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Biology

नाइट्रिक ऑक्साइड और कोशिकाओं से superoxide इलेक्ट्रॉन paramagnetic अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा कट्टरपंथी आयनों की जांच स्पिन जाल का उपयोग

Published: August 18, 2012 doi: 10.3791/2810
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1The Davis Heart and Lung Research Institute, The Ohio State University, 2Department of Pharmacology, College of Medicine, The Ohio State University

Summary

इलेक्ट्रॉन समचुंबक अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (EPR) गोजातीय महाधमनी endothelial और मानव लौह (द्वितीय) एन मिथाइल-D-glucamine Dithiocarbamate, Fe (MGD) का उपयोग कर neutrophils से और superoxide कट्टरपंथी आयनों कोशिकाओं से नाइट्रिक ऑक्साइड का पता लगाने के लिए नियोजित किया गया था

Protocol

1. गोजातीय महाधमनी endothelial कोशिकाओं (BAEC) की संस्कृति

  1. उचित सड़न रोकनेवाला तकनीक पीछा किया गया था.
  2. एक पानी स्नान, 37 एंटीबायोटिक दवाओं के बिना गर्म मध्यम डिग्री सेल्सियस

नोट: मध्यम फिनोल 4.5 / जी एल डी - ग्लूकोज के साथ मुक्त है Dulbecco संशोधित है ईगल मध्यम (DMEM) के होते हैं, 4 मिमी एल-glutamine, 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड होता है, 10% भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम और 2.5 के साथ पूरक मिलीग्राम / एल endothelial वृद्धि कारक.

  1. T75 कुप्पी युक्त कोशिकाओं इनक्यूबेटर से निकालें और 70% इथेनॉल के साथ फ्लास्क के यह हुड अंदर रखने से पहले सतह को साफ.
  2. पुराने माध्यम का उपयोग कर एक चूषित्र निकालें और 5 मिलीग्राम है Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) के साथ दो बार धोना.
  3. Trypsin की 2 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं के लिए 4-5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए अलग जबकि माइक्रोस्कोप के अंतर्गत समय - समय पर निरीक्षण करते हैं.
  4. मध्यम के 3 मिलीग्राम जोड़ें और बार - बार अलग टी के लिए एक विंदुक का उपयोग मिश्रणवह कोशिकाओं और एक भी निलंबन बनाएँ.
  5. एक 15 मिलीग्राम और 5 मिनट के लिए 121 जी में ट्यूब अपकेंद्रित्र trypsin के साथ मध्यम के 5 मिलीलीटर स्थानांतरण.
  6. निकालें सतह पर तैरनेवाला एक हवा खींचने की मशीन का उपयोग कर. DPBS की 5 मिलीलीटर जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से. 5 मिनट के लिए 121g में अपकेंद्रित्र.
  7. सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन) और मध्यम के 6 मिलीलीटर जोड़कर सेल गोली फिर से निलंबित.
  8. 6 अच्छी तरह से एक थाली पर, प्रत्येक के लिए सेल निलंबन के 1 मिलीग्राम जोड़ने अच्छी तरह से तो मध्यम के 1 मिलीग्राम जोड़ें. एक विंदुक का उपयोग निलंबन मिश्रण.
  9. लेबल थाली और 37 पर रात में सेते हैं डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.

2A. सं BAEC सेल के साथ जांच

  1. उचित सड़न रोकनेवाला तकनीक पीछा किया गया था.
  2. इनक्यूबेटर 6 अच्छी तरह से थाली निकालें और पहले अच्छी तरह से मध्यम महाप्राण (व्यंजन). 1 मिलीग्राम DPBS के साथ कोशिकाओं को दो बार धो.
  3. 1.9 मिमी लौह (द्वितीय) सल्फेट heptahydrate (FeSO 4 0.7 एच 2 हे, हौसले में 0.8 मिलीग्राम भंग द्वारा तैयार की 210 μl जोड़ें1 2 CaCl और MgCl 2 के साथ मिलीलीटर DPBS) और की अमोनियम एन मिथाइल-D-glucamine Dithiocarbamate (MGD, 500 μl DPBS में 2 CaCl और MgCl 2 के साथ 2.7 मिलीग्राम भंग हौसले से तैयार) 210 μl 01:07 के अनुपात का उपयोग (नोट: यह अनुपात जहां अतिरिक्त MGD प्रयोग किया जाता है. पारंपरिक Fe के 2 + MGD तथ्य यह है कि 3 Fe के लिए उपज MGD अतिरिक्त MGD की उपस्थिति में अधिकतम है के कारण जटिल तैयार करने के लिए नियोजित किया गया है के अलावा समाधान में एस्कॉर्बेट Fe 2 को स्थिर MGD सं-Fe 3 के बाद से आवश्यक गठन + - MGD endogenously EPR नहीं Fe के detectable 2 के एस्कॉर्बेट, उदकुनैन,, या ऊपर की रूपांतरण दक्षता के साथ सिस्टीन MGD से कम नहीं है 99.9% करने के लिए .. 2 Fe के कम स्पिन प्रतिचुंबकीय के राज्य + सं एक कम तापमान उपकरण की आवश्यकता के बिना फ्लैट सेल या केशिका ट्यूब का उपयोग करके) 15 का पता लगाने की अनुमति देता है.
  4. भंवर परिणामस्वरूप निलंबन अच्छी तरह से और 4.6 μ जोड़नेकैल्शियम ionophore के एल (CAI) (1 मिलीलीटर DMSO के 1 मिलीग्राम भंग 1.9 मिमी एक शेयर समाधान से तैयार).
  5. भंवर फिर से समाधान और 37 में सेते हैं ° सी क्रम में 36 मिनट के लिए आगे कोई 3-Fe की कमी EPR कोई 2-Fe + - MGD से detectable + - MGD अनुमति देने के लिए.
  6. Eppendorf ट्यूब और एक EPR फ्लैट सेल (या एक 50 μl केशिका ट्यूब) करने के लिए स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला (425 μl) ले लीजिए.
  7. माइक्रोवेव आवृत्ति: EPR अधिग्रहण मापदंडों 9.8 गीगा, केंद्र क्षेत्र: 3427 जी, मॉडुलन आयाम: 6.0 जी, झाडू चौड़ाई: 100 जी, रिसीवर लाभ: 1 x 10 5, माइक्रोवेव शक्ति मेगावाट 10, स्कैन की कुल संख्या: 121; झाडू समय: 10 और लगातार समय: एमएस 20 (ध्यान दें: के बाद से पैरामीटर एक साधन और प्रयोगात्मक शर्तों से दूसरे करने के लिए अलग अलग होंगे, इसलिए केवल केंद्र क्षेत्र, आवृत्ति और आयाम मॉडुलन सबसे महत्वपूर्ण मापदंडों पर विचार कर रहे हैं.)
  8. कमरे के तापमान पर स्पेक्ट्रा रिकार्ड और स्पेक्ट्रा 2 - डी integ गयापृष्ठभूमि शोर और आधारभूत Bruker WinEPR डाटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर या अन्य डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सही कम मूल्यांकन किया गया. अभिवर्तन गठन की मात्रा का ठहराव के लिए, एकाग्रता बनाम संकेत तीव्रता (या क्षेत्र) के मानक भूखंडों एक सं दाता तस्वीर का उपयोग करते हुए निर्माण किया जा सकता है.

2B. एनोस uncoupling प्रयोग

  1. इनक्यूबेटर 6 अच्छी तरह से थाली निकालें और दूसरी अच्छी तरह से मध्यम महाप्राण (व्यंजन) और 1 मिलीग्राम DPBS के साथ दो बार धोना.
  2. Peroxynitrite दाता, 5 अमीनो-3-(4-morpholinyl) -1,2,3 के oxadiazolium है क्लोराइड (SIN-1) से 16 एनोस ताल्लुक तोड़ देना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. 0.5 मिमी पाप 1 (एम आर 206.6 छ / mol 10 मिमी स्टॉक हौसले पीबीएस के 500 μl में नहीं / Ca मिलीग्राम आयनों के साथ 1 मिलीग्राम पाप-1 भंग द्वारा तैयार समाधान से) और कमजोर करने के लिए 2 मिलीग्राम के साथ DPBS 100 μl जोड़ें और 10% FBS.
  3. 37 पर 2 घंटे के लिए सेते हैं डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
  4. इनक्यूबेटर से थाली निकालें और DPBS के साथ दो बार धोना.
  5. 210 μl जोड़ें2.8 मिमी FeSO 4 0.7 एच 2 हे और 19.6 मिमी के 210 μl MGD हौसले से ऊपर उल्लेख किया प्रक्रिया के अनुसार तैयार है.
  6. भंवर समाधान और 1.9 मिमी कै 4.6 μl जोड़ने.
  7. भंवर फिर से समाधान और 37 ° सेल्सियस पर 36 मिनट के लिए सेते हैं.
  8. Eppendorf ट्यूब और एक EPR फ्लैट सेल करने के लिए स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला (425 μl) ले लीजिए.
  9. माइक्रोवेव आवृत्ति: EPR अधिग्रहण मापदंडों 9.8 गीगा, केंद्र क्षेत्र: 3427 जी, मॉडुलन आयाम: 6 जी, झाडू चौड़ाई: 100 जी, रिसीवर लाभ: 1 x 10 5, माइक्रोवेव शक्ति: 10 मेगावाट, स्कैन की कुल संख्या: 121; 10 एस, और लगातार समय: झाड़ू समय 20 ms.
  10. और स्पेक्ट्रा रिकार्ड और 2 - डी स्पेक्ट्रा पृष्ठभूमि शोर और आधारभूत सही जैसा कि ऊपर उल्लेख किया कम करने के लिए एकीकृत किया गया था.

3. 2 हे (PMNs की जांच - Polymorphonuclear neutrophils से)

  1. Neutrophils मानव रक्त के नमूने से अलग थे के रूप में पहले 17 में वर्णित.
  2. पीबीएस में एम 1 * DMPO के एक शेयर 0.1 diethylenetriamine - pentaacetic एसिड (DTPA) मिमी समाधान युक्त बनाओ. DMPO 25-29 के एक पिघल बिंदु है डिग्री सेल्सियस तो यह अधिक सुविधाजनक है एक गिलास (शीशी नोट में के तरल DMPO (घनत्व ~ 1.02 ग्राम / एमएल 25 डिग्री सेल्सियस) विंदुक: शुद्ध DMPO के बाद से वजन के लिए प्लास्टिक की शीशियों का उपयोग नहीं प्लास्टिक के साथ प्रतिक्रिया करता है). फ्रोजन DMPO शीशी (गर्म पानी चलाने के रूप में विघटित हो सकता है DMPO नहीं नोट) पर ल्यूक गर्म पानी चलाकर पिघल जा सकता है.
  3. यह महत्वपूर्ण है के बाद से उच्च शुद्धता DMPO (> 99%) का उपयोग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्पिन जाल कुछ समचुंबक दोष होते हैं, और इसलिए, यह सिर्फ अकेले DMPO समाधान के EPR स्पेक्ट्रम के इस मामले में (10 मिमी) को चलाने के लिए जरूरी है. यह महत्वपूर्ण है कि कोई पृष्ठभूमि संकेत स्पष्ट है (चित्रा 3A देखें) है.
  4. DMSO में phorbol-12-myristate-13-एसीटेट (PMA) (1 मिलीग्राम / एमएल) का स्टॉक समाधान तैयार. 10 μg / पीबीएस में मिलीलीटर समाधान गिराए द्वारा aliquots बनाओ.
  5. एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब, 0.6 मिलीलीटर की कुल मात्रा के साथ के अनुक्रम का पालन करके एक समाधान तैयार: ~ 10 PMN के 6 मिलीग्राम प्रति कोशिकाओं (1 मिलीग्राम / एमएल) डी ग्लूकोज और albumin (1 मिलीग्राम / एमएल), 10 से मिमी DMPO और 0.2 μg / PMA की मिलीलीटर (नोट: PMA कट्टरपंथी उत्प्रेरक है और पिछले जोड़ा जाना चाहिए).
  6. समाधान एक EPR फ्लैट सेल करने के लिए स्थानांतरण.
  7. केंद्र क्षेत्र 9.8 गीगा EPR अधिग्रहण मापदंडों शर्तों रहे हैं: 3486 जी, मॉडुलन आयाम: 0.5 ग्राम, झाडू चौड़ाई: 100 जी, रिसीवर लाभ: 5 x 5 10, स्कैन की कुल संख्या: 10, झाडू समय: 30 है, माइक्रोवेव आवृत्ति: माइक्रोवेव शक्ति: 20 मेगावाट, और लगातार समय: 81 एमएस Adduct गठन की मात्रा का ठहराव के लिए, एकाग्रता बनाम संकेत तीव्रता (या क्षेत्र) के मानक भूखंडों गति या 3 - कार्बोक्जिलिक एसिड PROXYL के रूप में स्थिर nitroxides का उपयोग करते हुए निर्माण किया जा सकता है.

* DMPO के उपयोग पर महत्वपूर्ण नोट: एक फ्लैट सेल का उपयोग करके, एक सेल घनत्व बढ़ाने के लिए और जिससे संकेत में वृद्धि कर सकते हैंस्पिन अभिवर्तन लेकिन 2 हे की आधा जीवन की तीव्रता • - DMPO की अभिवर्तन कम है (1/2 टी ~ 1 मिनट) जो DMPO-OH के लिए मिटता. DMPO EMPO BMPO, या DEPMPO के एक ही सांद्रता जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 1 टी / 2 ~ 8 और 14 मिनट, क्रमशः के साथ बढ़ा अभिवर्तन स्थिरता के लिए कर रहे हैं का उपयोग कर प्रतिस्थापित किया जा सकता है.

4. प्रतिनिधि परिणाम

स्पिन नहीं कट्टरपंथी फँसाने 2 + MGD 2A चित्रा. Fe और 2B का उपयोग किया गया था 2 Fe से कोई EPR संकेत बताते हैं - MGD या 2 Fe के मिश्रण कै साथ MGD, यह दर्शाता है कि कोई नहीं पृष्ठभूमि संकेत इन अभिकर्मकों से निकलती है. कै साथ उत्तेजना पर BAEC नहीं है जो 2 Fe के साथ प्रतिक्रिया विज्ञप्ति स्पिन अभिवर्तन करना, कोई 2-Fe + - MGD फार्म + MGD, और एक एन = 12.66 जी की hyperfine बंटवारे निरंतर (hfsc) मूल्य और के साथ एक विशेषता triplet संकेत से पता चलता है छ छ = 2.040 का कारक है. (चित्रा 2C). hfसुप्रीम कोर्ट मूल्य WINSIM अनुकार कार्यक्रम है कि, NIEHS EPR सॉफ्टवेयर डेटाबेस वेबसाइट से डाउनलोड किया जा सकता का उपयोग करके निर्धारित किया गया था. प्रयोगात्मक hfsc 2 अभिवर्तन + MGD सं-Fe के लिए एक एन = 12.70 और जी = जी 2.041 18 के साहित्य मूल्य के साथ संगत है. इसी तरह, BAEC पर पाप - 1 के प्रभाव सं एनोस के लिए कारण उत्पादन uncoupling के रूप में चित्र 2 डी में दिखाया उतारा.

पहचान - DMPO स्पिन जाल • ओ 2 के लिए इस्तेमाल किया गया था. अकेले DMPO संकेत नहीं दे के रूप में इस बात की पुष्टि करता है कि स्पिन जाल समचुंबक दोष से मुक्त है चित्रा 3A में दिखाया था 3B चित्रा DMPO की स्पेक्ट्रम और PMNs के है ही, और इसी तरह, वहाँ कोई detectable संकेत सुझाव है कि DMPO पैदा नहीं करता है. एंजाइम NADPH oxidase के सक्रियण. चित्र 3C PMN PMA के द्वारा उत्तेजना पर मनाया EPR संकेत से पता चलता है. एक एन = 14.71 जी, एक और यह संकेत hfsc मूल्यों निर्धारित किया गया हैबीटा, एच = 11.40 जी और γ - एच = 1.25 जी, और एक एन = 14.3 जी, β-एच = 11.7 जी और γ - एच का साहित्य मूल्यों = 1.3 DMPO-O के लिए 19 जी के साथ संगत कर रहे हैं एच 2 अभिवर्तन.

चित्रा 1
चित्रा 1 neutrophils और BAEC EPR स्पिन फँसाने का उपयोग करने से कण का पता लगाने के लिए फ्लो चार्ट. (ए) PMNs DMPO और PMA के साथ मिश्रित थे, और जिसके परिणामस्वरूप मिश्रण डाटा अधिग्रहण के लिए एक EPR फ्लैट सेल करने के लिए स्थानांतरित. (बी) एक थाली पर BAEC बड़े हो रहे थे, और DPBS से धोया. स्पिन जाल (MGD) Fe 2 के साथ कै साथ जोड़ा गया है. समाधान अच्छी तरह से मिला था और incubated रहे. मिश्रण EPR डाटा अधिग्रहण के लिए एक EPR फ्लैट सेल करने के लिए स्थानांतरित किया गया था.

चित्रा 2
चित्रा 2. बी से EPR का पता लगानेएईसी. (ए) 2 Fe के स्पेक्ट्रम MGD केवल (बी) 2 + MGD कै + केवल Fe के स्पेक्ट्रम. (सी) Triplet 2 Fe के द्वारा नहीं फँसाने से उत्पन्न स्पेक्ट्रम MGD का उपयोग कोशिकाओं कै उत्तेजित. (डी) स्पेक्ट्रम 0.5 मिमी पाप 1 कोशिकाओं के इलाज के कारण सं उत्पादन में कमी दिखा.

चित्रा 3
चित्रा 3. DMPO हे एच 2 सक्रिय neutrophils से EPR का पता लगाने. (ए) 10 मिमी DMPO केवल स्पेक्ट्रम. (बी) PMN के 10 मिमी DMPO की उपस्थिति में अकेले स्पेक्ट्रम. (सी) PMN के स्पेक्ट्रम 10 मिमी DMPO की उपस्थिति में PMA के द्वारा सक्रिय है.

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Discussion

EPR स्पिन फँसाने बढ़ाता है और मुक्त कण की पहचान के लिए जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में नियोजित किया गया है. स्पिन फँसाने अत्यधिक संवेदनशील, एनएम से इस प्रकार यह जैविक प्रणालियों में आवेदन के लिए उपयुक्त बनाने माइक्रोन को लेकर सांद्रता में कण का पता लगाने में सक्षम है. समचुंबक अभिवर्तन, सं-Fe + MGD 2 के गठन EPR के माध्यम से नहीं का पता लगाने के आधार है. 2 फ़े सं तेजी से ~ की दर 10 6 एम -1 -1 में 18 के साथ + MGD प्रतिक्रिया करता है. सं-Fe 2 अभिवर्तन + MGD एक लंबे समय तक आधा जीवन है और अत्यधिक स्थिर है. वास्तव में, एक 24 घंटे के भीतर EPR स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण के बाद नमूने -80 पर समाधान ठंड से एकत्र किया गया है सकते हैं डिग्री सेल्सियस संकेत तीव्रता (अप्रकाशित) में महत्वपूर्ण खोने के बिना + MGD सं-Fe 2 युक्त. 2 Fe के नुकसान MGD है कि यह हवा संवेदनशील है और आमतौर पर मिश्रण के 5 या अधिक ligand के दाढ़ समकक्ष करने की आवश्यकता हैFe (द्वितीय). Fe के 2 ऑक्सीकरण Fe के लिए 3 + MGD हवा से MGD अपरिहार्य है और मुश्किल से नियंत्रण है, तथापि, इन विट्रो में और vivo में प्रणालियों में, 3 + MGD गठन अभिवर्तन के सं-Fe जैविक reductants द्वारा EPR कम है detectable अभिवर्तन सं-Fe 2 + 15 MGD, इसलिए एस्कॉर्बेट इसके अलावा के लिए की जरूरत है छोड़े गए किया जा सकता है.

जैविक nitrone स्पिन जाल का उपयोग कर प्रणाली में EPR भी करने के लिए • ओ 2 का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक उदाहरण के रूप में, चित्रा 3C • हे 2 स्पिन DMPO फँसाने से पता चलता है PMA-सक्रिय PMN से उत्पन्न. स्पिन जाल के रूप में DMPO का उपयोग करने का एक नुकसान यह है कि 2 हे की दर • 2 -/HO • DMPO करने के लिए इसके अलावा तटस्थ पीएच जो DMPO की उच्च सांद्रता के उपयोग की आवश्यकता पर बहुत धीमी गति से (<1 एम -1 एस -1) ( अनुप्रयोगों जैविक स्पिन फँसाने के लिए 10-100 मिमी). इसके अलावा, DMPO हे एच 2 आधा जीवन छोटा है (<1 मि) 20 </> समर्थन जो DMPO-OH में β हाइड्रोजन की उपस्थिति की वजह से मिटता है, और लक्ष्य विशिष्टता अस्पष्ट सेल से कट्टरपंथी उत्पादन की साइट का निर्धारण करने का अभाव है. • ओ 2 में सफलता का पता लगाने में इस्तेमाल किया जा रहा है कोशिकाओं के प्रकार पर निर्भर करता है. उदाहरण के लिए, उत्तेजना पर मानव न्युट्रोफिल 2 हे की काफी प्रवाह उत्पन्न • जो आसानी से DMPO का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है लेकिन सावधानी जब कोशिकाओं के अन्य प्रकार के साथ काम किया जाना चाहिए जहां कट्टरपंथी उत्पादन काफी कम (जैसे, endothelial या उपकला कोशिकाओं) मजबूत है. कई nitrones 2 हे आधे जीवन को बढ़ाने के लिए विकसित किया गया है • 7-8 की आधा जीवन 12 मिनट, 13, और DEPMPO जो लंबे समय तक का आधा जीवन देता साथ EMPO और BMPO का उपयोग जैसे अभिवर्तन 14 21 मिनट. हालांकि, • ओ 2 के साथ फँसाने इन स्पिन जाल की स्पिन की दर अभी भी DMPO करने के लिए तुलना में धीमी गति से रहते हैं, और इसलिए अभी भी उच्च concentra के उपयोग की आवश्यकता हैtion के स्पिन जाल. • - बेतरतीब ढंग से एक सह - अभिकर्मक के रूप में methylated β-cyclodextrin (मुझे - β सीडी) भी स्पिन 2 हे लिए nitrones की में फँसाने की क्षमता बढ़ाने के नियोजित किया गया है का उपयोग. अलग thylakoid झिल्ली और द्वितीय Photosystem कणों का उपयोग कर उदाहरण के लिए, 22 Snyrychova संकेत उच्च तीव्रता और EMPO हे एच 2 के लिए अभिवर्तन स्थिरता अकेले EMPO की तुलना में मुझे β - सीडी की उपस्थिति में पता चला. यह दृढ़ता से संकेत और मुझे β - सीडी की उपस्थिति या अनुपस्थिति में nitrone हे एच 2 से उत्पन्न तीव्रता तुलना करने के लिए सिफारिश की है. इसके अलावा, स्पिन जाल का लक्ष्य विशिष्टता भी एक सीमा है. अधिक सुधार स्पिन जाल है कि उनकी 2 हे गरीब जेट को संबोधित विकसित करने के प्रयास, अब कम आधे जीवन अभिवर्तन और एक आणविक डिजाइन में लक्ष्य विशिष्टता 23-26 चल रहा है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम NIH राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान अनुदान HL81248 RO1 द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenol free DMEM medium
High glucose 1X		 GIBCO 31053
0.25% Trypsin- EDTA GIBCO 25200
L-Glutamine Fisher Scientific BP379-100
MEM Non Essential Amino acids GIBCO 11140
Fetal Bovine serum Atlanta Biologicals S11550
Endothelial Growth factor Millipore 02-102
CaI Enzo Life Sciences A-23187 Dissolve in DMSO
SIN-1 Enzo Life Sciences BML-CN245-0020
DMPO Dojindo Laboratories D048-10
FeSO4.7H2O Sigma Aldrich 215422-250G Dissolve in PBS with Ca and Mg
MGD Enzo Life Sciences ALX-400-014-M050 Dissolve in PBS with Ca2+ and Mg2+
BAEC cells Cell Systems 2B2-C75
DMSO Fisher Scientific BP231-100
DPBS Sigma Aldrich D8537
DPBS with CaCl2 and MgCl2 Sigma Aldrich D8662
Phorbol-myristate acetate (PMA) Sigma Aldrich 79346-1MG

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References

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आण्विक जीवविज्ञान 66 अंक सेलुलर जीव विज्ञान भौतिकी बायोफिज़िक्स स्पिन जाल एनोस ROS superoxide नहीं EPR
नाइट्रिक ऑक्साइड और कोशिकाओं से superoxide इलेक्ट्रॉन paramagnetic अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा कट्टरपंथी आयनों की जांच स्पिन जाल का उपयोग
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Gopalakrishnan, B., Nash, K. M.,… More

Gopalakrishnan, B., Nash, K. M., Velayutham, M., Villamena, F. A. Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps. J. Vis. Exp. (66), e2810, doi:10.3791/2810 (2012).

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