Summary
In deze video, beschrijven we een methode voor het live-cell imaging van asymmetrisch te verdelen zintuig progenitor cellen en epidermale cellen in intacte
Abstract
Sinds de ontdekking van Green Fluorescent Protein (GFP), is er sprake van een revolutionaire verandering in het gebruik van live-cell imaging als een instrument voor het begrijpen van fundamentele biologische mechanismen. Opvallende vooruitgang is vooral duidelijk in Drosophila, waarvan een uitgebreide toolkit van mutanten en transgene lijnen biedt een handige model om evolutionair geconserveerd-ontwikkelings-en celbiologische mechanismen te bestuderen. Wij zijn geïnteresseerd in het begrijpen van de mechanismen die de controle lot van de cel specificatie in de volwassen perifere zenuwstelsel (PNS) in Drosophila. Haren die betrekking hebben op de kop, thorax, buik, benen en vleugels van de volwassen vlieg individuele mechanosensorische organen, en zijn bestudeerd als een modelsysteem voor het begrijpen van de mechanismen van de Notch-afhankelijke cel beslissingen over het lot. Zintuig precursor (SOP) cellen van het microchaetes (of kleine haren), zijn verdeeld over het epitheel van het popstadium thorax, en zijn opgegeven tijdens de eerste 12 uur na het begin van de verpopping. Na de specificatie van de SOP cellen beginnen te verdelen, scheiding van de lot van de cel determinant Numb aan een dochter cel tijdens de mitose. Gevoelloos functioneert als een cel-autonome remmer van de Notch signaalweg.
Hier tonen we een methode om eiwit dynamiek volgen in SOP cel en zijn nakomelingen in de intacte popstadium thorax met een combinatie van weefsel-specifieke Gal4 drivers en GFP-gelabelde fusie-eiwitten 1,2. Deze techniek heeft het voordeel ten opzichte van vaste weefsel of gekweekte explantaten omdat het ons toelaat het volgen van de gehele ontwikkeling van een orgaan van specificatie van de neurale voorloper van de groei en terminale differentiatie van het orgel. We kunnen dus direct correleren veranderingen in cel gedrag op veranderingen in de terminale differentiatie. Bovendien kunnen we de live-beeldvormende techniek te combineren met mozaïek analyse met een repressible cel marker (MARCM) systeem om de dynamiek van de gelabelde eiwitten te beoordelen in mitotische SOP onder mutant of wildtype omstandigheden. Met behulp van deze techniek, hebben wij en anderen geopenbaard nieuwe inzichten in de regulatie van asymmetrische celdeling en de controle van Notch signalering activering in SOP cellen (voorbeelden zijn referenties 1-6,7, 8).
Protocol
Discussion
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scotch double stick tape | |||
| Glass slide | |||
| 18mmX18mm coverslip | |||
| Forceps | |||
| Whatman paper | |||
| Silicone vacuum grease | Dow Corning | ||
| 5 ml syringe | |||
| Pipetter | |||
| Confocal or epifluorescence microscope |
References
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Roegiers, F., Younger-Shepherd, S., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Two types of asymmetric divisions in the Drosophila sensory organ precursor cell lineage. Nat Cell Biol. 3, 58-67 (2001).
- Bellaiche, Y., Gho, M., Kaltschmidt, J. A., Brand, A. H., Schweisguth, F. Frizzled regulates localization of cell-fate determinants and mitotic spindle rotation during asymmetric cell division. Nat Cell Biol. 3, 50-57 (2001).
- Emery, G., Knoblich, J. A.
- Roegiers, F., Younger-Shepherd, S., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Bazooka is required for localization of determinants and controlling proliferation in the sensory organ precursor cell lineage in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 14469-14474 (2001).
- Roegiers, F. Frequent unanticipated alleles of lethal giant larvae in Drosophila second chromosome stocks. Genetics. 182, 407-410 (2009).
- Tong, X. Numb independently antagonizes Sanpodo membrane targeting and Notch signaling in Drosophila sensory organ precursor cells. Mol Biol Cell. 21, 802-810 (2010).
- Jafar-Nejad, H. Sec15, a Component of the Exocyst, Promotes Notch Signaling during the Asymmetric Division of Drosophila Sensory Organ Precursors. Dev Cell. 9, 351-363 (2005).
- Karbowniczek, M. The evolutionarily conserved TSC/Rheb pathway activates Notch in tuberous sclerosis complex and Drosophila external sensory organ development. J Clin Invest. 120, 93-102 (2010).
- Coumailleau, F., Furthauer, M., Knoblich, J. A., Gonzalez-Gaitan, M. Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division. Nature. 458, 1051-1055 (2009).
- Emery, G. Asymmetric rab11 endosomes regulate delta recycling and specify cell fate in the Drosophila nervous system. Cell. 122, 763-773 (2005).
- Justice, N., Roegiers, F., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Lethal giant larvae acts together with numb in notch inhibition and cell fate specification in the Drosophila adult sensory organ precursor lineage. Curr Biol. 13, 778-783 (2003).
