、実験内で一定でなければなりません。また、つのセルを比較する場合、同一のプロトコルを使用する必要がありますし、細胞をパワーレーザーと他の条件は変動することがありますし、実験の結果に影響を及ぼす可能性があるため、同じ日に連続して分析する必要があります。

4。 FRAPやFLIPデータ解析

1. すべてのFRAPフレームが収集さで、ROI（投資収益率_B =漂白エリア）、背景領域（ROI _BG）で蛍光強度を測定し、前と漂白後の時間の関数としての無漂白の核領域（ROI _NB）。漂白地域はごくわずかであるときに全体の核は、正規化の目的のために選択することができます。
2. /（ROI _NB - ROI _BG） - （ROI _BG ROI _{B）/（pbROI B} - pbROI _{BG）/（pbROI NB} - pbROI _BG）、鉛は、事前に漂白意味：すべての時間ポイントの場合は、公式にしたがってデータを正規化する。事前に漂白剤の画像の場合は約1の値を取得する必要があります。漂白剤の後の最初のイメージは、ブリーチの深さが示されます。実際のブリーチ深さ値1から値を引く。すべてのセルと各実験から平均20から30のセルに対して繰り返します。
3. 収集されたすべてのFLIPのフレームで、（ROI _NB =無漂白面積、ROI _BG =バックグラウンド）無漂白核領域での蛍光強度、および背景領域を測定する。 FLIPデータの計算は、FRAPの曲線に似てのみ分析したROI（投資収益率_nbは ）計算に使用されていない実際の漂白地域、異なっている必要があります：（ROI _NB - ROI _{BG）/（pbROI NB} - pbROI _BG） 。それは正規化の目的のために隣接セル（ROI _N =隣接セル）を使用することも可能です：（ROI _NB - ROI _{BG）/（ROI N} - ROI _{BG）/（pbROI NB} - pbROI _{BG）/（pbROI N} - pbROI _BG ）。
   データの収集に続いて、それはコンピュータシミュレーションに実験データをフィットすることが可能です。これは良い近接、モバイル分数、不動小数と半値で、計算することができます。ここでは、FRAP解析の数学的および統計的側面 ​​を議論し、他の優れた出版物^4-9を参照されたいことはありません。漂白剤の深さが事前に漂白剤（100％）信号と漂白剤の後の最初のイメージとの間の距離（y軸上）を指し、モバイル割合は、漂白剤の深さとの間の距離（y軸上）を指し反応速度がプラトーに達する、と不動小数が復元された信号とプリ漂白剤（100％）の信号の間の距離（y軸上）（図1Bおよび2Bを参照）を参照している。復元された信号この分析を超えて、データに合わせて適切な数学モデルがあります。単一指数、方程式のための
   
   tは時間であるときは、1モバイル割合であり不動割合であり、kは_オフ解離定数であり、データに合わせて使用することができ、結合のオフ率の直接推定値（K _オフ ）することができます得だけでなく、会合速度を計算するために使用できるパラメータ、のために。

5。代表的な結果：

図1及びBは、R1 ES細胞では、HP1（左）の代表的なFRAP曲線を示すH1o（真ん中）とH1E（右）。簡単でわかりやすく図の場合は1Aは、いかなる正規化し、計算の前に単セルの生データを示しています。黄色の曲線は、漂白の領域に対応する、紫の曲線は、無漂白の核領域に相当する（漂白地域は核全体が正規化の目的のために選択することができる無視できる場合）、および赤の線は、バックグラウンドの蛍光に対応し、されているこの場合の最小限の。垂直方向の矢印は、漂白時間を表します。正規化と平均化されたデータは、図1Bに示されています。 HP1（赤）と比較してH1（青）の遅い回復に注意してください。また、H1Eバリアント（ダークブルー）はH1oバリアント（ライトブルー）よりも遅くなります。モバイルと不動の分画とブリーチの深さは、HP1のために示されている。

図2及びBは、ユークロマチンを比較する代表的なFRAP曲線を示す（R1 ES細胞におけるHP1のヘテロクロマチン（右）と）左。同様に図1を、図2Aは、単一セルの生データを示し、黄色の曲線は、漂白の領域に対応する、紫の曲線は、無漂白の核領域に相当し、赤の線は、バックグラウンドの蛍光に対応しています。垂直方向の矢印は、漂白時間を表します。正規化と平均化されたデータは、図2Bに示されています。ユークロマチン（明るい赤）と比較してヘテロクロマチン（暗赤色）の遅い回復に注意してください。モバイルと不動の分画とブリーチの深さは、ユークロマチンのために示されている。

図3。。 H1o R1 ES細胞の典型的なFLIPの実験は、図3A（生、非正規化データ）とB（正規化と平均化されたデータ）に示されています。この実験では紫色の曲線は、無漂白の核領域に対応する、緑色の線は隣接する細胞核に相当し、赤線は、バックグラウンドの蛍光に対応しています。

Discussion

細胞集団または固定化細胞、FRAP実験から精製されたクロマチンを含むほとんどの利用できる技術とは異なり、生きた細胞のクロマチン蛋白質のダイナミクスの変化に従ってください。我々はクロマチンの蛋白質のダイナミクスは、クロマチン可塑性の良い指標であることが判明。しかし、それは融合のGFPと目的の遺伝子を必要とするため、蛍光タグを追加するには、タンパク質の機能を妨げることができる。このように、前のFRAPを進めるために、融合タンパク質は、厳密には、そのネイティブ対応と同じプロパティと機能を持って確保するためにテストする必要があります。ゴールドスタンダードは、ノックアウト細胞株におけるGFP融合した内因性タンパク質の機能を補完することです。しかし、ノックアウト細胞株は、常に利用できるとは限りませんし、多くの場合、タンパク質の不在は、明確な表現型を持っていません。それにもかかわらず、人は適切な部分的な交換を保証するために内因性タンパク質と比較してすべての融合蛋白質の細胞内分布、その発現レベルは、その結合パートナーを、テストすることができます。

検証後、GFPの融合タンパク質は、ES細胞にトランスフェクションされている必要があります。我々は、トランジットはES細胞とうまく動作すると50％以上のトランスフェクション効率を達成することがわかった。それが直接実験を進めるが、安定なトランスフェクションが頻繁に優れている、興味の融合タンパク質の存在下で細胞の長期生存を確実に、そしてより低いと均一な発現レベルで生じることができるように一過性トランスフェクションは便利です。 GFPタグを持つタンパク質を標識の追加メソッドは、GFP / YFPのエクソン^11,12と直接combineering ¹⁰またはGFP -トラッピング内因性遺伝子を使用してBACSのGFP遺伝子のタギングが含まれています。融合タンパク質は内在性プロモーターによって駆動されるが、常に利用されていないとして、これらのメソッドは、好ましい。 ES細胞へのBACをのトランスフェクションは、標準的なトランスフェクション法を使用することが可能です。最後に、タグ付けされたクロマチンの蛋白質を発現するトランスジェニックマウスからのES細胞を使用することもできます。もっと面倒ですが、この方法では、安定した統合の純粋な選択を実現するために長期培養を必要とする安定にトランスフェクトされた細胞とは異なり、初期継代細胞の使用が可能になります。

目的のタンパク質がES細胞に検証し、トランスフェクション、GFPと融合し、選択されたら、成功FRAP実験のために満たす必要のあるいくつかの本質的な条件がある：最初に、漂白される蛍光シグナルは、どんな背景の上に明確に検出でなければならない信号、第二、退色は回復曲線の分析のための十分な時間分解能を提供し、回復のハーフタイムの測定を可能にするために回復の期間への迅速な相対パスでなければなりません。このため、漂白に使用されるレーザーは、これを許可するのに十分な強力なはずです、第三に、モニタリングのビームは、光退色最小限に抑えるために低強度である必要があります。退色の機能（例えばアンドール革命システムなど）を搭載した、回転するディスク共焦点顕微鏡は、したがって、この目的のために理想的です。最後に、適切な成長条件で細胞を維持する環境室は、適切な細胞の恒常性を確保するために、顕微鏡にインストールする必要があります。

コアヒストンを分析する主な制限は、それらがしっかりとDNAに結合していることであり、したがって、FRAP実験ではそれらはほとんど動かないが表示されます。コアヒストンの完全な回復を達成するために、FRAPの曲線は、いくつかの時間に到達する必要があります。 ES細胞が培養中の移動性が高いですので、それは時間の長FRAP実験を行うために本質的に技術的に不可能です。これを避けるためには、10分のFRAP実験まで行って、数分から数時間の速度論的挙動を推定することができます。ほとんどの¹の数分に数秒のために短い半減期で、その結果、コアヒストンとは対照的に、ほとんどのDNA結合タンパク質は急速に関連付けるとクロマチンから解離する。本稿では、2つのDNA結合タンパク質、H1とHP1、ES細胞のダイナミックな両方を学び、まだHP1はH1（図1に示すように）よりもダイナミックです。注目すべきは、これらのクロマチンタンパク質の両方がヘテロクロマチンの光退色後のため、蛍光の回復が（図2に示すように）遅いと、ユークロマチンよりもヘテロクロマチンの少ない動的です。ヘテロクロマチンの遅い回復可能性が高いH1とHP1の結合部位の濃度が高いだけでなく、分子クラウディングを反映している。

要約すると、退色の実験は、多能性細胞に誇張されているクロマチン可塑性を、反映して、生きた細胞でのクロマチン蛋白質のダイナミクスを研究する手段を提供します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D5671
Gelatin	Merck & Co., Inc.	1.04078
Opti-MEM	GIBCO, by Life Technologies	31985
TransIT-LT1	Mirus Bio LLC	MIR2300
8-well μ-Slides	ibidi	80826