Genetik ve epigenetik Analizleri Parafin Gömülü Malzeme DNA Ekstraksiyon

Summary

Bu video formalin ile fikse parafine gömülü malzeme DNA ekstraksiyonu için protokol göstermektedir. Bu doku kesitlerinde ksilen ile deparafinize olduğu bir çok günlük bir prosedür, etanol ile sulandırılır ve sonraki gen-spesifik veya genom analizi için DNA arındırmak ve izole etmek için proteinaz K ile tedavi edilir.

Abstract

Hastalık gelişimi ve ilerlemesi kromozom düzenlenmeleri, kopya sayısı kazançlar ve kayıplar ve DNA metilasyon dahil olmak üzere sık sık genetik ve epigenetik sapmaları ile karakterizedir. Gelişmeler, bu tür mikroarray'ler yüksek verimli, genom profil teknolojileri, bu belirli değişikliklerin belirlenmesi ve tespit etmek için yeteneğimizi önemli ölçüde iyileştirilmiştir. Ancak olarak teknoloji geliştirmeye devam etmektedir, sınırlayıcı bir faktör örnek kalite ve yer durumu kalır. Ayrıca, takip klinik bilgi ve hastalık sonucu genellikle ilk örnek toplama yıl sonra tahsil edilir. Numuneler, onlarca yıllık, genellikle formalin ile fikse ve parafin (FFPE) yıl boyunca hastane arşivinde saklanır. Uygun ekstraksiyon yöntemi uygulandığında ise DNA, verimli ve etkili parafine gömülü dokulardan kurtarıldı olabilir. Yüksek kaliteli, düzgün bir şekilde korunmuş ve depolanan örneklerin çıkarılan DNA genetik ve epigenetik ^imzaları 1 normal ve hastalıklı dokuları ve üretim karşılaştırmalar için kantitatif testleri destek olabilir . , Parafine gömülü örnekleri, doku çekirdek veya microdissected doku DNA ayıklamak için, doku parafin erir ksilen tedavisi, tabi, ve ardından bir dizi etanol yıkar kullanarak rehidrate. Proteinler ve sonradan proteinaz K. lizis tamponu, sodyum dodesil sülfat (SDS) olarak denatüre edici ajanlar içerir, ^sindirimi 2. kolaylaştıran, ek, nükleazlar gibi zararlı enzimlerin sindirilir . Nükleik asitler, bifazik bir çözüm üretir tampon doymuş fenol ve yüksek hızda santrifüj kullanarak doku lizatı arınmış. DNA ve RNA, proteinler, lipidler ve polisakkaritler arası ve organik faz ise sekestre ise, üst sulu faza kalır. Sulu faz ve tekrarlanan fenol ekstraksiyon Tutma temiz bir örnek oluşturur. Fenol ekstraksiyon, RNaz A kirlenmesine neden olan RNA ortadan kaldırmak için eklenir. Ek fenol ekstraksiyon RNaz ile inkübasyon aşağıdaki A kalan herhangi bir enzim kaldırmak için kullanılır. Ayrıca sodyum asetat ve izopropanol çökeltileri DNA ve yüksek hızda santrifüj pelet DNA ve izopropanol çıkarma işlemini kolaylaştırabilir. Yağış taşınan Fazla tuzları sonraki enzimatik deneyleri ile müdahale, ancak% 70 etanol ile yıkanarak yeniden pelet DNA ³ santrifüj takip DNA çıkarılabilir. DNA, distile su veya seçim tampon yeniden askıya sayısal ve -20 ° C'de saklanan Arıtılmış DNA sonradan dahil downstream uygulamalarında kullanılan, ancak bunlarla sınırlı değildir, PCR, dizi karşılaştırmalı genomik hibridizasyon ⁴ (dizi CGH), denatüre DNA Immunoprecipitation (MeDIP) ve bütünleştirici bir doku / tümör örneklerinin analizi için izin sıralama.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. Usul notlar</p><ul><li> Ksilen ve fenol toksik kimyasallar ve bir fumehood ele alınmalıdır. Kullanmadan önce madde güvenlik bilgileri formuna (MSDS) bakın.</li><li> Ksilen bazı plastik erir, bu bileşiklerin tolere polipropilen tüpler kullanılmalıdır.</li><li> Özel ipuçları, dahili bir kömür stoper içerdiğini satın alınabilir. Bu pipet herhangi bir kauçuk parçaları çözme ksilen önler. Alternatif olarak, filtre ipuçları kullanılabilir.</li></ul><p class="jove_title"> 2. Parafin kaldırma</p><ol><li> Fumehood 800 ul ksilen (VWR, CABDH6216-4), parafin çözmek için 5 ila 15 dakika hafif sallayarak bir rocker örnek ve yer içeren etiketli tüpe ekleyin.</li><li> Pelet, 3 dakika boyunca bir mikrosantrifüj maksimum hız (14.000 rpm veya 16 000 xg) iplik örnek. Dikkatlice ksilen süpernatantı çekilme ve ksilen atık atmak için bir polipropilen tüp atmayın. Pelet rahatsız etmemek için dikkatli olun.</li><li> Ksilen yıkama adımları tekrarlayın ve 1 2until parafin tamamen çözülür. Bu doku örneği boyutuna bağlı olarak genellikle 2-3 yıkama gerektirir. Tamamen çözülmüş örnek yumuşak görünecek ve yapısal bütünlüğünü bazen kaybedersiniz. Örnek bütünlüğünü hafifçe bir pipet ucu ile tespit edilebilir.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Etanol rehidrasyon</p><ol><li>% 100 etanol (v / v) moleküler biyoloji notu etanol, vorteks 800 ul ekleyin, daha sonra mikrosantrifüj 14.000 rpm az 3 dakika boyunca dönerler. Pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, etanol süpernatantı.</li><li> 800 ul% 70 etanol (% 100 (v / v) distile su ile seyreltilmiş etanol (dH₂ O)), girdap ve 14.000 rpm'de 3 dakika spin. Dikkatlice etanol süpernatant kaldırmak.</li><li> 800 ul% 50 etanol (% 100 (v / v) distile su ile seyreltilmiş etanol (dH₂ O)), girdap ve 14.000 rpm'de 5 dakika spin. Pipetleme tarafından dikkatli bir şekilde, mümkün olduğu kadar etanol gibi çıkarın. Pelet rahatsız tam Rehidrate bir doku değil pelet yanı sıra kurutulmuş doku olarak bu noktada son derece dikkatli olun.</li><li>, 5 dakika etanol süpernatant, hava-kuru pelet kaldırarak sonra dikkatli üstü kuru değil.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Doku sindirim</p><ol><li> Lizis Tampon 200-500 ul (aşağıdaki formül) ekleyin. Pelet bir pipet veya vorteks kullanarak yeniden askıya aldı. Bu noktada Ekstra çaba doku tamamen yeniden askıya örnek daha eksiksiz bir sindirim ve DNA'nın daha iyi bir verim neden olacak.</li><li> 56 örnekleri inkübe ° C su banyosu veya ısıtma bloğu.</li><li> Doku çekirdeği, başak proteinaz K (20 mg / ml stok solüsyonu, Invitrogen, AM2548) sabah ve akşam 20 ul.</li><li> Doku tamamen eriyene kadar 2 ila 5 gün boyunca sindirim yukarıdaki adımları tekrarlayın.</li></ol><p class="jove_step"> Lizis Tampon</p<ul><li> 10 mM Tris-HCl pH: 8.0</li><li> 100 mM EDTA pH 8.0</li><li> 50 mM NaCl</li><li>% 0.5 SDS</li><li> 200 mg / ml proteinaz K (kullanmadan hemen önce ekleyin)</li></ul><p class="jove_title"> 5. DNA kadar temiz</p><ol><li> Fenol doymuş (Fisher, BP1750I-400) ve tersine çevirerek karıştırın eşit miktarda bir tampon ekleyin. Mikrosantrifüj içinde 14.000 devirde en az 5 dakika Spin.</li><li> Yeni bir tüp sulu katman aktarın. Interfaz Not: beyaz malzeme çok şey var?</li><liInterfaz (genellikle 3 veya daha fazla kez) netleşene kadar sulu fraksiyonu 1. ve 2. adımları tekrarlayın. Ekstraksiyon geri gerçekleştirin * interfaz nihai verimi artırmak için bulanık.</li><liÖrnek çıkartılan sulu kesir izoamil alkol (25:24:1) (Fisher, BP1752I-400): kloroform: interfaz> sonra, eşit miktarda fenol ekleyin. 5 dakika karıştırın ve sonra 14.000 rpm'de 5 dakika döndürün. Artık daha fazla fenol ve sulu tabakanın çıkarılması kolaylaştırılması, interfaz keskinleştirir Thisreduces</li><li> 37 1 saat süreyle 100 mg / ml sulu katman yeni bir tüp çıkarın ve treatwith RNaz A ° C</li><li> Kalan RNaz A kaldırmak ve sulu fraksiyonu toplamak için 1. ve 4. adımları tekrarlayın. Daha ilk lizat kaldırmak için çok daha az protein olması gerektiği gibi sadece 1 veya 2 tampon doymuş fenol adımları gerekir gerekir.</li></ol><p class="jove_content"> * Ekstraksiyon dH 50-100 ul eklemek gerçekleştirmek için₂ 0 interfaz ve organik kısmını içeren numune tüpü. Karıştırın ve 5 dakika mikrosantrifüj 14.000 rpm'de örnek spin Tüpü ters çevirin. Sulu faz toplayın ve daha önceden edinilmiş sulu çıkarma ekleyin. Interfaz netleşene kadar ekstraksiyon tekrar devam edin.</p><p class="jove_title"> 6. DNA yağış</p><ol><li> Toplanan sulu tabakanın hacmini tahmin edin.</li><li> 1 / 10 hacim 3 M sodyum asetat, pH 5.2 ve% 100 izopropanol (v / v) moleküler biyoloji notu (veya% 100 etanol 2.5 cilt) 1 hacim ekleyin.</li><li> İyice karıştırın ve 30 dakika veya gece için buz üzerinde veya -20 ° C derin dondurucuya koymak.</li><li4> Spin maksimum hızda (14.000 rpm) ° C 10 dakika için mikrosantrifüj</li><li> Süpernatantı atın.</li><li>% 70 buz soğuk etanol istenmeyen tuzları kaldırmak için pelet yıkayın.</li><li> Tercih tampon yeniden askıya pelet (genellikle dH₂ O).</li></ol><p class="jove_title"> 7. DNA sayısallaması</p><ol><li> DNA konsantrasyonu ölçmek. A260 A280 oranı ~ 1,8 olmalıdır. Küçük miktarda DNA, NanoDrop spektrofotometre kullanarak ölçüm tercih edilmektedir.</li><li> Takiben nicelik, jel elektroforezi örnek DNA kalitesini test ve kirlenmesine neden olan RNA tamamen bozulmuş olup olmadığını belirlemek için yapılmalıdır.</li><li> Yüksek kalite edilen DNA downstream uygulamalar için uygundur, ya da daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de saklanabilir. RNA hala örnek varsa, DNA kadar temiz ve yağış adımları yineleyin ve yeniden miktarını ve kalitesini örneklerinin hak.</li></ol>

Discussion

Histopatolojik analizi ve tanı için biyopsi veya cerrahi olarak eksize dokuların uzun süreli saklanması için genellikle formalin sabit ve parafin (FFPE). Bu örneklerin DNA ayıklamak için, hastalığın genetik temeli anlamak giderek artan bir ilgi ile genomik analiz ve translasyonel çalışmaları için kullanılabilir tanı malzeme paha biçilmez bir kaynak temsil eder. Nükleik asitlerin ağır ⁶ bağlayan protein, nükleik asit ve protein-protein çapraz tarafından değiştirilmiş olabilir Tarihsel FFPE örnekleri moleküler analiz için uygun bir kaynak sayılmaz . Ancak, proteaz sindirim, PCR, dizi CGH, sıralama ve metilasyon profili de dahil olmak üzere alt analizler için uygun olan nükleik asitlerin parçalanmış bültenleri keşfi genetik analiz ⁶ için bu değerli örneklerinin kullanımı sağlar.

Parafine gömülü dokulardan DNA ekstraksiyonu DNA arındırmak için diferansiyel çözünürlüğü dayanmaktadır sağlam bir işlemdir. Çıkarılan DNA nitelik ve nicelik ve sonraki DNA amplifikasyon başarı çıkarma sırasında ve sonrasında, önce bir dizi parametre bağlıdır. Bunlar, ancak bunlarla sınırlı değildir: doku tipi ve miktarı, doku korunması için kullanılan fiksatif türü, fiksasyon süresi, yaş parafin blok ve saklama koşulları gibi istenen DNA segmentinin uzunluğu ^1,7 amplifiye. Çözünmemiş parafin kötü örnek kalite ve PCR inhibisyonu dokusundan parafin kaldırılması başarılı çıkarılması için en kritik adımdır.

Materials

Name	Company	Catalogue Number	Comments
Xylene	VWR	CABDH6216- 4	–
1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes	Sorenson BioScience	11510	–
Spectrafuge 16M Microcentrifuge	Labnet	C0160-B	–
Lysis Buffer	–	–	10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K
Proteinase K Stock Solution	Invitrogen	AM2548	20 mg/ml
Proteinase K Stock Solution
Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9	Fisher	BP1750I-400	–
Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0)	Fisher	BP1752I-400	–
RNase A	Roche	10109169001	100mg
3M sodium Acetate pH 5.2	–	–	40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave
ND 3300 Spectrophotometer	NanoDrop	–	–