Summary
Elektronparamagnetisk resonans (EPR)-spektroskopi användes för att detektera kväveoxid från bovina aortaendotelceller och superoxidradikalanjonen från humana neutrofiler med användning av järn (II)-N-metyl-D-glukamin ditiokarbamat, Fe (MGD)
Abstract
Reaktivt kväve / syrespecies (ROS / RNS) vid låga koncentrationer spela en viktig roll vid reglering av cellfunktioner, signalering, och immunsvar men med oreglerade koncentrationer är skadliga för cellviabilitet 1, 2. Även levande system har utvecklats med endogena och kostvanor mekanismer antioxidant försvar för att reglera ROS generation, är ROS produceras kontinuerligt som naturliga biprodukter av normal metabolism av syre och kan orsaka oxidativ skada på biomolekyler som resulterar i förlust av proteiners funktion, DNA klyvning, eller lipid peroxidation 3 och slutligen till oxidativ stress som leder till cellskada eller död 4.
Superoxidradikalen anjon (O 2 • -) är den huvudsakliga prekursor av några av de mest höggradigt oxiderande arter som är kända för att existera i biologiska system, såsom peroxinitrit och hydroxylradikal. Generering av O 2 • - signalerar det första tecknet på oxidativt utbrott, och därför its detektering och / eller beläggs i biologiska system är viktig. I denna demonstration O 2 • - genererades från polymorfonukleära neutrofiler (PMN: er). Genom kemotaktisk stimulering med forbol-12-myristat-13-acetat (PMA), genererar PMN O 2 • - via aktivering av nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat (NADPH)-oxidas 5.
Kväveoxid (NO)-syntas som finns i tre isoformer, som inducerbar-, neuronal-och endotel-NOS, eller iNOS, nNOS och eNOS, respektive, katalyserar omvandlingen av L-arginin till L-citrullin, med användning av NADPH som producerar NO 6 . Här genererade vi NO från endotelceller. Vid oxidativa stressförhållanden, kan eNOS exempelvis gå från att producera NO till O 2 • - i en process som kallas losskopplingen, som tros vara orsakad av oxidation av heme 7 eller co-faktor, tetrahydrobiopterin (BH4) 8.
Det är endast ett fåtaltillförlitliga metoder för detektering av fria radikaler i biologiska system, men är begränsade av specificitet och känslighet. Spin trapping-är vanligen används för identifiering av fria radikaler och innefattar tillsats reaktion av en radikal med en spin trap bildar en ihållande spinn-addukt som kan detekteras genom elektronparamagnetisk resonans (EPR)-spektroskopi. De olika radikala addukterna uppvisar distinkta spektrum som kan användas för att identifiera radikalerna som genereras och kan ge en mängd information om natur och kinetik av radikal produktions 9.
De cykliska nitroner, 5,5-dimetyl-pyrrolin-N-oxid, DMPO 10, den fosforyl-substituerade DEPMPO 11, och den ester-substituerad, EMPO 12 och BMPO 13, har använts i stor utsträckning som spin traps - sistnämnda spinn fällor uppvisar längre halveringstider för O 2 • - addukt. Järn (II)-N-metyl-D-glukamin ditiokarbamat, Fe (MGD) 2 </ Sub> används ofta för att fånga NO på grund av höga adduktbildning och den höga stabiliteten i spinn addukten 14.
Protocol
1. Kultur av bovina aortaendotelceller (BAEC)
- Riktiga aseptisk teknik följdes.
- I ett vattenbad, varmt medium utan antibiotika vid 37 ° C.
Anmärkning: Det medium som består av fenol Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 4,5 g / L D-glukos, 4 mM L-glutamin, 1% icke-essentiella aminosyror, kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 2,5 mg / L endotelial tillväxtfaktor.
- Ta bort T75 kolv som innehåller celler från inkubatorn och rengör ytan på kolven med 70% etanol innan den placeras inne i huvan.
- Avlägsna den gamla mediet med användning av en aspirator och tvätta två gånger med 5 ml av Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS).
- Tillsätt 2 ml trypsin och vänta på 4-5 minuter för celler att lösgöra samtidigt som man periodiskt inspektera under mikroskop.
- Tillsätt 3 ml av mediet och upprepade gånger blanda med en pipett för att separera Than celler och skapar en jämn suspension.
- Överför 5 ml av mediet med trypsin till en 15 ml-rör och centrifugera vid 121 g under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten med användning av en aspirator. Tillsätt 5 ml DPBS och blanda väl. Centrifugera vid 121 g under 5 min.
- Sug av supematanten och återsuspendera cellpelleten genom tillsats av 6 ml av mediet.
- På en 6-brunnsplatta, tillsätt 1 ml av cellsuspension till varje brunn och tillsätt sedan 1 ml av mediet. Blanda suspensionen med en pipett.
- Märka plattan och inkubera över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
2A. Detektion av NO med BAEC Cell
- Riktiga aseptisk teknik följdes.
- Avlägsna 6-brunnsplatta från inkubatorn och aspirera mediet från den första brunnen. Tvätta cellerna två gånger med 1 ml DPBS.
- Tillsätt 210 pl av 1,9 mM järn (II) sulfat heptahydrat (FeSO 4 0,7 H2O, framställa färska genom upplösning av 0,8 mg i1 ml DPBS med CaCl2 och MgCl2) och 210 pl av ammonium-N-metyl-D-glukamin ditiokarbamat (MGD, framställa färska genom upplösning av 2,7 mg i 500 | il DPBS med CaCl2 och MgCl2) med användning ett förhållande av 01:07 . (Notera:. Detta förhållande där överskott MGD används har konventionellt användes för framställningen av Fe2 +-MGD komplex beroende på det faktum, att utbytet för Fe3 +-MGD maximeras i närvaro av överskott av MGD Tillsatsen av askorbat i lösning för att stabilisera Fe2 +-MGD är inte nödvändigt eftersom den NO-Fe3 +-MGD bildas endogent reduceras till EPR detekterbart NR-Fe2 +-MGD genom askorbat, hydrokinon, eller cystein med omvandlingsverkningsgrad upp till 99,9% .. Den låga spinn diamagnetiska tillstånd Fe 2 + medger detektion av NO med användning platt cell eller kapillärrör utan behov av en låg temperatur anordning) 15.
- Snurra erhållna suspensionen väl och tillsätt 4,6 μil kalciumjonofor (CAI) (framställd från en stamlösning av 1,9 mM genom upplösning av 1 mg i 1 ml DMSO).
- Virvla lösningen på nytt och inkuberades vid 37 ° C under 36 min för att ytterligare möjliggöra reduktion av NO-Fe3 +-MGD till EPR detekterbart NR-Fe2 +-MGD.
- Samla upp supernatanten (425 | il) i ett Eppendorf-rör och överföring till ett EPR platt cell (eller till en 50 | il kapillärrör).
- EPR förvärv parametrar är: mikrovågsugn frekvens: 9,8 GHz, mittfält: 3427 G, modulering amplitud: 6,0 g; svep bredd: 100 G, mottagare vinst: 1 x 10 5, mikrovågseffekt: 10 mW; Totalt antal skanningar: 121; sveptiden: 10 s, och tidskonstanten: 20 MS (Notera: Eftersom parametrarna kommer att variera från ett instrument och experimentella förhållanden till en annan, således endast den centrala området, frekvens och amplitud-modulering är de viktigaste parametrarna att överväga.).
- Registrera spektra vid rumstemperatur och 2-D-spektra har därmed blivitbetygsatt att minska bakgrundsljud och baslinjen korrigeras med hjälp Bruker WinEPR Data Processing programvara eller annan databehandling programvara. För kvantifiering av adduktbildning, kan standardmetoder plottar av koncentration mot signalintensitet (eller area) konstrueras genom användning av en NO-donator SNAP.
2B. eNOS Uncoupling Experiment
- Avlägsna 6-brunnsplatta från inkubatorn och aspirera mediet från den andra brunn och tvätta två gånger med 1 ml DPBS.
- En peroxinitrit donator, 5-amino-3-(4-morfolinyl) -1,2,3-oxadiazolium klorid (SIN-1) användes för att frikoppla eNOS 16. Tillsätt 100 pl av 0,5-SIN 1 mM (Mj. 206,6 g / mol, från 10 mM stamlösning nyberedd genom att lösa 1 mg SIN-1 i 500 | il PBS utan Ca / Mg-joner) och utspädd till 2 ml med DPBS och 10% FBS.
- Inkubera under 2 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Avlägsna plattan från kuvösen och tvätta två gånger med DPBS.
- Tillsätt 210 pl av2,8 mM FeSO 4 0,7 H2O och 210 | il av 19,6 mM MGD nyberedd enligt det förfarande som nämndes ovan.
- Virvla lösningen och tillsätt 4,6 | il av 1,9 mM CAI.
- Virvla lösningen på nytt och inkuberades vid 37 ° C under 36 minuter.
- Samla upp supernatanten (425 | il) i ett Eppendorf-rör och överföring till ett EPR platt cell.
- EPR förvärv parametrar är: mikrovågsugn frekvens: 9,8 GHz, mittfält: 3427 G, modulering amplitud: 6 G, svep bredd: 100 G, mottagare vinst: 1 x 10 5, mikrovågseffekt: 10 mW; Totalt antal skanningar: 121; sveptiden: 10 s, och tidskonstanten: 20 ms.
- Registrera spektra och 2-D-spektra integreras för minskning av bakgrundsbrus och baslinjen korrigeras såsom nämnts ovan.
3. Detektering av O 2 • - från polymorfonukleära neutrofiler (PMN: er)
- Neutrofiler isolerades ur humant blodprov såsom tidigare beskrivits 17.
- Göra en stamlösning av 1 M DMPO * i PBS innehållande 0,1 mM dietylentriamin-pentaättiksyra (DTPA). DMPO har en smältpunkt på 25-29 ° C så det är mer praktiskt att pipettera vätska DMPO (densitet ~ 1,02 g / ml vid 25 ° C) i en injektionsflaska av glas (Obs: använd inte plast flaskor för vägning då rent DMPO reagerar med plast). Fryst DMPO kan smältas genom att köra ljummet vatten på flaskan (Obs! kör inte hett vatten som DMPO kan sönderdelas).
- Det är viktigt att använda hög renhet DMPO (> 99%) eftersom en del av de kommersiellt tillgängliga spin fällor innehåller paramagnetiska föroreningar, och därför är det absolut nödvändigt att köra EPR spektrum av just den DMPO lösningen enbart (10 mM i detta fall). Det är kritiskt att ingen bakgrundssignal är uppenbart (se figur 3A).
- Framställ stamlösning (1 mg / ml) av forbol-12-myristat-13-acetat (PMA) i DMSO. Göra alikvoter genom utspädning av lösningen till 10 pg / ml i PBS.
- I en 1.5 ml Eppendorf-rör, framställa en lösning med en total volym av 0,6 ml genom att följa sekvensen av tillsats: ~ 10 6 celler per ml av PMN, D-glukos (1 mg / ml) och albumin (1 mg / ml), 10 mM DMPO och 0,2 | ig / ml PMA. (Notera: PMA är radikalen aktivator och bör tillsattes sist).
- Överför lösningen till en EPR platt cell.
- EPR förvärv parametrar förutsättningar: mikrovågsugn frekvens: 9,8 GHz, mittfält: 3486 G, modulering amplitud: 0,5 G, svep bredd: 100 G, mottagare vinst: 5 x 10 5, Totalt antal skanningar: 10; Sweep tid: 30 s ; mikrovågseffekt: 20 mW, och tidskonstant: 81 ms. För kvantifiering av adduktbildning, kan standardmetoder plottar av koncentration mot signalintensitet (eller area) konstrueras genom användning av de stabila nitroxider såsom TEMPO eller 3-karboxylsyra-PROXYL.
* Viktig anmärkning om användningen av DMPO: Genom att använda en platt cell kan man öka celltätheten och därmed öka signalenintensitet spin addukten, men halveringstiden av O 2 • - addukt av DMPO är kort (t 1/2 ~ 1 min), som sönderdelas till DMPO-OH. DMPO kan vara substituerad med samma koncentrationer av EMPO, BMPO eller DEPMPO som är tillgängliga kommersiellt för ökad stabilitet addukt med t 1/2 ~ 8 och 14 min.
4. Representativa resultat
Spin trapping av NO-radikalen utfördes med användning av Fe2 +-MGD. Figur 2A och 2B visar ingen EPR signalen från Fe2 +-MGD eller blandning av Fe2 +-MGD med CAI, vilket indikerar att ingen NO bakgrundssignal härrör från dessa reagens. BAEC vid stimulering med CAI frigör NO som reagerar med Fe2 +-MGD att bilda spinn-addukt, NR-Fe2 +-MGD, och visar en karakteristisk triplett signal med hyperfina klyvning konstant (hfsc) värdet av ett N = 12,66 G och g-faktor g = 2,040. (Figur 2C). HFSC värdet bestämdes med hjälp av WINSIM simulering program som kan laddas ner från NIEHS EPR Software Databas hemsida. Den experimentella hfsc överensstämmer med litteraturvärdet av en N = 12,70 G och g = 2,041 18 för NO-Fe2 +-MGD addukt. På liknande sätt sänks effekten av SIN-1 på BAEC den NO-produktion på grund av eNOS frånkoppling såsom visas i figur 2D.
DMPO spin trap användes för O 2 • - upptäckt. DMPO enbart gav inte en signal, som visas i figur 3A bekräftar att denna spin trap är fri från paramagnetiska föroreningar. Figur 3B är det spektrum av DMPO och PMN endast, och på liknande sätt, finns det ingen detekterbar signal, vilket antyder att DMPO inte orsakar aktivering av enzymet NADPH-oxidas. Figur 3C visar det observerade EPR signalen vid stimulering av PMN med PMA. De hfsc värdena för denna signal bestämdes att vara en N = 14,71 G, a β-H = 11,40 G och en γ-H = 1,25 G, och är förenliga med de värden i litteraturen för en N = 14,3 G, en β-H = 11,7 G och en γ-H = 1,3 G 19 för DMPO-O 2 H-addukt.
Figur 1. Flödesschema för upptäckt av radikaler från neutrofiler och BAEC med EPR spin trapping. (A) PMN var blandad med DMPO och PMA, och den resulterande blandningen överfördes till en EPR platt cell för datainsamling. (B) BAEC odlades på en platta och tvättades med DPBS. Denna spin trap Fe (MGD) 2 tillsattes tillsammans med CAI. Lösningen blandades noggrant och inkuberades. Blandningen överfördes till en EPR platt cell för EPR datainsamling.
Figur 2. EPR detektering av NO från BAEC. (A) Spectrum av Fe 2 +-MGD bara (B) Spectrum av Fe 2 +-MGD + CAI bara. (C) Triplett-spektrum som följer NR infångning av Fe2 +-MGD användning CAI-stimulerade celler. (D)-spektrum visar minskning i NO-produktion på grund av 0,5 mM SIN-1-behandling av celler.
Figur 3. EPR upptäckt av DMPO-O 2 H från aktiverade neutrofiler. (A) Spectrum 10 mM DMPO bara. (B) Spektrum av PMN ensam i närvaro av 10 mM DMPO. (C)-spektrum av PMN aktiveras av PMA i närvaro av 10 mM DMPO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EPR spin trapping har varit anställd i ett brett spektrum av biomedicinska tillämpningar för att kvantifiera och identifiera fria radikaler. Spin trapping-är mycket känslig, kan detektera radikaler vid koncentrationer varierande från nM till | iM, vilket sålunda gör den lämplig för användning i biologiska system. Bildningen av det paramagnetiska addukt, NR-Fe2 +-MGD, är grunden för NO-detektion via EPR. Fe 2 +-MGD reagerar med NO snabbt 18 med en hastighet av ~ 10 6 m -1 s -1. NO-Fe 2 +-MGD addukt har en lång halveringstid och är mycket stabil. I själva verket kan en få EPR-spektra inom 24 timmar efter proven har samlats in genom att frysa de lösningar vid -80 ° C, innehållande NO-Fe 2 +-MGD utan betydande förlora signalstyrka (opublicerade resultat). Nackdelen med Fe2 +-MGD är att det är luftkänsliga och kräver vanligen att blanda 5 eller flera molekvivalenter av liganden tillFe (II). Oxidation av Fe2 +-MGD till Fe3 +-MGD genom luft är oundviklig och svår att kontrollera, emellertid, i in vitro och in vivo-system, är den NO-Fe3 +-MGD addukt bildas minskas genom biologiska reduktionsmedel till EPR detekterbara addukt NO-Fe 2 +-MGD 15, därav behovet av askorbat Dessutom kan utelämnas.
EPR kan också användas för att detektera O 2 • - i biologiska system som utnyttjar nitronsteroider spin traps. Som ett exempel visar fig. 3C Spin trapping användning DMPO av O 2 • - genereras från PMA-aktiverade PMN. En nackdel med att använda DMPO som spin trap är att graden av O 2 • -/HO 2 • Utöver DMPO är mycket långsam (<1 M -1 s -1) vid neutralt pH-värde som kräver användning av höga koncentrationer av DMPO ( 10-100 mM) för biologiska tillämpningar spin trapping. Dessutom är DMPO-O 2 H halv livslängd kort (<1 minut) 20 </ Sup> som sönderdelas till DMPO-OH på grund av närvaron av β-väte, och saknar målspecificitet göra bestämningen av den plats där radikala produktion från cellen tvetydig. Framgång i O 2 • - detektering beror på typen av celler som används. Till exempel genererar humana neutrofiler vid stimulering betydande flöde av O 2 • - som lätt kan detekteras med hjälp av DMPO men försiktighet bör göras när man hanterar andra typer av celler där radikaler är betydligt mindre robust (t.ex. endotelceller och epitelceller). Flera nitroner har utvecklats för att öka halveringstiden för den av O 2 • - addukt, såsom användning av EMPO och BMPO med halveringstider av 7-8 min 12, 13, och DEPMPO vilket ger den längsta halveringstid 14 min 21. Dock andelen spinn fångstmetoder med O 2 • - av dessa spin fällor fortfarande långsam jämfört med DMPO och därför fortfarande kräver användning av hög koncentrationning av spin fällor. Användningen av slumpmässigt metylerad-β-cyklodextrin (Me-β-CD) såsom ett samreagens har också använts för att förbättra Spin trapping förmåga nitroner för O 2 • -. Exempelvis med användning av isolerade tylakoida membranet och fotosystem II partiklar visade Snyrychova 22 högre signalintensitet och addukt stabilitet för EMPO-O 2 H i närvaro av Me-β-CD jämfört med EMPO enbart. Det rekommenderas starkt att jämföra signalintensiteter genererade från nitron-O 2 H i närvaro och frånvaro av Me-β-CD. Dessutom har målspecificiteten hos spin traps också varit en begränsning. Arbetet med att utveckla fler förbättrade spin fällor som tar sitt dåliga reaktivitet till O 2 • -, kort addukt halveringstid och målspecificitet i en molekylär design pågår nu 23-26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av NIH National Heart, Lung, and Blood Institute bidrag RO1 HL81248.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol free DMEM medium High glucose 1X |
GIBCO | 31053 | |
| 0.25% Trypsin- EDTA | GIBCO | 25200 | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| MEM Non Essential Amino acids | GIBCO | 11140 | |
| Fetal Bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Endothelial Growth factor | Millipore | 02-102 | |
| CaI | Enzo Life Sciences | A-23187 | Dissolve in DMSO |
| SIN-1 | Enzo Life Sciences | BML-CN245-0020 | |
| DMPO | Dojindo Laboratories | D048-10 | |
| FeSO4.7H2O | Sigma Aldrich | 215422-250G | Dissolve in PBS with Ca and Mg |
| MGD | Enzo Life Sciences | ALX-400-014-M050 | Dissolve in PBS with Ca2+ and Mg2+ |
| BAEC cells | Cell Systems | 2B2-C75 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DPBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| Phorbol-myristate acetate (PMA) | Sigma Aldrich | 79346-1MG |
References
- Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Biol. 4, 278-286 (2008).
- Winterbourn, C. C., Hampton, M. B. Thiol chemistry and specificity in redox signaling. Free Radic. Biol. Med. 45, 549-561 (2008).
- Oxygen, Gene Expression, and Cellular Function. Clerch, L. B., Massaro, D. J. , (1997).
- Gutteridge, J. M. C., Halliwell, B. Antioxidants: Molecules, medicines, and myths. Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 561-564 (2010).
- Sumimoto, H. Structure, regulation and evolution of Nox-family NADPH oxidases that produce reactive oxygen species. FEBS J. 275, 3249-3277 (2008).
- Ignarro, L. J. Editor Nitric Oxide: Biology and Pathobiology. , Academic Press. San Diego, CA. (2009).
- Moreau, M. Differential effects of alkyl- and arylguanidines on the stability and reactivity of inducible NOS heme-dioxygen complexes. Biochemistry. 45, 3988-3999 (2006).
- Vasquez-Vivar, J. Superoxide generation by endothelial nitric oxide synthase: the influence of cofactors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 9220-9225 (1998).
- Villamena, F. A., Zweier, J. L. Detection of reactive oxygen and nitrogen species by EPR spin trapping. Antioxid. Redox Signal. 6, 619-629 (2004).
- Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. Spin trapping of superoxide and hydroxyl radical: practical aspects. Arch. Biochem. Biophys. 200, 1-16 (1980).
- Frejaville, C. 5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (DEPMPO): a new phosphorylated nitrone for the efficient in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals. J. Chem. Soc., Chem. Commun. , 1793-1794 (1994).
- Olive, G., Mercier, A., Le Moigne, F., Rockenbauer, A., Tordo, P.
- Villamena, F. A., Zweier, J. L. Superoxide radical trapping and spin adduct decay of 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (BocMPO): kinetics and theoretical analysis. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1340-1344 (2002).
- Tsuchiya, K. Nitric oxide-forming reactions of the water-soluble nitric oxide spin-trapping agent, MGD. Free Radical Biol. Med. 27, 347-355 (1999).
- Vanin, A. F., Poltorakov, A. P., Mikoyan, V. D., Kubrina, L. N., van Faassen, E. Why iron-dithiocarbamates ensure detection of nitric oxide in cells and tissues. Nitric Oxide. 15, 295-311 (2006).
- RojasWahl, R. U. Decomposition mechanism of 3-N-morpholinosydnonimine (SIN-1): A density functional study on intrinsic structures and reactivities. J. Mol. Model. 10, 121-129 (2004).
- Klempner, M. S., Gallin, J. I. Separation and functional characterization of human neutrophil subpopulations. Blood. 51, 659-669 (1978).
- Pou, S. Spin trapping of nitric oxide by ferro-chelates: kinetic and in vivo pharmacokinetic studies. Biochim. Biophys. Acta. 1427, 216-226 (1999).
- Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. Spin trapping. Kinetics of the reaction of superoxide and hydroxyl radicals with nitrones. J. Am. Chem. Soc. 102, 4994-4999 (1980).
- Britigan, B. E., Rosen, G. M. Spin-trapping and human neutrophils. Limits of detection of hydroxyl radical. J. Biol. Chem. 264, 12299-12302 (1989).
- Frejaville, C. 5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A new efficient phosphorylated nitrone for the in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals. J. Med. Chem. 38, 258-265 (1995).
- Snyrychova, I. Improvement of the sensitivity of EPR spin trapping in biological systems by cyclodextrins: A model study with thylakoids and photosystem II particles. Free Radical Biol. Med. 48, 264-274 (2010).
- Han, Y. Lipophilic beta-cyclodextrin cyclic-nitrone conjugate: Synthesis and spin trapping studies. J. Org. Chem. 74, 5369-5380 (2009).
- Han, Y., Tuccio, B., Lauricella, R., Villamena, F. A. Improved spin trapping properties by beta-cyclodextrin-cyclic nitrone conjugate. J. Org. Chem. 73, 7108-7117 (2008).
- Hardy, M. Detection, characterization, and decay kinetics of ROS and thiyl adducts of mito-DEPMPO spin trap. Chem. Res. Toxicol. 20, 1053-1060 (2007).
- Kim, S. -U. Fast reactivity of a cyclic nitrone-calix[4]pyrrole conjugate with superoxide radical anion: Theoretical and experimental studies. J. Am. Chem. Soc. 132, 17157-17173 (2010).
