Summary
À médiation cellulaire lymphocytotoxicité (LMC) dosages peuvent être utilisés pour tester les réponses autoréactifs et étudier les mécanismes de mort cellulaire in vitro. Cependant, en utilisant des cellules vivantes techniques d'imagerie microscopique confocale avec des colorants fluorescents, le type et la cinétique de la mort cellulaire ainsi que les voies utilisées peuvent être étudiés plus en détail.
Abstract
Diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune cellulaire T. Pendant la pathogenèse, les patients deviennent progressivement plus insulinopenic que la production d'insuline est perdu, sans doute cela résulte de la destruction des cellules bêta du pancréas par les lymphocytes T. Comprendre les mécanismes de la mort des cellules bêta au cours du développement du DT1 donneront un aperçu de générer un remède efficace contre cette maladie. À médiation cellulaire lymphocytotoxicité (LMC) dosages ont toujours utilisé le radionucléide chrome 51 (51 Cr) pour marquer les cellules cibles. Ces objectifs sont ensuite exposés à des cellules effectrices et la libération de 51 Cr par les cellules cibles est lu comme une indication de la mort cellulaire médiée par les lymphocytes. Les inhibiteurs de la mort cellulaire résulte de la libération diminué de 51 Cr.
Comme les cellules effectrices, nous avons utilisé une population active autoréactifs clonale de cellules CD8 + lymphocytes T cytotoxiques (CTL) isolés à partir d'un stock de souris transgéniques pour les deux chaînes alpha et bêta du récepteur AI4 cellules T (TCR). Activé AI4 cellules T ont été co-cultivées avec des cellules marquées au 51 Cr NIT cible pendant 16 heures, la libération de 51 Cr a été enregistré pour calculer lyse spécifique
Les mitochondries participent à de nombreux événements importants physiologiques, tels que la production d'énergie, la régulation de la signalisation de transduction, et l'apoptose. L'étude des cellules bêta mitochondriale changements fonctionnels pendant le développement du DT1 est un nouveau domaine de recherche. Utiliser le potentiel de membrane mitochondriale colorant rhodamine tétraméthyl ester méthylique (TMRM) et l'imagerie confocale de cellules vivantes microscopiques, nous avons suivi le potentiel de membrane mitochondriale au cours du temps dans la ligne de la cellule bêta-1 NIT. Pour les études d'imagerie, d'effecteur AI4 cellules T ont été marqués avec fluorescent nucléaire coloration colorants Picogreen. NTI-1 et les cellules T ont été co-cultivées en chambrée lamelle et monté sur la platine du microscope équipé d'une chambre de cellules vivantes, contrôlée à 37 ° C, avec 5% de CO 2, et humidifié. Lors de ces expériences images ont été prises de chaque cluster toutes les 3 minutes pour 400 minutes.
Pendant une période de 400 minutes, nous avons observé la dissipation du potentiel de membrane mitochondriale dans NIT-1 grappes cellule où AI4 cellules T ont été attachés. Dans l'expérience, où le contrôle simultané NIT-1 cellules ont été co-cultivées avec CMH dépareillés humaine cellules Jurkat lymphocytes, le potentiel de membrane mitochondriale est resté intact. Cette technique peut être utilisée pour observer en temps réel des changements dans le potentiel de membrane mitochondriale dans les cellules de l'attaque des lymphocytes cytotoxiques, des cytokines, ou d'autres réactifs cytotoxiques.
Protocol
1. Préparation des cellules
- Culture de cellules cibles: la culture de lignées de souris des cellules bêta, NIT-1-4 et aux NTIC, a été un 1,2 précédemment décrit dans DMEM supplémenté avec 10% de FBS, BSA 0,02%, non-acides aminés essentiels, 15mm HEPES, 16.5mm Glocose et pénicilline / streptomycine. Pour 51 d'étiquetage Cr, les cellules des graines dans un fond plat plaque de 96 puits de culture au 5X10 4 cellules / puits dans 200 ul milieu de culture. Pour des expériences de microscopie, les cellules des graines dans un 8-même Lab-Tak lamelle II chambrés à 5x10 4 par chambre dans un milieu de culture 500 ul, et permettre de croître pendant 48 heures avant d'utiliser dans les expériences de cytotoxicité.
- Contrôle de la culture lignée cellulaire T: Utilisez la lignée cellulaire Jurkat (ATCC, CD3 + humaines lignée cellulaire des lymphocytes) comme contrôle négatif. Cellules Jurkat Culture en RPMI1640 complété avec 10% de FBS, 2 mM L-glutamine, le bicarbonate de sodium 1,5 g / L, 10 mM d'HEPES et 1,0 mM pyruvate de sodium.
2. Collecte et l'activation des effecteurs autoréactifs des cellules T CD8 +
NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] et NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] ont été achetés auprès de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) et élevés dans notre installation de la souris. F1 descendance hybride de croisements de souris NOD-AI4a avec NOD-AI4b [NOD-AI4a / b] développent un diabète à 3-5 semaines d'âge. Toutes les souris ont été logés dans des installations exemptes d'agents pathogènes et approuvé par les soins des animaux de l'institution concernée et le Comité d'utilisation.
- Euthanasier 3-4 semaines vieilles NOD-AI4a / b des souris en utilisant du CO 2.
- Recueillir les rates de souris. Souris euthanasiés sont préparés par pulvérisation d'éthanol et ouvert sous le capot chirurgicale. Rates sont prélevées et mises en tampon glacé HBSS immédiatement.
- Recueillir les cellules spléniques en utilisant un verre de 7 ml homogénéisateur. Deux à trois rate chacun sont mis en 5 ml de HBSS froid et homogénéisé avec un homogénéiseur 7 ml en verre. Homogénat est recueilli et centrifugé à 1200rpm pendant 5 minutes à 4 ° C en utilisant une centrifugeuse Sorvall RT7 +. Les culots cellulaires sont collectées.
- Enlever les globules rouges en utilisant un traitement solution hypotonique. Les pellets sont traités par 5 ml de solution hypotonique / rate sur la glace pendant 5 minutes, puis neutralisé par addition d'un volume égal de HBSS. Recueillir les cellules par centrifugation, comme ci-dessus, et remettre en suspension dans 50 ml de HBSS. Passez les cellules en suspension grâce à la crépine de cellule et de compter à l'aide d'un hémocytomètre avec coloration TrypanBlue.
- Activer les cellules. Resuspendre les cellules à 5x10 6 / ml et activer à l'aide d'une culture de 3 jours avec 0,1 pM AI4 mimotopes (amino YFIENYLEL séquence d'acides) et 25 U / ml d'IL-2 dans RPMI1640 complété avec 10% de FBS, 2 mM L-glutamine, 1,5 g / bicarbonate de sodium L, HEPES 10 mM et 1,0 mM pyruvate de sodium.
3. 51 test de libération de Cr pour examiner la LMC
- Cellules cibles Label: Ajouter 51 Cr pour cibler les cellules à 1 pCi / puits et la culture pendant 3 heures, et laver 3 fois avec un milieu de culture.
- Suspendre les cellules effectrices en milieu RPMI 1640 tel que mentionné dans l'étape 2.5 de sorte que le volume final ajouté à chaque puits est de 200 pi.
- Après le lavage final des cellules cibles marquées, ajouter activé des cellules effectrices aux cultures de cellules cibles à effecteur souhaitées à la cible (E: T) des ratios. Nous utilisons habituellement E: ratios T à 0,4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 et 50:1.
- Ajouter frais de modification du milieu RPMI 1640 (voir étape 2.5) à 6 puits de cellules cibles à agir comme un contrôle lyse spontanée.
- Co-culture des cellules effectrices et cibles pendant 16 heures.
- Recueillir le surnageant dans des tubes de verre 6x50 mm Lime
- Lyse des cellules en ajoutant 100 ul de 2% de SDS et de pipetage plusieurs fois délicatement.
- Recueillir lysat cellulaire dans un autre ensemble de tubes de verre 6x50 mm Lime.
- Laver les puits une fois avec nettoyage H 2 O et ajouter le lavage pour les tubes lysat cellulaire.
- Compter les surnageants et les lysats cellulaires en utilisant un compteur gamma.
- Calculer lyse spécifique comme suit:
4. Coloration des cellules pour l'imagerie de cellules vivantes
Parmi les plus couramment utilisés colorants membrane mitochondriale potentiels, TMRM expositions de la toxicité mitochondriale au moins 3. Par conséquent, nous choisissons TMRM pour ces études d'imagerie des cellules vivantes.
- Préparer une solution à 40 mM dans le DMSO TMRM et conserver à -20 ° C. Faites un [25 nM] une nouvelle solution de travail dans le rouge de phénol libre DMEM avec tous les suppléments pour NTI une culture cellulaire 1.
- Tache cibles NIT-1 des cellules avec TMRM 25 nM pendant 30 min à 37 ° C.
- Remplacez le support du milieu frais contenant 5 nM TMRM de maintenir la distribution d'équilibre des 4 colorant.
- Comptez effectrices activées AI4 cellules T utilisant un hématocytomètre.
- Tache effectrices activées AI4 cellules T avec 1 pl / ml pour les Picogreen5 minutes à température ambiante et laver avec du rouge de phénol libre milieu de culture 3 fois.
5. Évaluation des lymphocytes T médiée par la mort des cellules bêta en utilisant l'imagerie de cellules vivantes
- Montez la lamelle chambré avec des cellules NIT taché sur la scène d'un Zeiss LSM 510 microscope confocal. Retirez la languette avec un dremmel gaz et de stériliser les chambrés en verre à l'oxyde Etheline. Le stade est équipé d'une chambre de l'imagerie des cellules vivantes qui a contrôlé la température à 37 ° C et 5% de CO 2 avec l'humidité.
- Ajouter activé et colorées des cellules T à des chambres désignées à E différents: les ratios T.
- Ajouté le même nombre de cellules Jurkat tachés aux chambres de contrôle.
6. Obtenir des images de cellules vivantes
Le microscope est équipé d'une platine motorisée, qui nous a permis d'acquérir des images à plusieurs reprises à différents endroits des chambres identiques ou différents automatiquement au cours du temps de l'expérience.
- L'utilisation d'un objectif 63x du pétrole, de prendre des images à un intervalle de toutes les 3 minutes pour un total de 300 images par emplacement.
- Détecter coloration TMRM utilisant une longueur d'onde d'excitation de 543 nm et ensemble de filtres pour l'émission de 565 à 619 nm
- Détecter coloration Picogreen utilisant une excitation à 488 nm et un ensemble de filtres pour l'émission de 500 à 630 nm. La vidéo a été créé en utilisant le logiciel LSM Zeiss.
7. Conversion vidéo pour la publication
- Utilisation du logiciel LSM Zeiss, créer un fichier vidéo compressé au format AVI.
- Pour convertir la vidéo au format publié, importer la vidéo dans le logiciel FIDJI ( http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji ), une ImageJ ( http://rsb.info. nih.gov / ij / ) de la distribution, en utilisant le plugin Bioformats de loci ( http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats ).
- Réglez les paramètres de luminosité et le contraste pour équilibrer les signaux verts et rouges et le taux de trame a été fixé à 2 images / seconde en utilisant le menu des options animation.
- Recadrer la vidéo à 512 x 512 pixels et d'exporter dans un fichier AVI non compressé.
- Ouvrir ce fichier AVI dans le logiciel QuickTime 7 (ordinateur Apple, à Cupertino, Californie) et de compresser et d'exportation dans le format de fichier vidéo ouvert H264/MPEG-4 à 1200 kbs / seconde.
8. Les résultats représentatifs:
- Un résultat représentatif de 51 Cr CML dosage. La figure 1 montre un résultat représentatif d'un dosage de la LMC, où lyse pour cent spécifiques (axe Y) augmente à mesure que l'effecteur: ratio cible (axe X) augmente. Les cellules cibles sont des îlots isolés de souris NOD primaires immunodéficientes Rag1-/ -. Souris et marquées au 51Cr. Splénocytes de NOD.AI4α / β souris transgéniques sont isolés et activés comme décrit dans l'étape 2 ci-dessus. Les cibles et les effecteurs ont été co-cultivées pendant 16 heures. Lyse spécifique est calculé pour cent tel que décrit à l'étape 3.11 ci-dessus.
- Deux représentant (positives et négatives) des résultats d'une médiation cellulaire T dissipation de cellules bêta membrane mitochondriale potentiels sont présentés. Les cellules sont colorées et les réactions sont enregistrées comme décrit dans les étapes 4, 5 et 6 ci-dessus, les fichiers vidéo sont créés comme à l'étape 7. Vidéo 1: La lignée de cellules de souris beta-1 NIT était tachée du potentiel de membrane mitochondriale colorant TMRM (Rouge). Activé, autoréactifs lymphocytes T CD8 + AI4 (vert souillé avec Picogreen) ont été co-cultivées avec ces NIT-1 des cellules à un rapport E: T de 50:1. NTI-1 potentiel de membrane mitochondriale dissipée progressivement pendant une durée de 400 minutes, mais seulement dans les clusters qui ont été en interaction avec les cellules T AI4. Vidéo 2: Comme une expérience de contrôle, NIT-1 cellules ont été colorées avec TMRM et co-cultivées avec des cellules Jurkat Picogreen taché à un rapport E: T de 50:1. Les cellules Jurkat sont une lignée de cellules T humaines qui est MHC incompatibles. NTI-1 cellules maintenues potentiel de membrane mitochondriale pendant toute la durée de l'400 minutes co-incubation période. Cellules Jurkat ne pas interagir avec NTI-1 grappes et donc, ne pas faire tuer.
Figure 1 résultat représentatif de la LMC utilisant comme cellules cibles primaires îlots isolés de immunodéficientes NOD.Rag1-/ -. Splénocytes des souris et des NOD.AI4α / β de souris transgéniques. Les cibles et les effecteurs ont été co-cultivées pendant 16 heures. Lyse pour cent spécifiques augmente à mesure que l'effecteur: augmente ratio cible.
Vidéo 1. Lignée de souris des cellules bêta NIT-1 a été taché le potentiel de membrane mitochondriale colorant TMRM (Rouge). Activé autoréactifs lymphocytes T CD8 + AI4 (vert souillé avec Picogreen) ont été co-cultivées avec ces NIT-1 cellules au rapport E: T de 50:1. NTI-1 potentiel de membrane mitochondriale dissipationTed progressivement pendant une durée de 400 minutes, mais seulement dans les clusters qui ont été en interaction avec les cellules vertes T AI4. Cliquez ici pour visionner la vidéo .
Vidéo 2. NIT-1 cellules ont été colorées comme décrit dans la vidéo 1 et co-cultivées avec Picogreen Jurkat T teinté lignée cellulaire humaine. NTI-1 cellules ont été capables de maintenir le potentiel de membrane mitochondriale pensé toute la durée de 400 minutes. Cellules Jurkat ne pas interagir avec NTI-1 grappes et donc ne pas faire tuer. Cliquez ici pour visionner la vidéo .
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Discussion
Lymphocyte T cytotoxique médiée la mort des cellules bêta est la principale physiopathologie du DT1 5. Dosages de LMC en utilisant 51 Cr communiqué nous permettre d'étudier le degré d'effecteur-cible de réponse 6. Cependant, le processus détaillé et les voies de lymphocytes T de mort des cellules bêta n'est pas encore pleinement comprise. Depuis les mitochondries sont critiques pour la fonction des cellules bêta et la mort 7, nous nous sommes concentrés sur les changements mitochondriale pendant la LMC visuelle. Dissipation de la membrane mitochondriale potentiel est une étape précoce et irréversible au cours des modifications mitochondriales fonctionnelles conduisant à l'apoptose 8. En utilisant la microscopie confocale d'imagerie cellulaire en direct, nous avons été en mesure de visualiser des cellules bêta de dissipation du potentiel de membrane mitochondriale lors des interactions avec les lymphocytes T autoréactifs. Ce cadre expérimental imite au moins une partie de ce qui arrive aux cellules bêta au cours du développement du DT1. Limitations de cette expérience sont: l'insert de chauffage pour l'imagerie de cellules vivantes équipé de notre microscope Zeiss a été conçu pour 3,5 cm de boîtes de Petri, donc lors de l'utilisation de 8 puits Lab-Tak II chambrée lamelle (pour l'enregistrement simultané des traités et contrôles), la poignée sur la lamelle chambrée doit être enlevé afin de tenir dans l'insert microscope. Aussi, parce que l'insert de chauffage est conçu pour un plat de Pétri 35mm, lorsque nous utilisons de 8 puits Lab-Tak II chambrée lamelle, nous étions limités aux 4 centre de puits. Cette limitation peut être facilement résolu par l'installation d'un insert de chauffage spécialement conçu pour les Lab-Tak lamelle II chambrés par Zeiss. Les modifications éventuelles de cette expérience, y compris en utilisant génétiquement fluorescent lymphocytes T effecteurs à attaquer les cellules cibles, ou des tests voies de signalisation des cytokines ou interactions cellule-cellule. La mort des cellules bêta dans la pathogenèse du DT1 est un processus compliqué, implique de multiples voies, y compris mais non limité à, les cytokines et de perforine granzyme 9, Fas / Fas ligand 9, 10. Il ya substrats fluorescents pour les caspases et granzyme B disponibles dans le commerce; avec ces choix, il est possible d'étudier les voies et la séquence des événements lors de la mort des cellules bêta.
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Disclosures
Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par l'Université de Floride, les soins des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health et de DK074656 AI56374 (CEM), ainsi que la Juvenile Diabetes Foundation Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cr-51 | PerkinElmer, Inc. | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R&D Systems | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini Bio Products | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma-Aldrich | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6x50 mm Lime Glass | Fisher Scientific | 14-958-A | |
| Gamma Counter | PerkinElmer, Inc. | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher Scientific | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
- Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. , (2010).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
- Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores. Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).
- Abel, M., Krokowski, M. Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy. BioDrugs. 15, 291-301 (2001).
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- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8, 115-128 (2003).
- Dudek, N. L. Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways. Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).
- Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).
