Summary
Мы опишем простой, быстрый способ получения 3D-ткани, как сфероиды и их потенциальное использование количественного различия в межклеточных взаимодействиях.
Abstract
Исследование межклеточных сплоченности и клеточного субстрата адгезии исторически были выполнены на однослойной культуре приверженцем жестких носителях. Клетки в тканях, однако, как правило, заключенная в плотно упакованной массы тканей, при котором клетки создания интимной связи со многими почти соседями и компонентов внеклеточного матрикса. Соответственно, среда химические и физические силы испытывают клетки в 3D ткани принципиально иные, чем те испытывают клеток, выращенных в монослой культуры. Это было показано, что заметно влияние клеточной морфологии и сигнализации. Несколько методов было разработано для создания 3D-культур клеток, включая инкапсуляции клеток в коллаген гели 1 или в биоматериала лесов 2. Такие методы, в то время как полезные, не повторять интимных прямой межклеточной адгезии архитектуры находится в нормальных тканях. Скорее, они больше приближены системы культуры, в которой отдельные клетки слабо диспергированы в 3D-сети из продуктов ECM. Здесь мы опишем простой метод, при котором клетки помещаются в висячей капли культуры и инкубировали в физиологических условиях, пока они не образуют истинные 3D сфероидов, в которой клетки находятся в непосредственном контакте друг с другом и с компонентов внеклеточного матрикса. Метод не требует специального оборудования и может быть адаптирован для включения добавления каких-либо биологического агента в очень малых количествах, которые могут представлять интерес для выяснения влияния на межклеточной или клеточной ECM взаимодействия. Метод может быть также использована для совместного культуры двух (или более) различных клеточных популяций, чтобы выяснить роль межклеточных или клеточно-ECM взаимодействий в определении пространственных отношений между ячейками. Cell-ячейки сплоченности и клеточной адгезии ECM являются краеугольным камнем исследования эмбрионального развития, опухоли стромальных клеток взаимодействия в злокачественные вторжения, заживление ран, а также для приложений к тканевой инженерии. Этот простой метод обеспечит средство получения ткани, как сотовые заполнители для измерения биомеханических свойств или молекулярные и биохимические анализы в физиологически соответствующие модели.
Protocol
1. Подготовка суспензии отдельных клеток
- Приверженец клеточных культур следует выращивать до 90% слияния, после чего монослоев должны быть дважды промывали PBS. После слива, добавьте 2 мл (на 100 мм пластины) в размере 0,05% трипсина-1 мМ ЭДТА, и инкубировать при температуре 37 ° С до клетки отделяются. Стоп трипсинизации путем добавления 2 мл полной среды и аккуратно использовать 5 мл пипеткой растирают смесь, пока клетки в суспензии. Передача клетки 15 мл коническую трубку.
- Добавить 40 мкл 10 мг / мл ДНКазы акций и инкубировать 5 минут при комнатной температуре. Кратко Vortex и центрифуги при 200 XG течение 5 минут.
- Удалите супернатант и мыть гранул с 1 мл полной среды культуры ткани. Повторите, то ресуспендирования клеток в 2 мл полной среды культуры ткани.
- Граф клеток с использованием hemacytometer, или автоматизированные счетчик клеток и регулировать концентрацию до 2,5 х 10 6 клеток / мл. Для демонстрации BioRad TC10 автоматизированных счетчик клетка была использована.
2. Формирование висячие капли.
- Снимите крышку с 60 мм ткани блюдо культуры и место 5 мл PBS в нижней части блюда. Это будет действовать как гидратации камеры.
- Обратить крышкой и использовать 20 мкл пипетки внести 10 мкл капли на нижней части крышки. Убедитесь в том, что капли находятся друг от друга достаточно, чтобы не трогать. Можно разместить не менее 20 капель на блюдо.
- Обратить крышку на PBS заполненные дно камеры и инкубировать при температуре 37 ° C / 5% CO 2 / 95% влажности, монитор капель в день и инкубировать пока либо ячейке листа или агрегатов сформировали. Стерео микроскоп может быть использован для оценки образования агрегатов.
- После листах форме, они могут быть переданы с круглым дном стеклянные колбы, содержащие шейкер 3 мл полной среды и инкубировали в пожимая водяной бане при температуре 37 ° С и 5% CO 2, пока форма сфероидов.
3. Примечания
- В зависимости от размера ячейки, концентрации, возможно, должны быть скорректированы вверх или вниз.
- Клетки могут быть окрашены с мембраной интеркалирующих флуоресцентных красителей до висячей капли образования.
- Два разных типах клеток может быть дифференциально окрашенных и смешивают в 1:1 (или другой) соотношение до образования висят капли. Это может быть рак и стромальных клеток, эмбриональные ткани, или клетки генетически иметь специальные подписи клея.
- Клетки могут быть отторгнуты от блюда культуре ткани использованием 0,05% трипсина / 2 мМ кальция, чтобы сохранить кадгерина функции.
- В зависимости от эксперимента, размеры листов могут быть измерены, или агрегаты могут быть использованы для механических испытаний или для биохимических или молекулярного анализа.
4. Представитель Результаты:
Лист или сфероида образование обычно происходит в течение 24 часов, но может занять больше времени в зависимости от типа клеток. Рисунок 1 представляет изображений, полученных после 18 часов инкубации необработанной рака простаты MAT-LyLu (МРОТ) клетки в висячей капли культуры (рис. 1А) или клеток, обработанных 25 мкм МЭК ингибитор PD98059. Обратите внимание, что лечение Меки, происходит значительное уплотнение ячейки листа. Уплотнение может быть определена количественно, измеряя размер 10-20 (или более) висят капли и сравнения средний размер между группами лечения. Мы обычно анализируют изображения с помощью программного обеспечения ImageJ порога каждого изображения, то конвертации изображений в двоичном режиме, после чего мы применяем анализа частиц выявить общую площадь изображения в пикселях. Это может быть легко преобразован в квадратных микрон. Рисунок 2 представляет размер сравнения для необработанной и Меки-обработанных клеток МЛЛ. Как уже отмечалось, Меки лечение значительно снижает размер листа по сравнению по Стьюдента-теста (р <0,0001). Для такого сравнения, 10 агрегатов для каждого из необработанных и обработанных клеток были измерены. Рисунок 3 представляет куриных эмбриональных сфероида печени образуется после 24 часов в висячей капли культуры и 2 дня в ванне шейкер.
Висячей капли анализ также может быть изменен, чтобы включать более одного типа клеток выявить пространственное позиционирование принят. Например, куриных эмбриональных клеток печени может быть изолированным, окрашенные люминесцентными мембраны интеркалирующих красителя и смешивается с куриных эмбриональных клеток сердца, которые были окрашивали различные флуоресцентного маркера. Рисунок 4а показывает, что вместо того, оставшиеся перемешаны, печень и клетки сердца, как правило, "род-аут" от одного-другого и принять сфере-в-сфере конфигурации, в которой клетки сердца окружены клетками печени. Эта конфигурация может быть объяснено различиями в межклеточной адгезии между печенью и сердцем клеток. Это понятие закреплено в гипотезе Дифференциальная Адгезия которая была использована для объяснения сортировки клеток поведении между эмбриональной ткани слой зародыша амфибии для 3 и 4 костистых эмбрионов, поджелудочной островковых клеток организации 5, и для сортировки клеток двух клеточных популяций идентичных яя всех отношениях, кроме выражения уровней одного и того же типа кадгерина (6 и рис 4В). Этот результат особенно важен для демонстрации того, как инженерное простая разница в адгезии между популяции клеток может привести к поколению структуры органа, например, островков поджелудочной железы 5.
Рисунок 1. Изображения клетки инкубировали в висячей капли культуры в течение 18 часов или в отсутствие (А) или наличия (Б) от 25 мкм ингибитор МЕК PD98059. Изображения были получены с помощью Nikon Eclipse TE 300 epifluorescence микроскопа и Фотометрические CoolSnap ES цифровой камеры.
Рисунок 2. Количественная оценка Меки вызванной уплотнением крыс рак предстательной железы клетки МЛЛ. Висячей капли культур неочищенных и Меки-обработанных клеток MLL инкубировали в течение 18 часов, после чего совокупный размер определяли, как описано выше. Статистический анализ совокупности размер был по Стьюдента-тест. Звездочка представляет статистически значимой разницы в совокупный размер (P <0,0001) между необработанной и Меки-обработанных клеток и предполагает, что Меки обращения приводит к значительно меньше и более компактных агрегатов.
Рисунок 3. Сфероида формируется путем инкубации куриных эмбриональных клеток печени у висячей капли культуры в течение 18 часов, то в инкубаторе / встряхивания бане в течение 48 часов. Это изображение было получены с помощью микроскопа Nikon SMZ800 стерео и Sony Черный ПЗС-камера.
Рисунок 4. Висячей капли культуры показывает, разборки между поведением различных типов клеток. В панели, куриных эмбриональных клеток печени окрашивали PKH-2 мембраны интеркалирующих красителя и смешать в равных пропорциях с PKH-26 окрашенных куриных эмбриональных клеток сердца. В панели B, два N-кадгерина-L трансфицированных клеточных клонов (LN4 и LN2a), выражая N-хама на их поверхности в соотношении 2.4:1, также окрашенные флуоресцентными красителями мембран интеркалирующих PKH-2 и PKH-26 , (Sigma-Aldrich), смешанных в равных пропорциях и культивировали, как висит капель 7. После 18 часов в культуре, сотовые листы были переданы в встряхивания колб и выдерживают в течение еще 48 часов. Агрегаты были зафиксированы в 2% параформальдегида в фосфатно-солевого буфера и рассматриваться с BioRad MRC600 лазерной сканирующей конфокальной микроскопии системе прилагается к Nikon Optiphot-2 микроскопом. Оптический разделы как из зеленого и красного каналов были собраны и Силиконовой Graphix Багровый VGX станции оснащены Vital Images Voxel Посмотреть Ультра изображений программное обеспечение используется для назначения ложные цвета для каждого канала и слиться изображений, выявление анатомических конфигураций, порождаемых. () конфокальной оптической части по совокупности демонстрирует охват клетки сердца (здесь, в псевдо-желтого цвета) на клетки печени, в псевдо-синий (из 8). (B) конфокальной оптической части через совокупный охват демонстрирует высокие N-кадгерина клеток, экспрессирующих (зеленого цвета) на те, которые выражают более низкие уровни N-кадгерина (красная) (из 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Исследования показали, что культивирование клеток в трехмерном контексте (3D) производит различные клеточной морфологии и сигнализации по сравнению с жесткой двумерной (2D) системе культуры 9. Например, фибробластов населенных гели коллагена показывают, что фибробласты морфологии в 3D существенно отличается от наблюдаемого в 2D 10,11. Кроме того, 3D-культура может вызвать тканеспецифические дифференциации молочных эпителиальных клеток. 3D-систем культуры были использованы различать нормальных и злокачественных клеток и, как было показано для поддержки возврат трансформированных клеток к нормальному фенотипу, с учетом соответствующего стимула 12,13. Правильная архитектура ткани также было показано, что жизненно важное значение для дальней гомеостаза, подавление апоптоза, и содержание дифференцированного фенотипа CID-9 молочных эпителиальных клеток 14. Многоклеточные лекарственной устойчивости мыши EMT-6 клеток молочной железы рак также было показано, что проявляется в пробирке, только если клетки были выращены в 3-D конфигурации, а не в обычных однослойных культур 15. Эти и другие данные привели к предложению, что "единица функции у высших организмов является ни генома, ни клетка в покое, но самой ткани" 16. Многие другие методы генерации 3D сфероидов существуют, в том числе использования моделируемой невесомости инкубаторы 17, и микро-формованные неклейкой гидрогелей 18,19. В отличие от этих методов, однако, метод, описанный здесь, не требует специального оборудования и реактивов и, следовательно, высокую экономическую эффективность. Простота метода минимизирует потенциальные подводные камни. Следовательно, кривая обучения является относительно небольшой и метод может быть легко освоен в течение относительно короткого периода времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Автор хотел бы поблагодарить д-ра Dongxuan Цзя для оказания технической помощи. Некоторые из изображений, входящих в этой статье, были в сотрудничестве с доктором Малкольмом С. Штейнберг, кафедра молекулярной биологии Принстонского университета. Автор также хотел бы поблагодарить Министерство обороны рака простаты Программа исследований (гранты PC-030 482 и PC-991 552) и NCI / NIH (грант R01CA118755) за их щедрую поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic cell counter | Bio-Rad | TC10 | |
| shaking water bath with CO2 gable cover | Labline Instruments | 3540 |
References
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).
- Davis, G. S., Phillips, H. M., Steinberg, M. S. Germ-layer surface tensions and "tissue affinities" in Rana pipiens gastrulae: quantitative measurements. Dev Biol. 192, 630-644 (1997).
- Schotz, E. M. Quantitative differences in tissue surface tension influence zebrafish germ layer positioning. HFSP J. 2, 42-56 (2008).
- Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Dev Dyn. 236, 2039-2049 (2007).
- Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Dev Biol. 278, 255-263 (2005).
- Li, D. Expression of the casein kinase 2 subunits in Chinese hamster ovary and 3T3 L1 cells provides information on the role of the enzyme in cell proliferation and the cell cycle. J Biol Chem. 274, 32988-32996 (1999).
- Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122, 1611-1620 (1996).
- Wendt, D., Riboldi, S. A., Cioffi, M., Martin, I. Potential and bottlenecks of bioreactors in 3D cell culture and tissue manufacturing. Adv Mater. 21, 3352-3367 (2009).
- Berry, D. P., Harding, K. G., Stanton, M. R., Jasani, B., Ehrlich, H. P. Human wound contraction: collagen organization, fibroblasts, and myofibroblasts. Plast Reconstr Surg. 102, 124-131 (1998).
- Grinnell, F. Fibroblast biology in three-dimensional collagen matrices. Trends Cell Biol. 13, 264-269 (2003).
- Wang, F. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14821-14826 (1998).
- Weaver, V. M. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
- Boudreau, N., Werb, Z., Bissell, M. J. Suppression of apoptosis by basement membrane requires three- dimensional tissue organization and withdrawal from the cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 3509-3513 (1996).
- Croix, B., Rak, J. W., Kapitain, S., Sheehan, C., Graham, C. H., Kerbel, R. S. Reversal by hyaluronidase of adhesion-dependent multicellular drug resistance in mammary carcinoma cells. J. Nat. Cancer Inst. 88, 1285-1296 (1996).
- Bissell, M. J. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast. Cancer Res. 59, 1757-1763 (1999).
- Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 523-534 (2009).
- Napolitano, A. P. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43, 494-496 (2007).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103, 655-663 (2009).
