Summary
ووصف طريقة سريعة للحصول على الكريات البيض التسلل من الدماغ الفئران. هذه الطريقة تستخدم الانحدار المستمر والمتقطع Percoll التدرج Ficoll لتحديد وتنقية طبقة الكريات البيض المخصب. ثم قد تكون معزولة الكريات البيضاء التي تتميز قياسات تدفق cytometric.
Abstract
نحن تصف طريقة لإعداد الكريات البيضاء في الدماغ التسلل (BILs) من الفئران. نحن لشرح كيفية تصيب الدماغ و النخاع الفئران مع فيروس تايلر الفئران (TMEV) عبر تقنية الحقن داخل الجمجمة السريع ، وكيفية تنقية سكان الكريات البيض المخصب من الخلايا التسلل من الدماغ كله. باختصار ، هي تخدير الفئران مع isoflurane في غرفة مغلقة وخالية من ناحية حقن حقنة مع هاميلتون في القشرة الأمامية. ثم يتم قتل الفئران في أوقات مختلفة بعد العدوى عن طريق جرعة زائدة isoflurane والعقول كلها تستخرج والمتجانس في RPMI مع طاحونة Tenbroeck الأنسجة. وطرد الخليط الدماغ من خلال التدرج المستمر Percoll 30 ٪ لازالة الانقاض الخلية الميلين وغيرها. وتوترت ثم تعليق خلية في 40 ميكرون ، وغسلها وطرد على التدرج متقطع بلس Ficoll - Paque لتحديد وتنقية الكريات البيض. ثم يتم غسل الكريات البيض ومعلق في مخازن مناسبة لimmunophenotyping بواسطة التدفق الخلوي. التدفق الخلوي يكشف عن مجموعة من الخلايا المناعية الفطرية في المراحل المبكرة من العدوى في الفئران C57BL / 6. إصابة آخر في 24 ساعة ، مجموعات فرعية متعددة من الخلايا المناعية الموجودة في BILs ، مع السكان المخصب من GR1 + ، + CD11b وخلايا + F4/80. ولذلك ، فإن هذه الطريقة مفيدة في وصف رد الفعل المناعي للعدوى حادة في الدماغ.
Protocol
1. حقن الفيروس داخل القحف :
تم تعديل هذه التقنية المستخدمة على نطاق واسع التالية والتي مختبرنا والزملاء. لفترة وجيزة ، والحقن داخل القحف من سلالة من التهاب الدماغ و النخاع دانيال فيروس تايلر الفئران (TMEV) أو صورية العدوى (1 ، 10) والتي أجريت على الفئران الشباب (يفضل 5-6 اسابيع من العمر) لانتزاع الكريات البيضاء في الدماغ التسلل (BILs). يرجى ملاحظة أن النتائج ستختلف بين سلالة دانيال ، من سلالة فول ، وسلالة GDVII. لغرض حصاد BILs والفئران تتلقى 2x10 5 من PFU TMEV والمصابين لمدة 24 ساعة.
- إرفاق الإبرة الحقن (27 قياس ، في ربع ، كندال) ، لتلقائي 1 مل حقنة هاملتون وتعيين لتسليم 10 ميكرولتر من الفيروس.
- وضع TMEV في 10 ميكرولتر DMEM في المحاقن مع الاهتمام الدقيق لفقاعات الهواء. عندما يكون ذلك مناسبا ، والفئران المصابة صورية على 10 ميكرولتر من DMEM خالية من الفيروسات.
- فقط قبل الحقن ، صب حوالي 1 مل من isoflurane في جرة الجرس الذي يحتوي على أسلاك الشبكة مع الركيزة القطن تحتها.
- الفئران direclty مكان على شبكة الأسلاك في جرة الجرس حتى تصبح تخدير طفيفة ، غير حساسة لقرصة أخمص قدميها ، وثبتوا من مخدر نشوق ، وحوالي 10-15 ثانية. وينبغي أن الفئران لا تأتي في اتصال مباشر مع isoflurane ، كمادة يمكن مزعجة والصودا الكاوية.
- في حين تحت تأثير التخدير ، وإعداد للحقن الفئران عن طريق تحديد إحداثيات المناسبة بسرعة في منطقة القشرة الأمامية على الجمجمة باستخدام الحلاقة والتحبير. الموقع العام للحقن هو 1 ملم الأمامي لbregma 1 ملم والوحشي للخياطة السهمي على الجانب الأيمن (الشكل 1). في حين حقن المجسم قد تكون ملائمة لبعض الحالات التجريبية ، وجدنا أن حرة مباشرة من دون حقن الحلاقة أو التحبير هو مناسب للغالبية التجارب. فراق الفراء مع نقطة على طول الإبرة المحورين المناسب للحقن.
- لإجراء الحقن ، وتوجيه عمودي الإبرة إلى الصحافة من خلال الجمجمة والعظام وبعمق حوالي 3 ملم.
- أعرب عن الفيروس إلى الدماغ عن طريق الضغط على زر أسفل حقنة هاميلتون والانتظار 2 ثانية للفيروس بالدخول الى المخ قبل ان تنسحب.
- إزالة الإبرة بعناية ووضع الماوس في قفص ونظيفة وجافة. الفئران افاقته بسرعة واستئناف وظيفة عادية في غضون دقائق. قد يعطي الاهتمام المناسب على الفئران أن تظهر عليهم أعراض غير طبيعية ، مثل النزيف من موقع الحقن ، والقتل الرحيم للحيوان يكون مناسبا. يجب أن تتبع الحيوانات السليمة التعامل مع 6 والتمسك المعاهد الوطنية للصحة ورعاية الحيوان المؤسسية والمبادئ التوجيهية للجنة الاستخدام.
2. الدماغ التسلل الكريات البيض إعداد الخلية :
- تعد الجولة القاع أنابيب الطرد المركزي التي يمكن أن أوك ريدج عقد قدرة 30 مل مع RPMI مل 10 1640 ، 9 Percoll مل و 1 مل PBS 10X ومواسير يجب الجلوس على مقاعد البدلاء RT على الدماغ أثناء عملية الإزالة.
- جلب Ficoll Paque - Plus لدرجة حرارة الغرفة (RT).
- الموت ببطء الحيوانية isoflurane تعديل جرعة زائدة (5) وإزالة بسرعة باستخدام أنسجة الدماغ الفولاذ المقاوم للصدأ ملعقة وضعها في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 5 مل RPMI على الجليد. في بعض الظروف ، قد يكون PBS - نضح المناسبة لإزالة الخلايا الدموية المحيطية تعميم من إعداد BILs. وينبغي أن يكون كاملا والفئران بشكل صحيح تخدير قبل PBS - الارواء.
- نقل الدماغ وRPMI حل ل7 مل زجاج بيركس طاحونة العلامة التجارية الأنسجة Tenbroeck والتجانس بلطف مع 10-15 السكتات الدماغية.
- الماصة إضافي 5 مل RPMI في الخالط والماصة صعودا وهبوطا مرتين. نقل جناسة الدماغ (حوالي 10 مل) إلى أنبوب الجولة القاع معدة مسبقا وعكس بلطف 2-3 مرات إلى مزيج.
- تدور في الدماغ جناسة افي 7800g لمدة 30 دقيقة في الدوار RT في الزاوية الثابتة F0360 في جهاز للطرد المركزي بيكمان X - 22R أليجرا السريرية.
- بعد الطرد المركزي ، وإزالة الأنقاض التي الميلين طرحت في قمة الانحدار. جمع طبقة الكريات البيض التي تعوم فوق بيليه خلايا الدم الحمراء (الشكل 2).
- سلالة طبقة الكريات البيض من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر إلى 50 مل المخروطية. تحقيق حل ما يصل الى حجم 50 ملم مع RMPI.
- تدور الأنابيب التي تحتوي على المخفف تعليق خلية في جهاز للطرد المركزي في الدقيقة السريرية 1500 (600G افي) لمدة 5 دقائق على RT.
- نضح في وطاف جمع بيليه الخلية. Resuspend الكرية في مخزن FACS 1 مل (1 ٪ ألبومين المصل البقري ، أزيد الصوديوم 0.02 ٪ من الكالسيوم والمغنيسيوم PBS مجانا) ونقل إلى تعليق الخلية 5 مل الدور السفلي FACS الأنابيب.
- تعليق الأساس الذي تقوم عليه بعناية مع 1 زائد Ficoll - Paque مل.
- تدور في أنبوب دورة في الدقيقة 2500 (1400 قدم) في أجهزة الطرد المركزي لمدة 25 دقيقة السريرية على RT مع عدم وجود الفرامل.
- إزالة الأبيض ، رقيق في طبقة واجهة (الشكل 2) مع 1 مل ماصة ونقل إلى 5 أنبوب جديد FACS مل. غسل جells مع 4 العازلة FACS مل.
- تدور في أنبوب 1500 دورة في الدقيقة (600G افي) لمدة 5 دقائق على RT في أجهزة الطرد المركزي السريرية لخلايا بيليه.
- نضح طاف بيليه وجمع الخلية. Resuspend الكرية الكريات البيض في العازلة المناسبة والحفاظ على الجليد في أنبوب FACS جديدة.
- عدد الخلايا ، وتقييم الجدوى الخلية الاستبعاد التريبان الأزرق وتحليلها حسب التدفق الخلوي. عموما ، يمكن أن نتوقع أن المحققين الحصول على ما يقرب من 5 × 10 5 خلية / الحيوانات.
3. immunophenotyping تدفق cytometric
- بعد عزل وعد كريات الدم البيضاء ، وتدور هذه الخلايا لمدة 3 دقائق في 1500 دورة في الدقيقة (600 قدم) في أجهزة الطرد المركزي السريرية.
- Resuspend الكرية في عرقلة العازلة التي تحتوي على ما يلي : FACS العازلة ، طاف من ورم هجين 2.4G2 (FC كتلة ؛ anti-CD16/32) ومصل بقري جنيني في نسبة 10:05:01 واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية .
- إعداد وإضافة أضداد ضد مستضدات مترافق خارج الخلية إلى الخلايا سدت في تركيز 1:200 واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام. وصمة عار واحتضان خلايا في 200 ميكرولتر في صفيحة V - 96 - القاع أيضا. وتشمل الضوابط المناسبة وغير ملوثين عينات خلايا ملون تألقي التعويض ، حسب الاقتضاء.
- تدور في الخلايا الملون RT لمدة 3 دقائق في 1500 دورة في الدقيقة (600 قدم) في أجهزة الطرد المركزي السريرية باستخدام الدوار لمناسبة 96 - جيدا لوحات.
- نضح في وطاف غسل الخلايا مع 200 ميكرولتر FACS العازلة التي pipetting بلطف صعودا ونزولا 3 مرات.
- تكرار الغسيل تقنية أعلاه مرتين.
- بعد الغسيل ، resuspend الخلايا في بارافورمالدهيد 2 ٪ ، ونقل إلى أنابيب FACS. مطلوب تثبيت لتحليل تدفق cytometric من الخلايا المصابة من الكواشف الأحيائية المستوى 2.
- تشغيل الخلايا الثابتة على FACS Calibur دينار بعد تعديل طريقة تدفق الخلوي (8) وتحليل الملفات باستخدام FlowJo حاليا ، WinMDI أو غيرها من البرامج المتاحة التدفق الخلوي التحليل.
- هو مطلوب عموما في تحليل الأحداث 50-100،000 لكل عينة لimmunophenotyping كافية.
مترافق مباشرة الأجسام المضادة المستخدمة في هذه التجربة :
تم الكشف عن CD45 مع استنساخ 30 - F11. تم الكشف عن Ly6C / G مع استنساخ GR1 ، RB6 - 8C5. تم الكشف عن CD11b مع استنساخ M1/70. تم الكشف عن F4/80 مع استنساخ BM8.
4. ممثل النتائج :
نعرض النتائج phenotyping الخلية لBILs الماوس في 24 إصابة آخر ساعة (الشكل 3). والكريات البيض الملون ، مترافق مع PerCP الماوس مكافحة CD45 للكشف عن الخلايا المناعية ، PE - مترافق المضادة للماوس Ly6C / G للكشف عن التهابات حيدات ، APC - مترافق المضادة للفأرة وCD11b APC مترافق مكافحة الفأر F4/80 للكشف عن خلايا من سلالته الوحيدات. تم إجراء تحليل بأداة FACS Calibur دينار بحريني.
الشكل 1. وتقع الترجمة التشريحية للموقع الحقن ، والحقن 1 ملم الأمامي لbregma 1 ملم والوحشي للخياطة السهمي على الجانب الأيمن.
الشكل 2. يتم جمعها في البداية من التوضيح الفصل المتدرج من الكريات البيض وBILs. الكريات البيض مباشرة تحت طبقة المايلين والحطام فوق بيليه RBC في الانحدار Percoll. يتم جمع البيض ، طبقة رقيق (BILs) في واجهة من التدرج Ficoll.
الشكل 3. وقد تم عزل نمط ظاهري مناعي من الدماغ infilatrating الكريات البيض في 24 ساعة بعد العدوى الكريات البيض الماوس. من الدماغ عن طريق الطرد المركزي كثافة الخليط من الفرق مستعدة الأنسجة من الحيوانات في 24 ساعة بعد العدوى داخل القحف. تم صبغ الخلايا مع أجسام مضادة ضد fluorescently - مترافق الماوس CD45 ، Ly6C / G ، CD11b وF4/80. تم تنفيذ تبوب الأولي بالتآمر CD45 ، وهي علامة للحصول على الخلايا المناعية ضد مبعثر إلى الأمام (FSC) ، وهو مؤشر على حجم الخلية (C). وقد تم تحليل ثم مرحبا CD45 (A ، D) ، CD45 الصغرى (B ، E) ، وNEG CD45 (F ، G) السكان لمستويات التعبير النسبية للعلامات الوحيدات والبلاعم Ly6C / G ، F4/80 (A ، B ، F) ، وCD11b (D ، E ، G). Ly6C / G + F4/80 + + CD11b عثر حيدات التهابات بشكل حصري تقريبا في عدد السكان مرحبا CD45 (A ، D) ، بما يتفق مع تسلل من هذه الخلايا من محيطها. في المقابل ، لو تم العثور على Ly6C/G-F4/80 CD11b + الضامة بشكل حصري تقريبا في لو CD45 (B ، E) وCD45 NEG (G) من السكان ، بما يتفق مع النمط الظاهري المقيم. في تجارب عديدة ، ونحن لم يلاحظ خلايا CD45 مرحبا أو Ly6C / G + F4/80 + + CD11b حيدات التهابات في الدماغ من غير مصاب أو صورية العدوى ،الفئران تيد (لا تظهر البيانات).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نستخدم التدفق الخلوي بشكل روتيني لتحديد كلا من نوعية الخلية إعداد الدماغ التسلل ، والتمييز مجموعات مختلفة من الخلايا المناعية 2 و 9. في نقطة زمنية حادة ، لدينا أسلوب BILs غلة نسب عالية من التهابات داخل حيدات السكان CD45hi فضلا عن النسب العالية من السكان في الضامة CD45lo. هذا يشير إلى أن بقوة استجابة مناعية استنساخه داخل الدماغ تتسم طريقتنا.
هذه التقنية أهمية خاصة للتجارب التي تتطلب السكان جيدا تتميز الخلايا المناعية من مخ الفأر. وقد أجرينا تجارب نقل بالتبني سابقا عن طريق حقن الدماغ التسلل الكريات البيض في الفئران عن طريق حقن الوريد المضيف الذيل 7 ، ونحن لدينا تتميز BILs عبر مختلف التجارب في المختبر 9. لدينا BILs إعداد مفيد على نحو خاص في التجارب التي يجب أن تميز مجموعات مختلفة من الخلايا المناعية من خلايا الدماغ من المقيمين ، بما في ذلك المقيمين والخلايا الدبقية الصغيرة الضامة. تطبيق آخر لمصلحة يتضمن في الوقت الحقيقي RT - PCR تحليل الحمض النووي الريبي التي أجريت على مجموع معزولة عن إصابة 7 في BILs آخر أيام لتحديد مهام المستجيب 3. على سبيل المثال ، قمنا بقياس GAPDH ، B granzyme والجيش الملكي النيبالي في perforin BILs جمعها في آخر 7 أيام العدوى من الحيوانات والتي تعاني من نقص perforin - المصابين TMEV المختصة. وقد استخدمت ونحن أيضا لدينا BILs طريقة لتحديد كيفية NKG2D يسهم في إزالة TMEV من دماغ الفئران المصابة بشدة 4.
هناك العديد من الجوانب الحاسمة في الأسلوب. فمن الضروري لتحقيق جميع الحلول لدرجة حرارة الغرفة قبل إعداد لتجنب ضغوط لا داعي لها في الكريات البيض وضمان الفصل بين الكثافة المناسبة. الضغط على الكريات البيض يساهم في موت الخلايا ، مما يجعلها غير موثوق بها وخاصة بالنسبة للفي التجارب المجراة ، حيث يتم نقل السكان يعيشون adoptively من الخلايا في الحيوانات المضيفة. ونحن مصممون أيضا على أن استخدام Percoll الباردة ليس فقط التغيرات في كثافة التدرج متقطعة ، ولكن يؤثر أيضا على نوعية الكريات البيض. آخر عنصر حاسم هو التجانس ورقيقة كافية من أنسجة المخ. لقد وجدنا أن التجانس وعدم كفاية الخام النتائج أنسجة المخ بكميات وفيرة من حطام خلية اطلعت عليها المجهر والتدفق الخلوي. قد يؤدي أيضا حطام خلية من عدم توتير جناسة الدماغ مع مصفاة خلية بحجم مناسب. الاهتمام بالتفاصيل هو الصحيح رئيسي في إعداد BILs وافرة وكافية لمزيد من التجارب والتحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل عن طريق منحة من NS64571 NINDS (CLH) ، عن طريق منح التطوير الوظيفي في وقت مبكر من مايو كلينيك (CLH) ، وبواسطة هبة سخية من دونالد وفرانسيس Herdrich (CLH) نود أن نشكر تدفق مايو كلينيك الأساسية الخلوي للحصول على المساعدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalge Nunc international | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche Group | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbr–ck tissue grinder | Fisher Scientific | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Biosciences | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman Coulter Inc. | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman Coulter Inc. | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman Coulter Inc. | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | eBioscience | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | eBioscience | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
- Buenz, E. J., Howe, C. L.
- Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay. Cytometry A. 71, 170-173 (2007).
- Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis. J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).
- Deb, C., Howe, C. L. NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain. J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).
- Donovan, J., &, P. B. rown, , P.
- Donovan, J., Brown, P.
- Donovan, J., Brown, P.
- Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur. Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).
- Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination. J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).
- Lipton, H. L. Theiler's virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
