Summary
셀 - 중재의 lymphocytotoxicity (CML) assays는 체외에서 autoreactive 반응 및 세포 사망의 학습 메커니즘을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 형광 염료, 타입 및 세포 죽음뿐만 아니라 활용 경로의 반응 속도론 살 세포 공촛점 미세한 이미징 기술을 사용하여 더 자세히 공부하실 수 있습니다.
Abstract
제 1 형 당뇨병 (T1D)는 T 세포 매개 면역 질환이다. 인슐린 생산이 분실로 pathogenesis 동안, 환자는 T 세포에 의해 췌장 베타 세포의 파괴에서 아마도이 결과는 점차적으로 더 insulinopenic됩니다. T1D의 개발 기간 동안 베타 세포 죽음의 메커니즘을 이해하는 것은이 질병에 대한 효과적인 치료를 생성하는 통찰력을 제공할 것입니다. 셀 - 중재 lymphocytotoxicity (CML) assays는 역사적으로 대상 세포를 레이블 radionuclide 크롬 51 (51 CR) 사용하고 있습니다. 이러한 목표는 다음 효과기 세포에 노출되고 대상 세포에서 51 피크의 릴리스는 림프구 - 중재 세포의 죽음은 표시대로 읽습니다. 51 피크의 감소 릴리스에서 세포 사망 결과의 억제제.
효과기 세포, 우리는 CD8의 활성화 autoreactive clonal 인구 + 알파 및 AI4 T 세포 수용체 (TCR)의 베타 체인 모두에 대해 마우스 재고 유전자 변형으로부터 격리 세포 독성 T의 lymphocytes (CTL)을 사용합니다. 활성 AI4 T 세포는 16 시간 동안 51 피크 표시 대상 NIT 세포와 공동 교양 있었다, 51 릴리스는 피크는 특정 용해를 계산하기 위해 기록된
Mitochondria 같은 에너지 생산, 전달 시그널링 규제 및 apoptosis 등 많은 중요한 생리 이벤트에 참여할 수 있습니다. T1D의 개발 기간 동안 베타 세포 mitochondrial 기능 변화의 연구는 연구의 소설 공간입니다. mitochondrial 막 잠재적인 염료 Rhodamine Tetramethyl 메틸 에스테르 (TMRM)와 공촛점 미세한 라이브 셀 이미징을 사용하여, 우리는 베타 세포 라인 NIT - 1에서 시간이 지남에 따라 mitochondrial 막 잠재력을 감시. 이미징 연구, 효과기 AI4 T 세포는 형광 염색법 핵 염색 Picogreen으로 표시되었습니다. NIT - 1 세포와 T 세포가 chambered coverglass 공동 교양과 라이브 셀 챔버가 장착된 현미경 무대에 장착된 37에 지배되었다 ° C 5 % CO 2, humidified와 함께. 이러한 실험을하는 동안 이미지는 각 클러스터의 400 분 동안 매 3 분 촬영했다.
400분의 과정 동안, 우리는 AI4 T 세포가 첨부되었습니다 NIT - 1 셀 클러스터의 mitochondrial 막 잠재력의 낭비를 관찰했다. NIT - 1 세포가 MHC와 함께 공동 교양 있던 동시 제어 실험에 잘못이 검색 인간 림프구 Jurkat 세포를 mitochondrial 멤브레인 가능성은 온전하게 남아 있어요. 이 기술은 세포 독성 lymphocytes, 크린 시토킨 또는 다른 세포 독성 시약의 공격을 받고 세포 mitochondrial 막 잠재력에 실시간으로 변경 사항을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
1. 세포의 준비
- 대상 세포 배양 : 마우스 베타 세포 라인, NIT - 1 NIT - 4의 문화는 10 % FBS, 0.02 %의 BSA, 비 필수 아미노산, 15mM HEPES, 16.5mM와 보충 DMEM에서 이전에 설명한 1,2되었습니다 Glocose 및 페니실린 / 스트렙토 마이신. 5X10 4 세포에서 평면 바닥 96 - 웰 문화 플레이트에 51 피크 라벨, 종자 세포 / 음 200 μl 문화 매체하십시오. 에 대한 현미경 실험, 500 μl 문화 매체 챔버 당 5x10 4 8 - 잘 랩 - 탁 II chambered coverglass의 씨앗 세포, 그리고 세포 독성 실험에 사용하기 전에 48 시간 성장할 수 있습니다.
- 제어 T 세포 라인 문화 : 부정적인 제어로 (ATCC, 인 경우에는 3 번 CD + 인간 림프구 세포주) Jurkat 세포주를 사용하십시오. RPMI1640의 문화 Jurkat 세포 10 % FBS와 보충 2 MM L - 글루타민, 1.5 g / L 나트륨 중탄산염, 10 MM의 HEPES 및 1.0 MM 나트륨 pyruvate.
2. 효과기 CD8 + T autoreactive 세포의 수집 및 활성화
NOD.Cg - Rag1 tm1Mom TG (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD - AI4a]와 NOD.Cg - Rag1 tm1Mom TG (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD - AI4b]는 잭슨 연구실 (바 하버, ME)에서 구입했다 저희 마우스 시설에서 자란. 와 NOD - AI4a의 matings에서 F1 잡종 자손 NOD - AI4b [NOD - AI4a / B] 시대의 3~5주에서 당뇨병을 개발합니다. 모든 생쥐는 무균 시설에서 보관되어 및 관련 기관의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
- CO 2를 사용하여 3~4주 오래된 NOD - AI4a / B 쥐를 안락사.
- 생쥐의 spleens를 수집합니다. Euthanized 생쥐는 에탄올 스프레이로 준비하고 수술 후드 아래에 열립니다. Spleens은 제거하고 즉시 얼음처럼 차가운 HBSS 버퍼에 넣어 있습니다.
- 7 ML 유리 균질 화기를 사용하여 비장 세포를 수집합니다. 두 세 spleens 각각 차가운 HBSS 5 ML 넣고 7 ML 유리 균질 화기로 균질하고 있습니다. Homogenate 4에서 5 분 동안 1200rpm에서 수집 및 centrifuged 있습니다 ° C Sorvall RT7 + 원심 분리기를 사용하여. 세포 펠렛을 수집하고 있습니다.
- hypotonic 솔루션 치료를 사용하여 적혈구를 제거합니다. 우박이 5 분 얼음 솔루션 / 비장 5 ML hypotonic로 처리되며, 다음 HBSS의 동일한 음량을 추가하여 무력화. 위에서, 원심 분리하여 세포를 수집, 50 ML HBSS에 resuspend. 셀 스트레이너를 통해 정지 세포를 통과하고 TrypanBlue의 얼룩과 hemocytometer를 사용하여 계산합니다.
- 세포를 활성화합니다. RPMI1640에서 0.1 μm의 AI4 mimotope (아미노산 서열 YFIENYLEL) 25 U / ML IL - 2와 3 일간의 문화를 사용하여 5x10 6 / ML 및 활성화에 Resuspend 세포 10 % FBS와 보충 2 MM L - 글루타민, 1.5 g / L 나트륨 중탄산염, 10 MM HEPES 및 1.0 MM 나트륨 pyruvate.
3. 51 피크 자료 분석은 CML를 검토
- 라벨 대상 세포 : 3 시간 μCi / 음과 문화 1 세포를 대상으로, 문화 매체로 3 번 씻어 51 피크를 추가합니다.
- 최종 볼륨이 각각 잘에 추가 있도록 단계 2.5에서 언급한로 RPMI 1640 배지에 효과기 세포를 일시 중지하면 200 μl 있습니다.
- 비율 : 표시 대상 세포의 최종 세척 후, (T E)를 대상으로 원하는 이펙터에서 대상 셀 문화 활성화 효과기 세포를 추가합니다. 0.4:1, 1시 1분, 2시 1분, 5시 1분, 10시 1분, 20시 1분과 50:1에서 T 비율 : 우리는 일반적으로 E를 사용합니다.
- 자연 용해 제어 역할을 타겟 세포 6 웰스 신선한 수정 RPMI 1640 매체 (단계 2.5 참조) 추가합니다.
- 16시간 공동 문화 효과기 및 대상 세포.
- 6x50 mm 라임 유리 튜브에 뜨는 수집
- 100μl 2% SDS를 추가하고 부드럽게 여러 번 pipetting하여 세포를 Lyse.
- 6x50 mm 라임 유리 튜브의 다른 집합에 세포 lysate를 수집합니다.
- 깨끗한 H 2 O로 한 우물을 세척하고 세포 lysate 튜브에 세척을 추가합니다.
- 감마 카운터를 사용하여 supernatants 및 세포 lysates 카운트.
- 다음과 같이 구체적인 용해를 계산 :
4. 라이브 셀 이미징에 대한 세포의 스테 이닝
가장 일반적으로 사용되는 mitochondrial 막 잠재적인 염료 중 TMRM는 최소한 mitochondrial 독성을 전시하고 있습니다. 따라서 3 이러한 라이브 셀 이미징 연구 TMRM을 선택합니다.
- -20 ° C.에 DMSO와 저장소에 40 MM 주식 TMRM 솔루션을 준비 [25 NM] NIT - 1 세포 배양 1 모든 보충제와 페놀 레드없는 DMEM에 신선한 작업 솔루션을 확인하십시오.
- 37 30 분 TMRM 25 NM과 목표 NIT - 1 세포를 얼룩 ° C.
- 염료 4 평형 분포를 유지하기 위해 TMRM 5 nm의를 포함하는 새로운 미디어로 미디어를 교체합니다.
- hematocytometer를 사용하여 활성화 효과기 AI4 T 세포를 계산합니다.
- 1 μl / ML Picogreen 위해 함께 활성화 효과기 T 세포 AI4 스테인5 상온에서 분 페놀 레드없는 문화 중간 3 회와 함께 씻으십시오.
5. 라이브 셀 이미징을 사용하여 평가 T 림프구 - 중재 베타 세포를 파괴
- 자이스 혈구 LSM 510 공촛점 현미경의 무대에 스테인드 NIT 세포와 chambered의 coverglass를 탑재합니다. dremmel 및 가스 etheline 산화와 chambered 유리를 소독과 탭을 제거합니다. 무대는 온도 37 ° C 제어 및 5% 수분과 CO 2.이 살아있는 세포 이미징 챔버를 갖추고 있습니다
- 활성화 추가 및 다른 전자에서 지정 방으로 스테인드 T 세포 : T 비율.
- 제어 방으로 스테인드 Jurkat 세포의 같은 번호를 추가했습니다.
6. 라이브 셀 이미지를 얻기
현미경 우리가 반복 실험의 시간이 코스를 통해 자동으로 동일한 또는 다른 회의소와는 다른 위치에서 이미지를 얻기위한 허용 전동 무대를 갖추고 있습니다.
- 63x 오일 객관적인 렌즈를 사용하여, 위치 300 프레임의 총 매 3 분 간격으로 이미지를 가져가라.
- 방출 565-619 NM 위해 여기 파장 543 nm의 길이 및 필터 집합을 사용하여 TMRM의 염색법을 감지
- 자극 488 NM 및 방출 500-630 nm의에 대한 필터 설정을 사용하여 Picogreen의 얼룩을 감지합니다. 비디오 자이스 혈구 LSM 소프트웨어를 사용하여 만들었습니다.
7. 게시를 위해 비디오 변환
- 자이스 혈구 LSM 소프트웨어를 사용하여 AVI 포맷으로 압축되지 않은 동영상 파일을 만듭니다.
- 출판 형식으로 비디오를 변환하려면, 소프트웨어 패키지 피지 (로 동영상을 가져올 http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji ), ImageJ ( http://rsb.info. nih.gov / 엘제이 / LOCI (에서 Bioformats 플러그인 사용) 배포 http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats ).
- 녹색과 빨간색 신호와 프레임 속도는 애니메이션 옵션 메뉴를 사용하여 두 프레임 / 초로 설정되었습니다 균형을 밝기 및 대비 설정을 조정합니다.
- 압축되지 않은 AVI 파일로 512 X 512 픽셀과 수출하기 위해 동영상을 자르기.
- 소프트웨어 퀵타임 7 (애플 컴퓨터, 쿠퍼 티노, CA)에서이 AVI 파일을 열고 압축 및 1200 KBS / 초에서 열린 비디오 파일 형식 H264/MPEG-4으로 내보낼 수 있습니다.
8. 대표 결과 :
- 51 피크 CML 분석의 대표적인 결과. 대상 비율 (X 축) 증가 : 그림 1은 %의 구체적인 용해 (Y 축)는 효과기 증가 CML 분석의 대표 결과를 보여줍니다. 대상 세포 immunodeficient NOD으로부터 격리 기본 아일 레츠 아르 Rag1 - / -. 생쥐 51 피크로 표시. NOD.AI4α / β 유전자 변형 생쥐에서 Splenocytes는 분리 단계 위의 2에서 설명한대로 활성화됩니다. 목표와 effectors는 16 시간 동안 공동 교양되었습니다. 위의 단계에서 설명한대로 3.11 %의 구체적인 용해가 계산됩니다.
- T 세포 - 매개 베타 세포 mitochondrial 막 잠재적인 손실의 두 대표 (긍정적이고 부정적인) 결과가 표시됩니다. 세포가 묻은하고 반응은 4 단계, 5 이상 6 설명한대로 기록, 비디오 파일은 7 단계에서와 같이 만들어집니다. 비디오 1 : 마우스 베타 세포 라인 NIT - 1은 mitochondrial 막 잠재적인 염료 TMRM (레드) 스테인드되었습니다. 50:1의 비율 T : 활성화, CD8 + T autoreactive는 세포 AI4 (Picogreen 물들일 녹색)를 E에서 이러한 NIT - 1 세포와 공동 교양되었습니다. NIT - 1 mitochondrial 막 잠재력은 400 분 동안 점차 소산 기간,하지만 AI4 T 세포와 상호 작용 있던 클러스터 인치 비디오 2 : 제어 실험으로 NIT - 1 세포 TMRM 및 E에 Picogreen 스테인드 Jurkat 세포 공동 교양 물들일되었습니다 50:1의 비율 T. Jurkat 세포는 MHC 일치되는 인간의 T 세포 라인입니다. NIT - 1 세포가 공동 잠복기 400 분 전체 기간에 걸쳐 mitochondrial 막 잠재력을 유지. Jurkat 세포는 NIT - 1 클러스터와 상호 작용하지 않았고 따라서, 살인 유도하지 않습니다.
그림 1 CML의 대표 결과가 immunodeficient NOD.Rag1 - / 격리 대상 세포 기본 아일 레츠로 사용 -. NOD.AI4α / β 유전자 변형 생쥐에서 마우스 및 splenocytes. 목표와 effectors는 16 시간 동안 공동 교양되었습니다. 퍼센트 특정 용해는 효과기 증가 : 대상 비율이 증가합니다.
비디오 1. 마우스 베타 세포 라인 NIT - 1은 mitochondrial 막 잠재적인 염료 TMRM (레드) 스테인드했습니다. 활성 autoreactive CD8 + T는 세포 AI4 (Picogreen 물들일 녹색)이 NIT - 1 E의 전지와 함께 공동 교양되었습니다 50:1의 비율 T. NIT - 1 mitochondrial 막 잠재 dissipa테드는 점차 400 분 기간 동안,하지만 녹색 AI4 T 세포와 상호 작용 있던 클러스터 것은. 비디오를 볼하려면 여기를 클릭하십시오 .
비디오 1 Picogreen 스테인드 인간의 T 세포 라인 Jurkat 공동 양식에 설명된대로 동영상 2. NIT - 1 세포가 같은 얼룩되었습니다. NIT - 1 세포는 mitochondrial 막 잠재력 400분 기간을 생각을 유지할 수 있었다. Jurkat 세포는 NIT - 1 클러스터와 상호 작용하지 않았고 따라서 살인을 유발하지 않습니다. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
세포 독성 T 세포 매개 베타 세포 죽음은 T1D 5 주 pathophysiology입니다. 51 피크 자료를 사용하여 CML의 assays은 우리가 효과기 - 목표 응답 6 정도를 공부하실 수 있습니다. 그러나, 세부적인 프로세스 및 T 세포 - 매개 베타 세포 사망 경로는 아직도 완전히 이해되지 않습니다. mitochondria가 베타 세포 기능과 사망 7 중요하기 때문에, 우리는 시각 CML 동안 mitochondrial 변화에 집중했다. Mitochondrial 막 잠재적인 소실은 apoptosis 8 이어지는 mitochondrial 기능 변경하는 동안 일찍 되돌릴 단계입니다. 공촛점 현미경 라이브 셀 이미징을 사용하여, 우리는 autoreactive T lymphocytes와 상호 작용하는 동안 베타 세포 mitochondrial 막 잠재적인 소실을 시각화 수 있었다. 이 실험 설정은 T1D의 개발 기간 동안 베타 세포에 무슨 일이 일어 나는지 최소한 부분을 모방한 것이었 지요. 이 실험의 한계는 다음과 같습니다 : 우리 자이스 혈구 현미경을 갖춘 라이브 셀 이미징에 대한 가열 삽입은 랩 - 탁 II chambered coverglass (동시 처리의 기록 및 컨트롤), 손잡이 8 잘 사용하는 경우 따라서, 3.5 cm 배양 접시를 위해 설계되었습니다 chambered의 coverglass에 현미경의 삽입에 맞게하기 위해 제거되어야합니다. 또한, 우리는 8 잘 랩 - 탁 II chambered coverglass를 사용하면 가열 삽입이 35mm 페트리 접시, 설계이기 때문에, 우리는 센터 4 우물로 제한했다. 이 제한은 쉽게 특별히 자이스 혈구의 랩 - 탁 II chambered coverglass위한 난방 삽입의 설치에 의해 해결될 수 있습니다. 대상 세포를 공격하는 유전자 형광 효과기 T 세포를 사용하거나, 크린 시토킨 또는 셀 세포 상호 작용의 신호 경로를 테스트를 포함하여이 실험의 가능성이 수정. T1D의 pathogenesis에서 베타 세포 죽음은, 복잡한 과정을 포함하여 여러 경로를 포함하지만, Granzyme 및 perforin 9 파 / 파 리간드 9 크린 시토킨 10에 국한되지 않습니다. caspases 및 상용 granzyme의 B에 대한 형광 기판이있다, 이러한 선택 사항은 경로와 베타 세포를 파괴하는 동안 이벤트의 순서를 연구하는 것이 가능합니다.
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Disclosures
동물 실험은 플로리다 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 대학에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 DK074656 및 AI56374 (CEM)의 국립 연구소에서 보조금뿐만 아니라, 소아 당뇨병 연구 재단에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cr-51 | PerkinElmer, Inc. | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R&D Systems | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini Bio Products | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma-Aldrich | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6x50 mm Lime Glass | Fisher Scientific | 14-958-A | |
| Gamma Counter | PerkinElmer, Inc. | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher Scientific | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
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- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. , (2010).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
- Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores. Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).
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