Summary
Cell-medierad lymphocytotoxicity (KML) analyser kan användas för att testa autoreaktiva svar och mekanismer studie av celldöd in vitro. Däremot kan med hjälp av live-cell konfokala mikroskopiska avbildningstekniker med fluorescerande färger, typ och kinetik av celldöd samt utnyttjade vägar ska studeras mer i detalj.
Abstract
Typ 1-diabetes (T1D) är en T-cell autoimmuna sjukdomar. Under patogenes, patienterna blir successivt mer insulinopenic som insulin produktion gått förlorad, förmodligen Detta beror på förstörelse av betaceller i bukspottkörteln via T-celler. Att förstå mekanismerna av beta celldöd under utvecklingen av T1D kommer att ge insikter för att skapa ett effektivt botemedel mot denna sjukdom. Cell-medierad lymphocytotoxicity (KML) tester har historiskt använt radionuklid Krom 51 (51 Cr) att märka målceller. Dessa mål är sedan utsätts för effektor celler och frisättningen av 51 Cr från målceller läses som en indikation på lymfocyt-medierad celldöd. Hämmare av celldöd resultera i minskad frisättning av 51 Cr.
Som effektor celler, använde vi en aktiverad autoreaktiva klonal befolkning på CD8 + cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) isolerade från en mus lager transgena för både alfa och kedjor beta av AI4 T cell receptor (TCR). Aktiverade AI4 T-celler var co-odlade med 51 märkta Cr celler mål NIT i 16 timmar, Cr utsläpp av 51 noterades att beräkna specifika lys
Mitokondrier delta i många viktiga fysiologiska händelser, såsom energiproduktion, reglering av signalering transduktion, och apoptos. Studien av beta-cellens mitokondrie funktionella förändringar under utvecklingen av T1D är en roman forskningsområde. Med hjälp av mitokondriell membranpotential färga Tetramethyl Rhodamine Metyl Ester (TMRM) och konfokala mikroskopiska levande cell imaging, övervakas vi mitokondriell membranpotential över tiden i beta cellinje NIT-1. För imaging studier var effektor AI4 T-celler märkta med fluorescerande nukleär färgning färg Picogreen. NIT-1 och T-celler gavs samtidigt odlas i chambered coverglass och monteras på mikroskop scenen utrustad med en levande cell kammare, som kontrolleras vid 37 ° C, med 5% CO 2 och fuktig. Under dessa experiment bilderna har tagits från varje kluster var 3 minuter för 400 minuter.
Under en kurs på 400 minuter, observerade vi avledning av mitokondriell membranpotential i NIT-1 cell kluster där AI4 T-celler sattes dit. I samtidig kontroll experiment där NIT-1 celler var co-odlade med MHC mis-matchade mänskliga lymfocyter Jurkat celler, förblev mitokondriell membranpotential intakt. Denna teknik kan användas för att följa i realtid förändringar i mitokondriell membranpotential i celler under attack av de cytotoxiska lymfocyter, cytokiner eller andra cytotoxiska reagenser.
Protocol
1. Beredning av celler
- Mål cellodling: Kultur i cellen musen beta linjer, NIT-1 och NIT-4, var en tidigare beskrivits 1,2 i DMEM kompletterad med 10% FBS, 0,02% BSA, icke-essentiell aminosyra, 15mm HEPES, 16.5mm Glocose och penicillin / streptomycin. För 51 Cr märkning, utsäde celler i en flat botten 96-bra odlingsplatta på 5x10 4 celler / brunn i 200 l odlingsmedium. För mikroskopi experiment, utsäde celler i en 8-brunnars Lab-Tak II chambered coverglass på 5x10 4 per kammare i 500 l odlingsmedium, och låta växa i 48 timmar innan du använder i cytotoxicitet experiment.
- Kontroll T-cell linje kultur: Använd Jurkat cellinje (ATCC, CD3 + mänskliga lymfocyter cellinje) som negativ kontroll. Kultur Jurkat celler i RPMI1640 kompletterad med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1,5 g / l natrium-bikarbonat, 10 HEPES mm och 1,0 mm natrium pyruvat.
2. Insamling och aktivering av effektor autoreaktiva CD8 + T-celler
NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] och NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] köptes från The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) och uppfödda i vår mus anläggning. F1-hybrid avkomma från parning av NOD-AI4a med NOD-AI4b [NOD-AI4a / b] utveckla diabetes vid 3-5 veckors ålder. Alla möss inrymt i specifika patogenfria anläggningar och godkänts av den berörda institutionens Djurvård och användning kommittén.
- Euthanize 3-4 veckor gamla NOD-AI4a / b möss med CO 2.
- Samla mjälte från möss. Avliva möss är beredda med etanol spray och öppnas under kirurgiska huva. Mjälte tas bort och lägga i iskallt HBSS buffert omedelbart.
- Samla mjältceller med en 7 ml glasflaska homogeniseringsblandare. Två till tre mjälte vardera läggs i 5 ml kallt HBSS och homogeniseras med en 7 ml glasflaska homogeniseringsblandare. Homogenat samlas in och centrifugeras vid 1200rpm i 5 minuter vid 4 ° C med en Sorvall RT7 + centrifug. Cell pellets samlas in.
- Ta bort röda blodkroppar med hjälp av hypoton lösning behandling. Pellets är behandlade med 5 ml hypoton lösning / mjälten på is i 5 minuter, därefter neutraliseras genom att tillsätta en lika volym HBSS. Samla cellerna genom centrifugering, enligt ovan, och återsuspendera i 50 ml HBSS. Passera suspenderade celler genom cell sil och räkna med en hemocytometer med TrypanBlue färgning.
- Aktivera celler. Resuspendera cellerna på 5x10 6 / mL och aktivera med en 3 dagars kultur med 0,1 mikroM AI4 mimotope (aminosyrasekvens YFIENYLEL) och 25 U / mL IL-2 i RPMI1640 kompletteras med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1,5 g / L natriumbikarbonat, 10 mm HEPES och 1,0 mm natrium pyruvat.
3. 51 Cr släppa analys för att undersöka KML
- Label målceller: Lägg 51 Cr till målceller vid 1 μCi / brunn och kultur i 3 timmar, och tvätta tre gånger med odlingsmedium.
- Häng effektor celler i RPMI 1640 medium som nämns i steg 2,5, så att den slutliga volymen till varje brunn är 200 l.
- Efter den sista tvätten av märkta målceller, lägga aktiverade effektor celler till de kulturer målcellen på önskat effektor till målet (E: T) nyckeltal. Vi brukar använda E: t-förhållanden på 0.4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:01 och 50:1.
- Lägg färska modifierad RPMI 1640 medium (se steg 2.5) till 6 brunnar i målceller för att fungera som en spontan lys kontroll.
- Co-kultur effektor och målceller i 16 timmar.
- Samla supernatanten i 6x50 mm Lime Glasrör
- Lyse cellerna genom att tillsätta 100μl 2% SDS och pipettering flera gånger försiktigt.
- Samla cell lysat i en annan uppsättning 6x50 mm Lime glasrör.
- Tvätta brunnarna gång med rent H 2 O och lägga tvätten i rören cell lysat.
- Räkna supernatanterna och lysates cellen med hjälp av en gamma disk.
- Beräkna specifika lys enligt följande:
4. Färgning av celler för levande cell imaging
Bland de vanligaste mitokondriell membranpotential färgämnen, utställningar TMRM minst mitokondriell toxicitet. 3 Därför väljer vi TMRM för dessa live-studier cell imaging.
- Förbered en 40 mM lösning lager TMRM i DMSO och förvara vid -20 ° C. Gör en [25 nm] färska fungerande lösning i fenolrött-fri DMEM med alla tillägg för NIT-1 cellodling 1.
- Stain mål NIT-1 celler med TMRM 25 nm för 30 minuter vid 37 ° C.
- Byt media med färska media som innehåller 5 nM TMRM att bibehålla balansen fördelningen av färgen 4.
- Räkna aktiverade effektor AI4 T-celler med hjälp av en hematocytometer.
- Fläck aktiverade effektor AI4 T-celler med 1 l / ml Picogreen för5 minuter vid rumstemperatur och tvätta med fenolrött utan odlingsmedium 3 gånger.
5. Bedömning av T-lymfocyter-medierad beta celldöd använder levande cell imaging
- Montera chambered coverglass med nedfläckade NIT celler på scenen av en Zeiss LSM 510 konfokalmikroskop. Ta bort fliken med en dremmel och gas sterilisera chambered glaset med Etheline oxid. Scenen är utrustad med en live-cell imaging kammare som har temperaturkontroll vid 37 ° C och 5% CO 2 med fukt.
- Lägg aktiveras och färgade T-celler till utsedda kamrar på olika E: T nyckeltal.
- Lade till samma antal färgade Jurkat celler till kontrollen kamrarna.
6. Skaffa levande cell bilder
Mikroskopet är utrustad med en motoriserad stadium som tillät oss att upprepade gånger få bilder på olika platser från samma eller olika avdelningar automatiskt över tiden under försöket.
- Med hjälp av en 63x olja objektiv, ta bilder med ett intervall på var 3 minuter för totalt 300 bilder per plats.
- Identifiera TMRM färgning med en längd excitation våg av 543 nm och filtrera in för utsläpp 565-619 nm
- Identifiera Picogreen färgning med hjälp av en excitation 488 nm och ett filter in för utsläpp 500-630 nm. Videon är skapad av Zeiss LSM programvara.
7. Videokonvertering för publicering
- Använda Zeiss LSM programvara, skapa en okomprimerad film-fil i en AVI-format.
- Att konvertera video i den publicerade format, importera video i programpaketet Fiji ( http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji ), en ImageJ ( http://rsb.info. nih.gov / ij / ) distribution, användning av Bioformats plugin från loci ( http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats ).
- Justera ljusstyrka och kontrast för att balansera de gröna och röda signaler och bildfrekvensen var satt till 2 bilder / sekund med animeringen alternativmenyn.
- Beskär videon till 512 x 512 pixlar och exportera som en okomprimerad AVI-fil.
- Öppna denna AVI-fil i programvaran Quicktime 7 (Apple-dator, Cupertino, Kalifornien) och komprimera och exportera i det öppna videofilformat H264/MPEG-4 på 1200 kbs / sekund.
8. Representativa resultat:
- En representant resultat av 51 Cr KML analys. Figur 1 visar ett representativt resultat av en KML test där procent specifika lys (Y-axeln) ökar när Effektenheter: Target-förhållande (X-axeln) ökar. Målceller är primära holmar isolerade från immundefekta NOD Rag1-/ -. Möss och märkt med 51 Cr. Splenocytes från NOD.AI4α / β transgena möss är isolerade och aktiveras enligt beskrivningen i steg 2 ovan. Mål och effektenheter var co-odlade i 16 timmar. Procent specifika lys beräknas enligt beskrivningen i steg 3,11 ovan.
- Två ombud (positiva och negativa) resultat av en T-cell-medierad betacellens mitokondriell membranpotential utsvävningar presenteras. Celler är färgade och reaktioner redovisas som beskrivs i steg 4, 5 och 6 ovan är video filer skapade i steg 7. Video 1: Musen beta cellinje NIT-1 var fläckade av mitokondriell membranpotential dye TMRM (röd). Aktiverad, + T celler AI4 (Stained grön med Picogreen) autoreaktiva CD8 var co-odlade med dessa NIT-1 celler vid en E: T förhållandet 50:1. NIT-1 mitokondriell membranpotential skingras successivt under en 400-minuters varaktighet, men bara i de kluster som samverkar med AI4 T-celler. Video 2: Som en kontroll experiment, NIT-1 celler färgades med TMRM och co-odlade med Picogreen färgade Jurkat celler vid en E: T förhållandet 50:1. Jurkat celler är en human T-cell linje som är MHC stämmer. NIT-1 cellerna upprätthålls mitokondriell membranpotential under hela den tid som 400 minuter tillsammans inkubationstid. Jurkat celler inte interagera med NIT-1 kluster och därför inte framkalla döda.
Figur 1 representativt resultat av KML använder som målceller primära holmar isolerade från immundefekta NOD.Rag1-/ -. Möss och splenocytes från NOD.AI4α / β transgena möss. Mål och effektenheter var co-odlade i 16 timmar. Procent specifika lys ökar när Effektenheter: Höjer mål förhållande.
Video 1. Mouse beta cellinje NIT-1 var fläckade av mitokondriell membranpotential dye TMRM (röd). Aktivt autoreaktiva CD8 + T-cell AI4 (Stained grön med Picogreen) var co-odlade med dessa NIT-1 celler vid E: T förhållandet 50:1. NIT-1 mitokondriell membranpotential dissipaTed gradvis under en 400-minuters varaktighet, men bara i de kluster som interagerar med gröna AI4 T-celler. Klicka här för att titta på video .
Video 2. NIT-1 celler färgades samma som beskrivs i bild 1 och co-odlade med Picogreen färgade humana T cell linje Jurkat. NIT-1 celler kunde upprätthålla mitokondriell membranpotential genomtänkt längd 400 minuter. Jurkat celler inte interagera med NIT-1 kluster och därmed framkalla inte döda. Klicka här för att titta på video .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cytotoxiska T-cell medierad beta celldöd är den viktigaste patofysiologin vid T1D 5. KML analyser med hjälp av 51 Cr-släpp ger oss möjlighet att studera graden av effektormedierad mål respons 6. Dock är den detaljerade processen och vägar av T-cell-medierade beta celldöd fortfarande inte helt klarlagda. Eftersom mitokondrierna är avgörande för betacellsfunktionen och död 7 har vi fokuserat på mitokondrie-förändringar under den visuella KML. Mitokondriell membranpotential försvinnande är en tidig och oåterkalleligt steg under den mitokondriella funktionella förändringar som leder till apoptos 8. Använda konfokalmikroskopi levande cell imaging, kunde vi visualisera beta-cellens mitokondrie avledning membranpotential under interaktioner med autoreaktiva T-lymfocyter. Denna experimentella inställning härmar åtminstone en del av vad som händer med beta-celler under utveckling T1D. Begränsningar av detta experiment är: värme in för levande cell imaging utrustade med vårt Zeiss mikroskop var avsedd för 3,5 cm petriskålar, alltså när man använder 8-och Lab-Tak II chambered coverglass (för samtidig inspelning av behandlade och kontroller), handtaget på chambered coverglass måste tas bort för att passa i mikroskop insatsen. Också, eftersom uppvärmningen Insatsen är konstruerad för en 35mm petriskål, när vi använder 8-brunnars Lab-Tak II chambered coverglass var vi begränsade till centrum 4 brunnar. Denna begränsning kan enkelt lösas genom installation av ett värmesystem in speciellt för Lab-Tak II chambered coverglass av Zeiss. Eventuella ändringar av detta experiment med hjälp av genetiskt fluorescerande effektor T-celler att angripa målceller, eller testa signalvägar av cytokiner eller cell-cell interaktioner. Beta celldöd i patogenesen för T1D är en komplicerad process, innebär flera vägar, inklusive men inte begränsat till, Granzyme och perforin 9, Fas / Fas ligand 9, cytokiner 10. Det finns fluorescerande substrat för kaspaser och granzyme B kommersiellt tillgängliga, med dessa val är det möjligt att studera vägar och händelseförloppet under beta celldöd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som respektive University of Florida institutionella Djurvård och användning kommittén.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health DK074656 och AI56374 (CEM), liksom Juvenile Diabetes Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cr-51 | PerkinElmer, Inc. | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R&D Systems | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini Bio Products | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma-Aldrich | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6x50 mm Lime Glass | Fisher Scientific | 14-958-A | |
| Gamma Counter | PerkinElmer, Inc. | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher Scientific | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
- Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. , (2010).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
- Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores. Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).
- Abel, M., Krokowski, M. Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy. BioDrugs. 15, 291-301 (2001).
- Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants. Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria mediated cell death in diabetes. Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).
- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8, 115-128 (2003).
- Dudek, N. L. Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways. Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).
- Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).
