Un protocole simple Hanging culture cellulaire pour la production chute de sphéroïdes 3D

Summary

Nous décrivons une méthode simple et rapide de générer des tissus 3D-like sphéroïdes et leur application potentielle de quantifier les différences dans les interactions cellule-cellule.

Abstract

Les études sur la cohésion de cellule à cellule et cellule-substrat d'adhérence ont historiquement été réalisées sur des cultures en monocouche adhérente sur des substrats rigides. Cellules dans un tissu, cependant, sont généralement enfermés dans une masse de tissu très dense dans lequel les cellules d'établir des connexions intimes avec de nombreux quasi-voisins et avec des composants de la matrice extracellulaire. En conséquence, le milieu chimique et les forces physiques vécus par les cellules dans un tissu 3D sont fondamentalement différentes de celles vécues par les cellules en culture monocouche. Cela a été démontré que l'impact nettement la morphologie cellulaire et de signalisation. Plusieurs méthodes ont été conçues pour générer des cultures cellulaires en 3D, y compris l'encapsulation des cellules dans ^une des gels de collagène ou biomatériau échafaudages ^2. Ces méthodes, bien qu'utile, ne pas rappeler les intimes architecture Direct adhérence cellule-cellule dans les tissus normaux. Plutôt, ils plus étroitement les systèmes de culture approximative dans laquelle des cellules individuelles sont vaguement dispersés au sein d'un maillage 3D de produits d'ECM. Ici, nous décrivons une méthode simple dans lequel les cellules sont placées dans la culture suspendus baisse et incubés dans des conditions physiologiques jusqu'à ce qu'ils forment vraie sphéroïdes 3D dans lequel les cellules sont en contact direct avec eux et avec les composants de la matrice extracellulaire. La méthode ne nécessite pas d'équipement spécialisé et peut être adapté pour inclure plus d'un agent biologique en très petites quantités qui peuvent être d'intérêt à élucider les effets sur la cellule-cellule ou cellule-ECM interaction. La méthode peut également être utilisé pour la co-culture de deux (ou plusieurs) des populations de cellules différentes, afin d'élucider le rôle des interactions cellule-cellule ou cellule-ECM en précisant les relations spatiales entre les cellules. Cellule-cellule et cellule-cohésion ECM d'adhésion sont les pierres angulaires d'études du développement, de l'interaction de cellules embryonnaires de tumeurs stromales malignes dans l'invasion, la cicatrisation, et pour les applications d'ingénierie tissulaire. Cette méthode simple vous fournir un moyen de générer des tissus tels que les agrégats cellulaires pour la mesure des propriétés biomécaniques ou pour l'analyse moléculaire et biochimique dans un modèle physiologiquement pertinents.

Protocol

1. Préparation d'une suspension cellulaire unique

1. Cultures de cellules adhérentes doivent être cultivés à 90% de confluence, les monocouches quoi doivent être rincés deux fois avec du PBS. Après la vidange bien, ajoutez 2 ml (pour les plaques de 100 mm) de 0,05% de trypsine-1 mM EDTA, et incuber à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules se détacher. Arrêtez trypsinisation en ajoutant 2 ml de milieu complet et doucement l'utilisation d'une pipette 5 ml de triturer le mélange jusqu'à cellules sont en suspension. Transfert des cellules dans un tube de 15 ml conique.
2. Ajouter 40 ul d'un stock de 10 mg / ml de DNAse et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. Brièvement au vortex et centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes.
3. Rejeter le surnageant et laver culot avec 1 ml de culture de tissus milieu complet. Répéter, puis remettre les cellules en 2 ml de milieu de culture de tissu complet.
4. Compter les cellules en utilisant un hématimètre, ou un compteur de cellules automatisé et d'ajuster la concentration de 2,5 x 10 ⁶ cellules / ml. Pour cette démonstration, une BioRad TC10 compteur de cellules automatisé a été utilisé.

2. Formation de gouttes suspendues.

1. Retirez le couvercle d'une boîte de culture de tissu de 60 mm et placer 5 ml de PBS dans le fond du plat. Ceci agira comme une chambre de l'hydratation.
2. Inverser le couvercle et l'utilisation d'une pipette 20 ul de déposer 10 gouttes ul sur le fond du couvercle. Assurez-vous que des gouttes sont placées suffisamment éloignés afin de ne pas toucher. Il est possible de placer au moins 20 gouttes par plat.
3. Inverser le couvercle sur le PBS-remplie chambre inférieure et incuber à 37 ° C CO / 5% ₂ / 95% d'humidité, de surveiller l'gouttes par jour et incuber jusqu'au feuilles cellule soit ou agrégats sont formés. Un microscope stéréo peut être utilisé pour évaluer la formation d'agrégats.
4. Une fois la forme des feuilles, ils peuvent être transférés à fond rond en verre Agitateur flacons contenant 3 ml de milieu complet et incubés dans un bain d'eau agité à 37 ° C et 5% de CO ₂ jusqu'à la formation de sphéroïdes.

3. Remarques

1. Selon la taille des cellules, la concentration peut être ajusté en amont ou vers le bas.
2. Les cellules peuvent être colorées avec membrane intercalant des colorants fluorescents avant la formation de goutte suspendue.
3. Deux différents types de cellules peuvent être différemment colorés et mélangés dans un rapport de 1:1 (ou autre) Le ratio avant la formation de gouttes suspendues. Elles peuvent être des cellules cancéreuses et stromales, les tissus embryonnaires, ou cellules génétiquement modifiées pour avoir des signatures adhésive spécifique.
4. Les cellules peuvent se détacher de boîtes de culture tissulaire en utilisant la trypsine 0,05% / 2 mM de calcium afin de préserver la fonction cadhérine.
5. Selon l'expérience, la taille des feuilles peut être mesurée, ou des agrégats peuvent être utilisés pour les essais mécaniques ou pour l'analyse biochimique ou moléculaire.

4. Les résultats représentatifs:

Fiche ou formation sphéroïde se produit généralement dans les 24 heures, mais peut prendre plus de temps selon le type de cellule. La figure 1 représente des images capturées après 18 heures d'incubation du cancer de la prostate non traité MAT-LyLu (MLL), les cellules de culture en suspension de chute (figure 1A) ou des cellules traitées avec l'inhibiteur de MEK 25 um PD98059. Notez que les résultats du traitement Meki dans un compactage marqués de la feuille de cellule. Le compactage peut être quantifiée en mesurant la taille de 10-20 (ou plus) des gouttes pendantes et en comparant la taille moyenne entre les groupes de traitement. Nous généralement d'analyser les images en utilisant le logiciel ImageJ par seuillage chaque image puis en convertissant les images en mode binaire, après quoi nous appliquons l'analyse des particules de révéler la zone de l'image totale, en pixels. Cela peut ensuite être facilement converti en microns carrés. La figure 2 représente une comparaison de taille pour les cellules non traitées et MLL Meki-traitée. Comme indiqué, le traitement réduit significativement la taille Meki feuille par rapport à t de Student-test (p <0,0001). Pour cette comparaison, 10 pour chacune des agrégats de cellules traitées et non traitées ont été mesurés. La figure 3 représente un sphéroïde de foie de poulet embryonnaire formé après 24 heures dans la culture suspendus chute et 2 jours dans un bain de shaker.

Le dosage de goutte suspendue peut également être modifié pour inclure plus d'un type cellulaire pour révéler le positionnement spatial adopté. Par exemple, les cellules de poulet foie embryonnaire peut être isolé, colorées avec une lampe fluorescente à membrane intercalant colorant et mélangé avec des cellules chiches coeur embryonnaire qui ont été colorés avec un marqueur fluorescent différent. Montre la figure 4A que plutôt que de rester entremêlés, les cellules du foie et le cœur ont tendance à «trier-out" d'un autre-et à adopter une sphère-dans-un-sphère configuration dans laquelle les cellules cardiaques sont enveloppés par des cellules du foie. Cette configuration peut être expliquée par les différences dans l'adhésion intercellulaire entre les cellules du foie et du cœur. Ce concept est codifié dans l'hypothèse adhésion différentielle qui a été utilisé pour expliquer le comportement de tri cellulaire entre les tissus embryonnaires pour la couche germe d'amphibiens et de poissons téléostéens ^{3 4} embryons, pour l'organisation des cellules des îlots pancréatiques ⁵ et pour la cellule de tri entre deux populations de cellules identiques in ce qui concerne tous les autres que pour les niveaux d'expression de même type de cadhérine ⁽⁶ et la figure 4B). Ce résultat est particulièrement important pour démontrer comment une simple différence d'ingénierie de l'adhérence entre les populations cellulaires peut entraîner la génération de la structure des organes, par exemple, un îlot ⁵ pancréatiques.

Figure 1. Images de cellules incubées en culture en suspension déposer pendant 18 heures soit en l'absence (A) ou en présence (B) de 25 microns de l'inhibiteur de MEK PD98059. Les images ont été capturées à l'aide d'un Nikon Eclipse TE 300 microscope à épifluorescence et un Photometrics Coolsnap ES appareil photo numérique.

Figure 2. Quantification de Meki-induites chez le rat compactage des cellules de la prostate MLL cancer. Cultures de cellules goutte suspendue MLL non traitées et traitées à Meki ont été incubées pendant 18 heures, après quoi la taille des agrégats a été déterminée comme décrit ci-dessus. L'analyse statistique de la taille des agrégats a été par la Student t-test. L'astérisque représente une différence statistiquement significative de la taille globale (p <0,0001) entre les cellules non traitées et traitées à Meki et suggère que les résultats de Meki-traitement dans les agrégats nettement plus petit et plus compact.

Figure 3. Un sphéroïde formé en incubant les cellules du foie de poulet embryonnaire en culture en suspension déposer pendant 18 heures puis dans un incubateur / secousses de bain pour 48 heures. Cette image a été capturée à l'aide d'un microscope Nikon stéréo SMZ800 et une caméra CCD Sony Noire.

Figure 4. Hanging culture déposer révèle le tri-out comportement entre différents types cellulaires. Dans la partie A, les cellules de poulet foie embryonnaire ont été colorées avec un colorant intercalant PKH-2 membrane et mélangés dans des proportions égales avec PKH-26 cellules chiches tachés coeur embryonnaire. Dans le panel B, deux N-cadhérine-clones cellulaires transfectées L (LN4 et LN2a), exprimant la N-CAD à leurs surfaces dans le ratio de 2,4:1, ont également été colorés avec des colorants fluorescents membrane intercalant PKH-2 et PKH-26 (Sigma-Aldrich), mélangés dans des proportions égales et cultivées comme des gouttes pendantes ^7. Après 18 heures de culture, des feuilles de cellules ont été transférées à des flacons secouant et incubé pendant 48 heures. Agrégats ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 2% dans un tampon phosphate salin et visualisées avec un système laser BioRad MRC600 microscope confocal à balayage attaché à un Nikon Optiphot-2 microscope. Sections optiques des deux canaux vert et rouge ont été recueillis et une Silicon Graphix Crimson VGX poste de travail équipé de Vital Images Voxel Ultra View logiciel d'imagerie a été utilisée pour attribuer des fausses couleurs pour les deux canaux et de fusionner les images, révélant des configurations anatomiques générées (A). confocale section optique grâce à un enveloppement global démontrant des cellules cardiaques (ici en jaune pseudo-couleurs) par les cellules du foie dans pseudocolor bleu (de ^8). (B) l'article optique confocal par un enveloppement global démontrant de haute N-cadhérine des cellules exprimant (vert) par ceux qui expriment des niveaux inférieurs de la N-cadhérine (en rouge) (à partir de ^6).

Discussion

Des études ont montré que les cellules en culture dans un contexte en trois dimensions (3D) produit distinctes morphologie cellulaire et de signalisation par rapport à une démarche rigide en deux dimensions du système de culture (2D) ^9. Par exemple, des gels de collagène des fibroblastes peuplées de démontrer que la morphologie des fibroblastes en 3D est tout à fait distincte de celle observée en 2D ^10,11. De même, la culture 3D peut induire tissu-spécifique de différenciation des cellules épithéliales mammaires. Systèmes de culture en 3D ont été utilisés pour distinguer les cellules normales et malignes et ont été montrés pour soutenir la réversion des cellules transformées à phénotype normal, étant donné le stimulus approprié ^12,13. Architecture tissulaire correcte a également été montré pour être vital pour longue portée l'homéostasie, la suppression de l'apoptose, et le maintien du phénotype différencié du CID-9 cellules épithéliales mammaires ^14. Résistance aux médicaments chez la souris multicellulaires EMT-6 cellules de carcinome mammaire a aussi été démontré à se manifester in vitro, que si les cellules ont été cultivées dans des configurations en 3-D et non pas dans des cultures monocouches conventionnelles ^15. Ces données et d'autres ont conduit à la proposition que «l'unité de la fonction dans les organismes supérieurs n'est ni le génome de la cellule, ni seul, mais le tissu lui-même» ^16. Beaucoup d'autres méthodes de génération de sphéroïdes 3D existent, y compris l'utilisation d'incubateurs microgravité simulée ^17, et les micro-moulé non-adhésive hydrogels ^18,19. Contrairement à ces méthodes cependant, la méthode décrite ici ne nécessite aucun équipement spécialisé ou de réactifs et est donc très rentable. La simplicité de la méthode minimise les écueils potentiels. Par conséquent, la courbe d'apprentissage est relativement peu profond et la méthode peut être maîtrisé facilement dans une période de temps relativement court.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
automatic cell counter	Bio-Rad	TC10
shaking water bath with CO2 gable cover	Labline Instruments	3540