A Simple Opknoping Drop Cultuur van de Cel Protocol voor het genereren van 3D-sferoïden

Summary

Beschrijven we een eenvoudige, snelle methode van het genereren van 3D weefsel-achtige sferoïden en hun potentiële toepassing op verschillen in de cel-cel interacties te kwantificeren.

Abstract

Studies van cel-cel cohesie en cel-substraat adhesie hebben in het verleden zijn uitgevoerd op monolaagculturen aanhanger van stijve substraten. Cellen in een weefsel, maar zijn meestal verpakt in een dicht op elkaar gepakte massa weefsel waarbij de cellen intieme verbindingen tot stand met de vele bijna-buren en met de extracellulaire matrix componenten. Dienovereenkomstig, de chemische milieu en fysieke krachten ervaren door cellen in een 3D-weefsel zijn fundamenteel anders dan die ervaren door cellen gekweekt in monolaag cultuur. Dit is aangetoond dat duidelijk invloed cellulaire morfologie en signalering. Verschillende methoden zijn ontwikkeld om 3D-celculturen waaronder inkapseling van de cellen in collageen gels ¹ of in biomateriaal steigers ² te genereren. Dergelijke methoden, hoewel nuttig, niet herhalen het intieme direct cel-cel adhesie architectuur gevonden in de normale weefsels. Integendeel, zij nauwer bij benadering cultuur-systemen waarin de afzonderlijke cellen zijn losjes verspreid in een 3D-meshwork van ECM-producten. We beschrijven hier een eenvoudige methode waarin cellen zijn geplaatst in opknoping druppel cultuur en geïncubeerd onder fysiologische omstandigheden totdat ze vormen echte 3D-sferoïden waarin de cellen zijn in direct contact met elkaar en met de extracellulaire matrix componenten. De methode vereist geen speciale apparatuur en kan worden aangepast aan de toevoeging van een biologisch middel in zeer kleine hoeveelheden die mogelijk van belang zijn in het ontrafelen van effecten op cel-cel of cel-ECM interacties te nemen. De methode kan ook worden gebruikt om de co-cultuur twee (of meer) verschillende cel populaties om zo de rol van cel-cel of een cel-ECM interacties in het specificeren van ruimtelijke relaties tussen de cellen toe te lichten. Cel-cel cohesie en cel-adhesie ECM zijn de hoekstenen van de studies van de embryonale ontwikkeling, tumor-stromale cel interactie in kwaadaardige invasie, wondgenezing, en voor toepassingen op tissue engineering. Deze eenvoudige methode zal een middel van het genereren van weefsel-achtige cellulaire aggregaten voor het meten van de biomechanische eigenschappen of voor moleculaire en biochemische analyse in een fysiologisch relevante model.

Protocol

1. De voorbereiding van een enkele celsuspensie

1. Hechtende celkweken moeten worden gekweekt tot 90% confluentie, dient waarna monolagen twee keer gespoeld met PBS. Na het aftappen goed, voeg 2 ml (voor 100 mm platen) van 0,05% trypsine-1 mM EDTA, en incubeer bij 37 ° C tot cellen los te maken. Stop trypsinisatie door toevoeging van 2 ml van compleet medium en voorzichtig gebruik van een 5 ml pipet op het mengsel vermaal tot de cellen in suspensie. Overdracht cellen om een ​​15 ml conische buis.
2. Voeg 40 pi van een 10 mg / ml DNase voorraad en incubeer gedurende 5 minuten bij RT. Vortex kort en centrifugeer op 200 xg gedurende 5 minuten.
3. Gooi supernatans en was pellet met 1 ml volledige weefselkweek medium. Herhalen, dan resuspendeer cellen in 2 ml van volledige weefselkweek medium.
4. Tel de cellen met behulp van een hemacytometer, of geautomatiseerde celgetalmeter en aan te passen concentratie 2,5 x 10 ⁶ cellen / ml. Voor deze demonstratie een BioRad TC 10 geautomatiseerde cel tegen te gaan werd gebruikt.

2. Vorming van Opknoping Drops.

1. Verwijder het deksel van een 60 mm weefselkweek schotel en plaats 5 ml van PBS op de bodem van de schotel. Deze zal fungeren als een hydratatie kamer.
2. Keer de deksel en gebruik een 20 ul pipet tot 10 pl druppels op de bodem van het deksel storting. Zorg ervoor dat de druppels zo genoeg van elkaar geplaatst, dat niet aanraken. Het is mogelijk om plaats minstens 20 druppels per schotel.
3. Omgekeerde het deksel op de PBS-gevulde onderste kamer en incubeer bij 37 ° C / 5% CO ₂ / 95% luchtvochtigheid, toezicht op het dagelijks druppels en incubeer totdat cel platen of aggregaten hebben gevormd. Een stereo microscoop kan worden gebruikt om de totale formatie te beoordelen.
4. Eenmaal vellen vorm, kunnen ze worden overgebracht naar ronde bodem glas shaker kolven met 3 ml van compleet medium en geïncubeerd in een schuddend waterbad bij 37 ° C en 5% CO ₂ tot sferoïden te vormen.

3. Opmerkingen

1. Afhankelijk van de celgrootte, kan de concentratie moet up-of naar beneden worden aangepast.
2. Cellen kunnen worden gekleurd met membraan intercalerende fluorescente kleurstoffen voorafgaand aan de opknoping druppelvorming.
3. Twee verschillende soorten cellen kunnen verschillend worden gekleurd en gemengd in een 1:1 (of andere) verhouding voorafgaand aan de vorming van druppels opknoping. Deze kunnen kanker en stromale cellen, embryonale weefsels, of cellen genetisch gemanipuleerd om specifieke lijm handtekeningen.
4. Cellen kunnen worden losgemaakt uit weefselkweek gerechten met 0,05% trypsine / 2 mM calcium cadherine functie te behouden.
5. Afhankelijk van het experiment, kan papierformaten wordt gewaardeerd, of aggregaten kunnen worden gebruikt voor mechanische tests of andere biochemische of moleculaire analyse.

4. Representatieve resultaten:

Blad of sferoïde formatie treedt meestal op binnen 24 uur maar kan langer duren afhankelijk van het celtype. Figuur 1 geeft beelden die na 18 uur incubatie van onbehandelde prostaatkanker MAT-LyLu (MLL) cellen in opknoping druppel cultuur (Figuur 1A) of cellen die werden behandeld met 25 micrometer MEK-inhibitor PD98059. Merk op dat Meki behandeling resulteert in een duidelijke verdichting van de cel vel. Verdichting kan worden gekwantificeerd door het meten van de grootte van 10-20 (of meer) opknoping daalt en het vergelijken van gemiddelde grootte tussen de behandelingsgroepen. We meestal analyseren van beelden met behulp van ImageJ software door drempelmethode elk beeld dan het omzetten van afbeeldingen naar binaire modus, waarna passen we analyse van deeltjes op het totale beeld gebied in pixels te onthullen. Dit kan vervolgens eenvoudig worden geconverteerd naar vierkante micron. Figuur 2 geeft een maat voor de vergelijking onbehandelde en Meki-behandelde MLL cellen. Zoals opgemerkt, Meki behandeling aanzienlijk vermindert papierformaat in vergelijking met Student's t-test (p <0,0001). Voor deze vergelijking werden 10 aggregaten voor elk van de onbehandelde en behandelde cellen gemeten. Figuur 3 geeft een kuiken embryonale lever sferoïde gevormd na 24 uur in opknoping druppel cultuur en 2 dagen in een shaker bad.

De opknoping druppel test kan ook worden aangepast om meer dan een type cel te onthullen van de ruimtelijke positionering aangenomen te nemen. Zo kan bijvoorbeeld chick embryonale levercellen worden geïsoleerd, gekleurd met een fluorescente membraan-intercalerende kleurstof en gemengd met chick embryonale hartcellen die zijn gekleurd met een verschillende fluorescerende marker. Figuur 4A toont aan dat in plaats van de resterende vermengd, lever en het hart cellen hebben de neiging om "sort-out" van een ander en neemt een bol-in-een-sfeer configuratie waarin het hart cellen zijn omgeven door levercellen. Deze configuratie kan worden verklaard door verschillen in de intercellulaire adhesie tussen de lever en het hart-cellen. Dit concept is gecodificeerd in de Differential Adhesion Hypothese die is gebruikt om de cellen uit te leggen sorteergedrag tussen embryonale kiemlaag weefsel voor amfibieën ³ en ⁴ teleost embryo's, voor de eilandjes van Langerhans cel organisatie ⁵ en voor celsortering tussen twee celpopulaties identieke in elk opzicht anders dan voor de expressie niveaus van hetzelfde type cadherine ⁽⁶ en figuur 4B). Dit resultaat is vooral van belang voor het aantonen van hoe technisch een simpel verschil in hechting tussen celpopulaties kan resulteren in de vorming van organen structuur, bijvoorbeeld, een ^vijf eilandjes van Langerhans.

Figuur 1. Beelden van cellen geïncubeerd in opknoping druppel cultuur voor 18 uur, hetzij in de afwezigheid (A) of aanwezigheid (B) van 25 micrometer van het MEK inhibitor PD98059. Beelden werden vastgelegd met behulp van een Nikon Eclipse TE 300 epifluorescentiemicroscoop en een Photometrics CoolSNAP ES digitale camera.

Figuur 2. Kwantificering van Meki-geïnduceerde verdichting van de rat prostaatkanker MLL cellen. Opknoping druppel culturen van onbehandeld en Meki-behandelde MLL-cellen werden geïncubeerd gedurende 18 uur waarna de totale grootte werd bepaald zoals hierboven beschreven. Statistische analyse van de totale omvang werd door de Student's t-test. Het sterretje is een statistisch significant verschil in de totale omvang (P <0,0001) tussen onbehandelde en Meki-behandelde cellen en suggereert dat Meki-behandeling resulteert in een aanzienlijk kleiner en compacter aggregaten.

Figuur 3. Een sferoïde gevormd door incuberen chick embryonale levercellen in opknoping druppel cultuur voor 18 uur daarna in een incubator / schudden bad voor 48 uur. Deze opname werd gemaakt met een Nikon SMZ800 stereo microscoop en een zwarte Sony CCD-camera.

Figuur 4. Opknoping druppel cultuur onthult sorteren-out gedrag tussen verschillende celtypen. In paneel A, werden chick embryonale levercellen gekleurd met PKH-2 membraan intercalerende kleurstof en gemengd in gelijke delen met PKH-26-lood chick embryonale hartcellen. In paneel B, werden twee N-cadherine-getransfecteerde L cel klonen (LN4 en LN2a) uitdrukken en N-cad op hun oppervlakken in de verhouding van 2.4:1, ook gekleurd met de fluorescerende kleurstoffen membraan intercalerende PKH-2 en PKH-26 , (Sigma-Aldrich), gemengd in gelijke delen en gekweekt zoals opknoping daalt ^7. Na 18 uur in cultuur, werden overgebracht naar cel lakens schudden kolven en geïncubeerd voor een ander 48 uur. Aggregaten werden vastgesteld in 2% paraformaldehyde in fosfaat-gebufferde zoutoplossing en bekeken worden met een BioRad MRC600 scanning laser confocale microscoop systeem gekoppeld aan een Nikon Optiphot-2 microscoop. Optische secties van zowel groene en rode kanalen werden verzameld en een Silicon Graphix Crimson VGX werkstation uitgerust met Vital Images Voxel Bekijk Ultra imaging software werd gebruikt om valse kleuren toe te wijzen aan beide kanalen en om de beelden samen te voegen, waaruit de gegenereerde anatomische configuraties. (A) confocale optische gedeelte door middel van een aggregaat te tonen omsingeling van het hart cellen (hier in een pseudo-kleur geel) door de lever cellen in pseudocolor blauw (uit ^8). (B) Confocale optische gedeelte door middel van een aggregaat te tonen omsingeling van hoge N-cadherine expressie brengende cellen (groen) door die uitdrukken lagere niveaus van N-cadherine (rood) (vanaf ^6).

Discussion

Studies hebben aangetoond dat het kweken van cellen in een drie-dimensionale context (3D) verschillende cellulaire morfologie en signalering in vergelijking met een stijve tweedimensionale (2D) cultuur-systeem ⁹ produceert. Bijvoorbeeld, fibroblast-bevolkte collageen gels aan te tonen dat fibroblasten morfologie in 3D is zeer verschillend van die in 2D ^10,11. Op dezelfde manier kan 3D-cultuur induceren weefsel-specifieke differentiatie van mamma-epitheliale cellen. 3D-cultuur systemen zijn gebruikt om onderscheid te maken tussen normale en kwaadaardige cellen en is aangetoond dat de terugkeer van de getransformeerde cellen normaal fenotype te ondersteunen, met de juiste prikkel ^12,13. Juiste weefsel architectuur is ook aangetoond dat van vitaal belang voor de lange afstand homeostase, onderdrukking van apoptose, en het onderhoud van de gedifferentieerde fenotype van CID-9 borstklier epitheelcellen ^14. Meercellige resistentie tegen geneesmiddelen in de muis EMT-6 mammacarcinoom cellen is ook aangetoond dat tot uiting komen in vitro alleen als cellen werden gekweekt in 3-D configuraties en niet in de conventionele monolaagculturen ^15. Deze en andere gegevens hebben geleid tot het voorstel dat 'de eenheid van de functie in hogere organismen is noch het genoom, noch de cel alleen, maar het weefsel zelf ^"16. Veel andere methoden voor het genereren van 3D-sferoïden bestaan, waaronder het gebruik van gesimuleerde micrograviteit incubators ^17, en micro-gevormde niet-klevende hydrogels ^18,19. In tegenstelling tot deze methoden echter de hier beschreven methode vereist geen speciale apparatuur of reagentia en is daarom zeer kosteneffectief. De eenvoud van de methode minimaliseert potentiële valkuilen. Bijgevolg is de leercurve is relatief ondiep en de methode kan gemakkelijk worden beheerst binnen een relatief korte periode van tijd.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
automatic cell counter	Bio-Rad	TC10
shaking water bath with CO2 gable cover	Labline Instruments	3540