Summary
I denna video beskriver vi en metod för levande cell imaging av asymmetriskt dela sensoriska celler orgel stamceller och epidermala celler i intakta
Abstract
Sedan upptäckten av grönt fluorescerande protein (GFP), har det skett en revolutionerande förändring i användningen av live-cell imaging som ett redskap för att förstå grundläggande biologiska mekanismer. Striking Framstegen har varit särskilt tydlig i Drosophila, vars omfattande verktygslåda av mutanter och transgena linjer ger en bekväm modell för att studera evolutionärt-bevarad utvecklings-och cellbiologiska mekanismer. Vi är intresserade av att förstå de mekanismer som styr cellens öde specifikation i den vuxna perifera nervsystemet (PNS) i Drosophila. Svinborst som täcker huvudet, bröstkorgen, buken, benen och vingarna av den vuxna flugan är individuella mechanosensory organ, och har studerats som modellsystem för att förstå mekanismerna bakom Notch-beroende beslut cells öde. Sinnesorgan föregångare (SOP) cellerna i microchaetes (eller små borst), distribueras i hela epitelet i PUPP-thorax, och anges under de första 12 timmarna efter debuten av pupariation. Efter specifikation, SOP celler börjar dela sig segregerande determinanten cellen öde Numb till en dottercell under mitosen. Numb fungerar som en cell-autonoma hämmare av Notch signalväg.
Här visar vi en metod för att följa protein dynamik i SOP cellen och dess avkomma inom intakt PUPP-thorax med en kombination av vävnad-specifika Gal4 drivrutiner och GFP-märkta proteiner fusion 1,2. Denna teknik har den fördelen framför fixerat eller odlade explants eftersom det tillåter oss att följa hela utvecklingen av ett organ från specifikation av neurala föregångare till tillväxt och terminal differentiering av orgeln. Vi kan därför direkt korrelerar förändringar i cellens beteende förändringar i terminal differentiering. Dessutom kan vi kombinera de lever bildteknik med mosaik analys med en repressible cell markör (MARCM) för att bedöma dynamiken i taggade proteiner i mitotiska SOP i muterad eller wildtype förhållanden. Med denna teknik har vi och andra avslöjade nya insikter i reglering av asymmetrisk celldelning och kontroll av Notch signalering aktivering i SOP celler (exempel referenser 1-6,7, 8).
Protocol
Discussion
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scotch double stick tape | |||
| Glass slide | |||
| 18mmX18mm coverslip | |||
| Forceps | |||
| Whatman paper | |||
| Silicone vacuum grease | Dow Corning | ||
| 5 ml syringe | |||
| Pipetter | |||
| Confocal or epifluorescence microscope |
References
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Roegiers, F., Younger-Shepherd, S., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Two types of asymmetric divisions in the Drosophila sensory organ precursor cell lineage. Nat Cell Biol. 3, 58-67 (2001).
- Bellaiche, Y., Gho, M., Kaltschmidt, J. A., Brand, A. H., Schweisguth, F. Frizzled regulates localization of cell-fate determinants and mitotic spindle rotation during asymmetric cell division. Nat Cell Biol. 3, 50-57 (2001).
- Emery, G., Knoblich, J. A.
- Roegiers, F., Younger-Shepherd, S., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Bazooka is required for localization of determinants and controlling proliferation in the sensory organ precursor cell lineage in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 14469-14474 (2001).
- Roegiers, F. Frequent unanticipated alleles of lethal giant larvae in Drosophila second chromosome stocks. Genetics. 182, 407-410 (2009).
- Tong, X. Numb independently antagonizes Sanpodo membrane targeting and Notch signaling in Drosophila sensory organ precursor cells. Mol Biol Cell. 21, 802-810 (2010).
- Jafar-Nejad, H. Sec15, a Component of the Exocyst, Promotes Notch Signaling during the Asymmetric Division of Drosophila Sensory Organ Precursors. Dev Cell. 9, 351-363 (2005).
- Karbowniczek, M. The evolutionarily conserved TSC/Rheb pathway activates Notch in tuberous sclerosis complex and Drosophila external sensory organ development. J Clin Invest. 120, 93-102 (2010).
- Coumailleau, F., Furthauer, M., Knoblich, J. A., Gonzalez-Gaitan, M. Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division. Nature. 458, 1051-1055 (2009).
- Emery, G. Asymmetric rab11 endosomes regulate delta recycling and specify cell fate in the Drosophila nervous system. Cell. 122, 763-773 (2005).
- Justice, N., Roegiers, F., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Lethal giant larvae acts together with numb in notch inhibition and cell fate specification in the Drosophila adult sensory organ precursor lineage. Curr Biol. 13, 778-783 (2003).
