Summary
细胞介导的淋巴细胞毒（CML）的检测，可用于测试自身反应性的反应，并在体外研究细胞死亡的机制。然而，利用活细胞共聚焦显微成像技术与荧光染料，类型和细胞死亡以及途径利用动力学可以更详细的研究。
Abstract
1型糖尿病（T1D）是一种T细胞介导的自身免疫性疾病。期间发病，患者会逐渐变得更insulinopenic胰岛素生产丢失，想必这胰腺β细胞的杀伤性T细胞的结果。 T1D发展过程的了解β细胞死亡的机制提供见解产生本病的有效的治疗方法。细胞介导的淋巴细胞毒（CML）的检测在历史上所使用的放射性核素铬51（51铬）标记的靶细胞。这些目标都暴露在效应细胞和靶细胞释放51班读淋巴细胞介导的细胞死亡的迹象。抑制剂细胞死亡减少51铬释放的结果。
作为效应细胞，激活自身反应性克隆人口的CD8 +细胞毒性T淋巴细胞（CTL）从鼠标股票转基因为AI4 T细胞受体（TCR）的α和β链隔离。 AI4激活T细胞，51铬标记的目标为16小时的NIT细胞共同培养， 释放 51铬记录来计算具体的裂解
在许多重要的生理活动，如能源生产，调节信号转导，细胞凋亡，线粒体参与。 β细胞线粒体功能的改变在T1D发展的研究是一个新的领域的研究。利用线粒体膜电位的染料甲基若丹明甲酯（TMRM）和共聚焦显微镜活细胞成像，我们监测随着时间的推移在β细胞系NIT - 1的线粒体膜电位。对于影像学检查，效应AI4 T细胞标记的荧光核染色染料Picogreen。 NIT - 1细胞和T细胞共培养，在墓室玻璃罩，并安装在一个活细胞室配备显微镜阶段，控制在37 ° C，5％的CO 2和加湿。在这些实验中的图像，每个群集为400分钟，每3分钟。
超过400分钟的过程中，我们观察到的NIT - 1细胞AI4 T细胞连接集群中的线粒体膜电位的耗散。在NIT - 1细胞共培养与MHC的同步控制实验MIS匹配的人体淋巴细胞Jurkat细胞，线粒体膜电位保持完好。这种技术可以用来观察在受到攻击的细胞毒性淋巴细胞，细胞因子或其他细胞毒性试剂的细胞线粒体膜电位的实时变化。
Protocol
1。细胞的制备
- 靶细胞培养：鼠标β细胞NIT - 1和NIT - 4的文化，是先前描述的1,2，补充10％胎牛血清，0.02％BSA，非必需氨基酸，15MM的HEPES，16.5毫米的DMEM Glocose和青霉素/链霉素。 51铬标签，种子细胞在平底96以及在5X10 4细胞培养板/ 200μL培养液中。对于显微镜的实验中，8以及实验室德二腔玻璃罩的种子细胞在5X10每室 4 500μL培养基，并允许增长前48小时使用的细胞毒性实验。
- 控制T细胞株培养：为阴性对照使用的Jurkat细胞株（ATCC，CD3 +人体淋巴细胞的细胞系） 。 10％胎牛血清的RPMI1640培养Jurkat细胞，2毫米L -谷氨酰胺，1.5 g / L的碳酸氢钠，10毫米的HEPES和1.0 mm丙酮酸钠。
2。收集和效应自身反应性CD8 + T细胞的活化
NOD.Cg RAG1 tm1Mom TG（TcraAI4）1Dvs/DvsJ [NOD AI4a NOD.Cg RAG1 tm1Mom TG（TcrbAI4）1Dvs/DvsJ的NOD AI4b]杰克逊实验室（ME）的巴尔港，均购自孕育在我们的鼠标设施。从对NOD AI4a交配F1杂交后代的NOD - AI4b [NOD - AI4a / B]发展在3-5周龄糖尿病。所有小鼠饲养在无特定病原体设施和有关机构的动物护理和使用委员会批准。
- 安乐死3-4周龄的NOD - AI4a / B小鼠使用的CO 2。
- 收集从小鼠脾脏。安乐死的老鼠准备用乙醇喷雾和开放手术引擎盖下。脾脏被删除，并立即在冰冷的HBSS缓冲。
- 收集脾细胞，用7 mL玻璃匀浆。两到三个脾脏每5毫升冷的HBSS，并与7 mL的玻璃匀浆器匀浆。匀浆是收集和离心5分钟，在1200RPM 4℃用一个Sorvall RT7 +离心机。收集细胞沉淀。
- 删除红血细胞，用低渗溶液处理。颗粒5毫升低渗冰5分钟的解决方案/脾治疗，然后加入同等体积的HBSS中瓦解。离心收集细胞，就像上面，并在50毫升的HBSS悬浮。穿过细胞过滤器悬浮细胞，计数TrypanBlue染色使用一个血球。
- 激活细胞。使用3天的文化与0.1微米AI4模拟表位（氨基酸序列YFIENYLEL）和25 U / mL的IL - 2的RPMI1640悬浮在5X10 6 / mL和激活细胞补充含10％胎牛血清，2毫米L -谷氨酰胺，1.5克/ L碳酸氢钠，10毫米的HEPES和1.0 mm丙酮酸钠。
（3）51铬释放法研究慢性粒细胞白血病
- 标签靶细胞：新增51班的目标细胞在1μCi/孔和文化3个小时，并用培养液洗3次。
- 暂停效应细胞在RPMI 1640培养基，在步骤2.5中提到，使最终体积，每孔加入200μL。
- 最后一次洗涤后标记的靶细胞，添加活化的效应细胞的目标，在预期的效应细胞培养目标（E：T）比值。我们通常用E：T比例为0.4:1，1:1，2:1，5:1，10:1，20:1和50:1。
- 添加新鲜修改RPMI 1640培养基（见第2.5步）6井的靶细胞，作为一种自发的裂解控制。
- 效应和靶细胞共培养16小时。
- 在6x50毫米石灰玻璃管，收集上清
- 加入100微升2％的SDS和几次轻轻吹打裂解细胞。
- 另一套6x50毫米石灰玻璃管收集细胞裂解液。
- 洗井一次，用干净的H 2 O，并添加洗细胞裂解液管。
- 上清和细胞裂解液，使用伽玛计数器计数。
- 具体裂解计算如下：
4。细胞染色活细胞成像
其中最常用的线粒体膜电位的染料，TMRM展品至少线粒体毒性。因此，我们选择TMRM这些活细胞成像研究。
- 准备在DMSO和储存在-20 ° C 40毫米股票TMRM解决方案请[25 NM]酚红的DMEM的解决方案，所有的NIT - 1细胞培养1补充新鲜的工作。
- 目标NIT - 1细胞TMRM 25纳米30分钟染色在37 ° C。
- 替换含有5 nm的TMRM保持均衡分布的染料4新媒体的媒体。
- 共激活T细胞效应AI4使用hematocytometer。
- 染色与1μL/毫升Picogreen为激活效应T细胞AI45分钟，在室温下洗无酚红培养基的3倍。
5。评估T淋巴细胞介导的β细胞死亡，使用活细胞成像
- 山染的NIT细胞阶段的Zeiss LSM 510共聚焦显微镜腔玻璃罩。删除一个dremmel和气体消毒etheline氧化腔玻璃标签。舞台配备了一个活细胞成像室温度控制在37 ° C和5％的CO 2与水分。
- 新增激活和染色的T细胞在不同的E指定钱伯斯：T比率。
- 新增染Jurkat细胞相同数量的控制室内。
6。获取活细胞图像
该显微镜是配备机动阶段，让我们在不同的地点，在实验过程中，自动从相同或不同的商会多次获得图像。
- 使用63X油物镜，在共300帧，每个位置，每3分钟的间隔图像。
- 检测TMRM染色使用的排放量565-619 nm的激发波长543纳米的长度和过滤器设置
- 检测Picogreen染色使用的激发为488 nm和过滤器设置为排放量500-630纳米。使用蔡司LSM的软件创建的视频。
7。出版的视频转换
- 使用蔡司LSM的软件，创建未压缩的AVI格式的电影文件。
- 要发布的格式转换成视频，视频导入到软件包斐济（ http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji ），ImageJ（ http://rsb.info。 nih.gov / IJ / ）分配，使用基因位点（Bioformats插件http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats ）。
- 调整亮度和对比度设置，以平衡的绿色和红色信号和帧速率设置为2帧/秒，使用“动画选项”菜单。
- 作物的视频512 x 512像素和出口为未压缩的AVI文件。
- 打开这个AVI文件在软件的QuickTime 7（苹果电脑，苹果CA），并在打开的视频文件格式H264/MPEG-4的压缩和出口在1200 KBS /秒。
8。代表性的成果：
- 一个代表51班慢性粒细胞白血病检测结果。图1显示了代表％具体裂解（Y轴）的效应增加了慢性粒细胞白血病检测结果：目标比例（X轴）增加。靶细胞免疫缺陷的NOD孤立的小岛小学RAG1 - / -小鼠和标有 51班。 NOD.AI4α/β的转基因小鼠的脾细胞的分离和激活在上述步骤2中所述。目标和效应，共同培养16小时。具体裂解百分比计算，在3.11以上步骤中所述。
- 两个有代表性的T细胞介导的β细胞线粒体膜电位耗散的结果（正面和负面的）。细胞染色和反应都记录在步骤4，第5和第6段所述，在第7步中创建的视频文件。视频1：小鼠β细胞株NIT - 1染色的线粒体膜电位染料TMRM（红）。激活，自身反应性CD8 + T细胞AI4（Picogreen染绿）共培养这些NIT - 1细胞在E：T比值为50:1。 NIT - 1细胞线粒体膜电位逐渐消退，在400分钟的持续时间，但只在AI4 T细胞相互作用的集群。视频2：作为一个对照实验中，NIT - 1细胞染色：TMRM和Picogreen一个E染色Jurkat细胞共培养T比值为50:1。 Jurkat细胞是人类的T细胞是MHC的不匹配的行。 NIT - 1细胞保持整个线粒体膜电位的整个持续时间400分钟的合作潜伏期。 Jurkat细胞没有交互NIT - 1集群，因此，不诱发杀人。
图1代表的慢性粒细胞白血病的结果从免疫缺陷NOD.Rag1 /孤立的靶细胞的主要胰岛- NOD.AI4α/β的转基因小鼠的脾细胞和小鼠。目标和效应，共同培养16小时。具体裂解百分比增加的效应：目标比例的增加。
视频1。小鼠β细胞株NIT - 1染色的线粒体膜电位染料TMRM（红）。激活自身反应性CD8 + T细胞AI4（Picogreen染绿）共培养这些NIT - 1细胞在E：T比值为50:1。 NIT - 1线粒体膜电位的耗散泰德逐渐在400分钟的时间，但只有在绿色AI4 T细胞相互作用的集群。点击这里观看视频。
视频2。NIT - 1细胞染色一样在视频1和联合培养Picogreen染人类T细胞株Jurkat描述。 NIT - 1细胞能够保持线粒体膜电位想到了400分钟的时间。 Jurkat细胞没有交互NIT - 1集群的，因此不会诱发杀人，点击这里观看视频。
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Discussion
细胞毒性T细胞介导的β细胞的死亡是主要的病理生理 T1D 5。允许我们使用51铬释放的慢性粒细胞白血病实验研究的效靶反应 6程度。然而，T细胞介导的β细胞死亡的详细过程和途径仍然不能完全理解。由于线粒体是β细胞功能和死亡7的关键，我们专注于线粒体的变化，在视觉慢性粒细胞白血病。线粒体膜电位的耗散是一个早在导致细胞凋亡 8的线粒体功能的变化和不可逆转的步骤。利用共聚焦显微镜观察活细胞成像，我们能够想象在与自身反应性T淋巴细胞的相互作用β细胞线粒体膜电位的耗散。这个实验中模仿至少部分T1D发展过程中的β细胞会发生什么。本实验的限制包括：加热插入配备我们的蔡司显微镜活细胞成像是专为3.5厘米的培养皿中，因此当使用8实验室德二腔玻璃罩（同时记录的处理和控制），处理上腔玻璃罩需要删除，以适应在显微镜插入。此外，因为加热插入一个35mm的培养皿中，设计时我们使用8实验室德二腔玻璃罩，我们中心的4口井。这种限制可以很容易地解决由蔡司专门设计实验室德二腔玻璃罩的加热插入安装。本次实验的可能的修改，包括使用基因荧光效应T细胞攻击的靶细胞，或测试信号转导通路的细胞因子或细胞间的相互作用。 T1D发病机制中的β细胞死亡是一个复杂的过程，涉及多种途径，包括但不限于，颗粒酶和穿孔9日 ，9中Fas / Fas配体， 细胞因子10。有caspases的荧光底物和颗粒酶B市面上的这些选择是可能的研究途径，并在β细胞死亡的事件序列。
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Disclosures
动物实验是由佛罗里达体制的动物护理和使用委员会大学规定的准则和法规的规定执行。
Acknowledgments
这项工作是由来自美国国立卫生DK074656和AI56374（CEM）研究院的资助，以及青少年糖尿病研究基金会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cr-51 | PerkinElmer, Inc. | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R&D Systems | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini Bio Products | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma-Aldrich | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6x50 mm Lime Glass | Fisher Scientific | 14-958-A | |
| Gamma Counter | PerkinElmer, Inc. | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher Scientific | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
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