Summary
Electron paramagnetisk resonans (EPR) spektroskopi ble ansatt for å oppdage nitrogenoksid fra storfe aorta endotelceller og superoxide radikal anion fra menneskelige nøytrofile med jern (II)-N-metyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe (MGD)
Abstract
Reaktivt nitrogen / oksygen arter (ROS / RNS) ved lave konsentrasjoner spille en viktig rolle i å regulere celle funksjon, signalering, og immunrespons, men i uregulerte konsentrasjoner er skadelig for celleviabilitet 1, 2. Mens levende systemer har utviklet seg med endogene og kosttilskudd antioksidant forsvarsmekanismer for å regulere ROS generasjon, er ROS produsert fortløpende som naturlig biprodukter av normal metabolisme av oksygen og kan forårsake oksidativ skade på biomolekyler som resulterer i tap av protein funksjon, DNA kløv, eller lipid peroxidation tre, og til slutt til oksidativt stress fører til celle skade eller død 4.
Superoxide radikal anion (O 2 • -) er den viktigste forløper for noen av de mest oksiderende arter som er kjent for å eksistere i biologiske systemer som peroxynitrite og hydroksyl radikaler. Den generasjonen av O 2 • - signaliserer første tegn på oksidativt burst, og derfor jegts deteksjon og / eller deponering i biologiske systemer er viktig. I denne demonstrasjonen, O 2 • - ble generert fra polymorfnukleære nøytrofile (PMNs). Gjennom kjemotaktisk stimulering med phorbol-12-myristate-13-acetat (PMA), genererer PMN O 2 • - via aktivering av nikotinamid adenindinukleotid fosfat (NADPH) oksidase 5.
Nitrogenoksid (NO) syntase som kommer i tre isoformer, som induserbar-, nerve-og endotelial-NOS, eller iNOS, nNOS eller Enos, henholdsvis katalyserer omdanning av L-arginin til L-citrulline, bruker NADPH å produsere NO 6 . Her genereres vi NO fra endotelceller. Under oksidativt stress forhold, kan Enos for eksempel bytte fra produsere NEI til O 2 • - i en prosess som kalles frakopling, som antas å være forårsaket av oksidasjon av heme 7 eller co-faktor, tetrahydrobiopterin (BH 4) 8.
Det er bare fåpålitelige metoder for påvisning av frie radikaler i biologiske systemer, men er begrenset av spesifisitet og sensitivitet. Spin fangst blir ofte brukt for identifisering av frie radikaler og innebærer tillegg reaksjon på en radikal til en spin felle danner en vedvarende spin addukt som kan påvises ved elektronmikroskopi paramagnetisk resonans (EPR) spektroskopi. De ulike radikale addukter viser karakteristiske spekteret som kan brukes til å identifisere de radikale som skapes, og kan gi et vell av informasjon om natur og kinetikk av radikal produksjon ni.
De sykliske nitrones og 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oksid, 10 DMPO, den phosphoryl-substituerte DEPMPO 11, og ester-substituert, EMPO 12 og BMPO 13, har vært mye brukt som spin traps - sistnevnte spinn feller stille lenger halveringstid for O 2 • - addukt. Iron (II)-N-metyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe (MGD) 2 </ Sub> er vanlig å felle NO grunn av høy forekomst av addukt formasjon og den høye stabiliteten i spinn addukt 14.
Protocol
1. Kultur av storfe aorta endotelceller (BAEC)
- Riktig aseptiske teknikker ble fulgt.
- I et vannbad, varm medium uten antibiotika ved 37 ° C.
Merk: medium består av fenol gratis Dulbecco modifiserte Eagle medium (DMEM) med 4,5 g / L D-glukose, 4 mm L-glutamin, 1% ikke-essensielle aminosyrer, supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS) og 2,5 mg / L endotelial vekstfaktor.
- Fjern T75 flasken inneholder celler fra inkubatoren og rengjør overflaten av kolben med 70% etanol før du legger den inni hetten.
- Fjern det gamle mediet ved hjelp av en vifte og vask to ganger med 5 ml Dulbecco sin fosfatbuffer saltvann (DPBS).
- Tilsett 2 ml trypsin og vente 4-5 min for cellene å løsne mens periodisk inspeksjon under mikroskopet.
- Legg 3 ml av medium og gjentatte ganger bland med en pipette til egen than celler og skape en enda suspensjon.
- Overfør 5 ml medium med trypsin til en 15 ml rør og sentrifuger ved 121 gr i 5 min.
- Fjern supernatanten ved hjelp av en vifte. Tilsett 5 ml DPBS og bland godt. Sentrifuger ved 121g i 5 min.
- Aspirer supernatanten og re-suspendere cellepelleten ved å legge til 6 ml av medium.
- På en seks-brønns plate, tilsett 1 ml av den cellesuspensjon til hver brønn og tilsett 1 ml av mediet. Bland suspensjonen med en pipette.
- Merk platen og inkuber natten ved 37 ° C og 5% CO 2.
2A. Påvisning av NO med BAEC Cell
- Riktig aseptiske teknikker ble fulgt.
- Fjern seks-brønns plate fra inkubatoren og aspirer mediet fra den første brønnen. Vask cellene to ganger med 1 ml DPBS.
- Legg 210 mL av 1,9 mm jern (II) sulfat heptahydrat (FeSO 4 0.7 H 2 O, forberede nybakte ved oppløsning 0,8 mg i1 ml DPBS med CaCl 2 og MgCl 2) og 210 mL av ammonium N-metyl-D-glucamine dithiocarbamate (MGD, forberede nybakte ved oppløsning 2,7 mg i 500 mL DPBS med CaCl 2 og MgCl 2) med et forhold på 01:07 . (Merk:. Dette forholdet der overflødig MGD brukes har vært konvensjonelt ansatt for utarbeidelse av Fe 2 +-MGD kompleks skyldes at utbyttet for Fe 3 +-MGD er maksimert i nærvær av overflødig MGD Tilsetting av askorbat i løsning for å stabilisere Fe 2 +-MGD er ikke nødvendig siden NO-Fe 3 +-MGD dannes endogent reduseres til EPR påvises NO-Fe 2 +-MGD av askorbat, hydrokinon, eller cystein med konvertering effektivitet på opp til 99,9% .. Den lave spin diamagnetic staten Fe 2 + tillater påvisning av NO bruke flat celle eller kapillarrør uten behov for en lav temperatur enhet) 15.
- Swirl den resulterende suspensjon godt og legg 4,6 μl av kalsium ionophore (CAI) (utarbeidet fra en stamløsning på 1,9 mM ved oppløsning 1 mg i 1 ml DMSO).
- Swirl løsningen igjen og inkuber ved 37 ° C i 36 min for å ytterligere tillate reduksjon av NO-Fe 3 +-MGD til EPR påvises NO-Fe 2 +-MGD.
- Samle supernatanten (425 mL) i en Eppendorf rør og overføring til en EPJ flat celle (eller til en 50 mL kapillarrør).
- EPJ oppkjøp parametrene er: mikrobølgeovn frekvens: 9,8 GHz; sentrum feltet: 3427 G; modulasjon amplitude: 6,0 G; sweep bredde: 100 G; mottaker gevinst: 1 x 10 5; mikrobølgeeffekt: 10 mW, totalt antall skanninger: 121; sweep tid: 10 s; og tidskonstanten: 20 ms (Merk: Siden parametrene vil variere fra ett instrument og eksperimentelle forhold til en annen, derfor bare senteret feltet, frekvens og modulation amplitude er de viktigste parametrene for å vurdere.).
- Noter spektra ved romtemperatur og 2-D spektra ble tilpasset romkonseptetvurdert for å redusere bakgrunnsstøy og baseline korrigeres ved hjelp Bruker WinEPR Data Processing programvare eller andre data prosessering programvare. For kvantifisering av addukt formasjon, kan vanlige tomter konsentrasjon versus signal intensitet (eller område) bygges ved bruk av en NO donor SNAP.
2B. Enos frakobling Experiment
- Fjern seks-brønns plate fra inkubatoren og aspirer mediet fra den andre brønnen og vask to ganger med 1 ml DPBS.
- En peroxynitrite donor, 5-amino-3-(4-morpholinyl) -1,2,3-oxadiazolium klorid (SIN-1) ble brukt til Koble fra Enos 16. Tilsett 100 mL 0,5 mm sin-1 (M r 206.6 g / mol, fra 10 mm stamløsning nylaget ved oppløsning 1 mg SIN-en i 500 mL PBS uten Ca / Mg ioner) og fortynnet til 2 ml med DPBS og 10% FBS.
- Inkuber for 2 t ved 37 ° C og 5% CO 2.
- Fjern plate fra inkubatoren og vask to ganger med DPBS.
- Legg 210 mL av2,8 mM FeSO 4 0.7 H 2 O og 210 mL av 19,6 mm MGD nylaget henhold til prosedyren nevnt ovenfor.
- Swirl løsningen og legg 4,6 mL av 1,9 mm Cai.
- Swirl løsningen igjen og inkuber ved 37 ° C i 36 min.
- Samle supernatanten (425 mL) i en Eppendorf rør og overføring til en EPJ flat celle.
- EPJ oppkjøp parametrene er: mikrobølgeovn frekvens: 9,8 GHz; sentrum feltet: 3427 G; modulasjon amplitude: 6 G; sweep bredde: 100 G; mottaker gevinst: 1 x 10 5; mikrobølgeeffekt: 10 mW, totalt antall skanninger: 121; sweep tid: 10 s; og tidskonstanten: 20 ms.
- Ta opp spektra og 2-D spektra ble integrert for å redusere bakgrunnsstøy og baseline korrigert som nevnt ovenfor.
3. Påvisning av O 2 • - fra polymorfonukleære nøytrofile (PMNs)
- Nøytrofile ble isolert fra humant blod prøve som tidligere beskrevet 17.
- Lag en stamløsning av en M DMPO * i PBS som inneholder 0,1 mm dietylentriamin-pentaacetic syre (DTPA). DMPO har et smeltepunkt på 25-29 ° C, så det er mer praktisk å pipetter væske DMPO (tetthet ~ 1,02 g / ml ved 25 ° C) i et hetteglass (NB: Ikke bruk plast ampuller for veiing siden ren DMPO reagerer med plast). Frossen DMPO kan smeltes ved å kjøre lunkent vann til hetteglasset (NB: Ikke kjør varmt vann som DMPO kan brytes ned).
- Det er viktig å bruke høy renhet DMPO (> 99%) siden noen av de kommersielt tilgjengelige spin traps inneholde paramagnetisk urenheter, og derfor er det viktig å kjøre EPJ spekter av bare DMPO løsningen alene (10 mm i dette tilfellet). Det er viktig at ingen bakgrunn signal er tydelig (se figur 3A).
- Forbered stamløsning (1 mg / ml) av phorbol-12-myristate-13-acetat (PMA) i DMSO. Gjør alikvoter ved å fortynne løsningen til 10 mikrogram / ml i PBS.
- I en en.5 ml Eppendorf rør, forberede en løsning med et totalt volum på 0,6 ml ved å følge sekvensen av tillegg: ~ 10 6 celler per ml PMN, D-glukose (1 mg / ml) og albumin (1 mg / ml), 10 mM DMPO og 0,2 mikrogram / ml PMA. (Merk: PMA er den radikale aktivator og bør legges sist).
- Overfør løsningen til en EPJ flat celle.
- EPJ oppkjøp parametere forholdene er: mikrobølgeovn frekvens: 9,8 GHz; sentrum feltet: 3486 G; modulasjon amplitude: 0,5 G; sweep bredde: 100 G; mottaker gevinst: 5 x 10 5; totalt antall skanninger: 10; sweep tid: 30 s ; mikrobølgeeffektnivå: 20 mW, og tidskonstanten: 81 ms. For kvantifisering av addukt formasjon, kan vanlige tomter konsentrasjon versus signal intensitet (eller område) bli oppført ved hjelp av stabile nitroxides som TEMPO eller 3-karboksylsyre-PROXYL.
* Viktig merknad om bruk av DMPO: Ved å bruke en flat celle, kan man øke celle tetthet og dermed øke signalIntensiteten av spinn addukt men halveringstiden av O 2 • - addukt av DMPO er kort (t 1/2 ~ 1 min) som spaltes til DMPO-OH. DMPO kan erstattes med de samme konsentrasjonene av EMPO, BMPO eller DEPMPO som er tilgjengelig kommersielt for økt addukt stabilitet med t 1/2 ~ 8 og 14 min.
4. Representative Resultater
Spinn fangst av NO radikal ble utført ved hjelp Fe 2 +-MGD. Figur 2A og 2B viser ingen EPJ signal fra Fe 2 +-MGD eller blanding av Fe 2 +-MGD med Cai, indikerer at ingen NO bakgrunn signal stammer fra disse reagensene. BAEC ved stimulering med Cai frigjør NO, som reagerer med Fe 2 +-MGD å danne spin addukt, NO-Fe 2 +-MGD, og viser en karakteristisk triplett signal med hyperfine splitting konstant (HFSC) verdien av et N = 12,66 G og g-faktor på g = 2,040. (Figur 2C). Den hfsc verdien ble fastsatt ved hjelp av WINSIM simuleringsprogram som kan lastes ned fra NIEHS EPJ Software Database nettside. Den eksperimentelle HFSC er i samsvar med litteraturen verdien av en N = 12,70 G og g = 2,041 18 for NO-Fe 2 +-MGD addukt. Tilsvarende, senket effekten av SIN-1 på BAEC NO produksjonen på grunn av Enos uncoupling som vist i Figur 2D.
DMPO spin felle ble brukt for O 2 • - deteksjon. DMPO alene ikke ga et signal som vist i figuren 3A bekrefter at spinn fellen er fri fra paramagnetisk urenheter. Figur 3B er spekteret av DMPO og PMNs bare, og tilsvarende, er det ingen synlig signal som tyder på at DMPO ikke forårsaker aktivering av enzymet NADPH oksidase. Figur 3C viser observerte EPR signal ved stimulering av PMN ved PMA. De HFSC verdier for dette signalet var fast bestemt på å være en N = 14,71 G, A β-H = 11,40 G og en γ-H = 1,25 G, og er i samsvar med litteraturen verdier av en N = 14,3 G, en β-H = 11,7 G og en γ-H = 1,3 G 19 for DMPO-O 2 H addukt.
Figur 1. Flytskjema for påvisning av radikaler fra nøytrofile og BAEC bruker EPJ spinn fangst. (A) PMNs var blandet med DMPO og PMA, og den resulterende blandingen overført til en EPJ flat celle for datainnsamling. (B) BAEC ble dyrket på en plate, og vasket med DPBS. Den spin felle Fe (MGD) 2 ble lagt sammen med Cai. Løsningen ble blandet grundig og inkubert. Blandingen ble overført til en EPJ flat celle for EPJ datainnsamling.
Figur 2. EPJ påvisning av NO fra BAEC. (A) spekter av Fe 2 +-MGD bare (B) spekteret av Fe 2 +-MGD + CAI bare. (C) Triplet spekteret som følge av NO fangst av Fe 2 +-MGD hjelp CAI-stimulert celler. (D) Spectrum viser nedgang i NO produksjon grunnet 0,5 mm SIN-1 behandling av celler.
Figur 3. EPJ påvisning av DMPO-O 2 H fra aktivert nøytrofile. (A) spektrum av 10 mM DMPO bare. (B) spekter av PMN alene i nærvær av 10 mM DMPO. (C) spekteret av PMN aktiveres ved PMA i nærvær av 10 mM DMPO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EPJ spin fangst har vært ansatt i et bredt spekter av biomedisinske applikasjoner for å kvantifisere og identifisere frie radikaler. Spin fangst er svært følsom, i stand til å oppdage radikaler i konsentrasjoner som varierte fra nM til mM dermed gjør det egnet for bruk i biologiske systemer. Dannelsen av paramagnetiske addukt, NO-Fe 2 +-MGD, er grunnlaget for NO deteksjon via EPJ. Fe 2 +-MGD reagerer med NO raskt 18 til en rate på ~ 10 6 M -1 s -1. NO-Fe 2 +-MGD addukt har en lang halveringstid, og er svært stabil. Faktisk kan man skaffe seg EPR-spektra innen 24 timer etter at prøvene er samlet inn ved å fryse de løsningene ved -80 ° C som inneholder NO-Fe 2 +-MGD uten betydelig taper i signal intensitet (upubliserte resultater). Ulempen med Fe 2 +-MGD er at det er luft følsom og krever vanligvis blande 5 eller flere molar ekvivalenter av ligand tilFe (II). Oksidasjon av Fe 2 +-MGD til Fe 3 +-MGD av luft er uunngåelig og vanskelig å kontrollere, men i in vitro og in vivo-systemer, er NO-Fe 3 +-MGD addukt dannet redusert med biologiske reductants til EPJ påviselig addukt NO-Fe 2 +-MGD 15, derav behovet for askorbat tillegg kan utelates.
EPJ kan også brukes til å oppdage O 2 • - i biologiske systemer ved hjelp nitrone spin feller. Som et eksempel viser figur 3C spin fangst hjelp DMPO av O 2 • - generert fra PMA-aktivert PMN. En ulempe med å bruke DMPO som spin fellen er at frekvensen av O 2 • -/HO 2 • tillegg til DMPO er svært langsom (<1 M -1 s -1) ved nøytral pH som krever bruk av høye konsentrasjoner av DMPO ( 10-100 mm) for biologiske spin fangst applikasjoner. Videre er DMPO-O 2 H halveringstid kort (<1 min) 20 </ Sup>, som spaltes til DMPO-OH på grunn av tilstedeværelsen av β-hydrogen, og mangler mål spesifisitet gjør fastsettelse av stedet for radikale produksjon fra cellen tvetydig. Suksess i O 2 • - deteksjon avhenger av hvilken type celler som brukes. For eksempel genererer menneskelige nøytrofile upon stimulering betydelig fluks av O 2 • - som lett kan oppdages ved hjelp DMPO men forsiktighet bør gjøres når du arbeider med andre typer celler hvor radikal produksjonen er betydelig mindre robust (f.eks endoteliale eller epitelceller). Flere nitrones har blitt utviklet for å øke halveringstiden av av O 2 • - addukt som bruk av EMPO og BMPO med halveringstider på 7-8 12 min, 13 og DEPMPO som gir den lengste halveringstiden 14 min 21. Men satsene for spinn fangstinnretninger med O 2 • - av disse spin fellene fortsatt treg i forhold til DMPO, og derfor fortsatt krever bruk av høye konsentrasjonersjon av spinn feller. Bruken av tilfeldig rødsprit-β-cyclodextrin (Me-β-CD) som en co-reagens har også blitt brukt til å forbedre spin fangst evne nitrones for O 2 • -. For eksempel med isolert thylakoid membran og Photosystem II partikler, viste Snyrychova 22 høyere signal intensitet og addukt stabilitet for EMPO-O 2 H i nærvær av Me-β-CD i forhold til EMPO alene. Det anbefales sterkt å sammenligne signal intensitet generert fra nitrone-O 2 H i nærvær og fravær av Me-β-CD. Videre har målet spesifisitet av spin feller også vært en begrensning. Arbeidet med å utvikle mer forbedrede spin feller som tar deres dårlig reaktivitet til O 2 • -, kort addukt halveringstid og mål spesifisitet i en molekylær design er nå i gang 23-26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av NIH National Heart, Lung, and Blood Institute stipend RO1 HL81248.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol free DMEM medium High glucose 1X |
GIBCO | 31053 | |
| 0.25% Trypsin- EDTA | GIBCO | 25200 | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| MEM Non Essential Amino acids | GIBCO | 11140 | |
| Fetal Bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Endothelial Growth factor | Millipore | 02-102 | |
| CaI | Enzo Life Sciences | A-23187 | Dissolve in DMSO |
| SIN-1 | Enzo Life Sciences | BML-CN245-0020 | |
| DMPO | Dojindo Laboratories | D048-10 | |
| FeSO4.7H2O | Sigma Aldrich | 215422-250G | Dissolve in PBS with Ca and Mg |
| MGD | Enzo Life Sciences | ALX-400-014-M050 | Dissolve in PBS with Ca2+ and Mg2+ |
| BAEC cells | Cell Systems | 2B2-C75 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DPBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| Phorbol-myristate acetate (PMA) | Sigma Aldrich | 79346-1MG |
References
- Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Biol. 4, 278-286 (2008).
- Winterbourn, C. C., Hampton, M. B. Thiol chemistry and specificity in redox signaling. Free Radic. Biol. Med. 45, 549-561 (2008).
- Oxygen, Gene Expression, and Cellular Function. Clerch, L. B., Massaro, D. J. , (1997).
- Gutteridge, J. M. C., Halliwell, B. Antioxidants: Molecules, medicines, and myths. Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 561-564 (2010).
- Sumimoto, H. Structure, regulation and evolution of Nox-family NADPH oxidases that produce reactive oxygen species. FEBS J. 275, 3249-3277 (2008).
- Ignarro, L. J. Editor Nitric Oxide: Biology and Pathobiology. , Academic Press. San Diego, CA. (2009).
- Moreau, M. Differential effects of alkyl- and arylguanidines on the stability and reactivity of inducible NOS heme-dioxygen complexes. Biochemistry. 45, 3988-3999 (2006).
- Vasquez-Vivar, J. Superoxide generation by endothelial nitric oxide synthase: the influence of cofactors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 9220-9225 (1998).
- Villamena, F. A., Zweier, J. L. Detection of reactive oxygen and nitrogen species by EPR spin trapping. Antioxid. Redox Signal. 6, 619-629 (2004).
- Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. Spin trapping of superoxide and hydroxyl radical: practical aspects. Arch. Biochem. Biophys. 200, 1-16 (1980).
- Frejaville, C. 5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (DEPMPO): a new phosphorylated nitrone for the efficient in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals. J. Chem. Soc., Chem. Commun. , 1793-1794 (1994).
- Olive, G., Mercier, A., Le Moigne, F., Rockenbauer, A., Tordo, P.
- Villamena, F. A., Zweier, J. L. Superoxide radical trapping and spin adduct decay of 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (BocMPO): kinetics and theoretical analysis. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1340-1344 (2002).
- Tsuchiya, K. Nitric oxide-forming reactions of the water-soluble nitric oxide spin-trapping agent, MGD. Free Radical Biol. Med. 27, 347-355 (1999).
- Vanin, A. F., Poltorakov, A. P., Mikoyan, V. D., Kubrina, L. N., van Faassen, E. Why iron-dithiocarbamates ensure detection of nitric oxide in cells and tissues. Nitric Oxide. 15, 295-311 (2006).
- RojasWahl, R. U. Decomposition mechanism of 3-N-morpholinosydnonimine (SIN-1): A density functional study on intrinsic structures and reactivities. J. Mol. Model. 10, 121-129 (2004).
- Klempner, M. S., Gallin, J. I. Separation and functional characterization of human neutrophil subpopulations. Blood. 51, 659-669 (1978).
- Pou, S. Spin trapping of nitric oxide by ferro-chelates: kinetic and in vivo pharmacokinetic studies. Biochim. Biophys. Acta. 1427, 216-226 (1999).
- Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. Spin trapping. Kinetics of the reaction of superoxide and hydroxyl radicals with nitrones. J. Am. Chem. Soc. 102, 4994-4999 (1980).
- Britigan, B. E., Rosen, G. M. Spin-trapping and human neutrophils. Limits of detection of hydroxyl radical. J. Biol. Chem. 264, 12299-12302 (1989).
- Frejaville, C. 5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A new efficient phosphorylated nitrone for the in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals. J. Med. Chem. 38, 258-265 (1995).
- Snyrychova, I. Improvement of the sensitivity of EPR spin trapping in biological systems by cyclodextrins: A model study with thylakoids and photosystem II particles. Free Radical Biol. Med. 48, 264-274 (2010).
- Han, Y. Lipophilic beta-cyclodextrin cyclic-nitrone conjugate: Synthesis and spin trapping studies. J. Org. Chem. 74, 5369-5380 (2009).
- Han, Y., Tuccio, B., Lauricella, R., Villamena, F. A. Improved spin trapping properties by beta-cyclodextrin-cyclic nitrone conjugate. J. Org. Chem. 73, 7108-7117 (2008).
- Hardy, M. Detection, characterization, and decay kinetics of ROS and thiyl adducts of mito-DEPMPO spin trap. Chem. Res. Toxicol. 20, 1053-1060 (2007).
- Kim, S. -U. Fast reactivity of a cyclic nitrone-calix[4]pyrrole conjugate with superoxide radical anion: Theoretical and experimental studies. J. Am. Chem. Soc. 132, 17157-17173 (2010).
