Summary
Questo studio descrive la diagnosi dell'influenza aviaria nei volatili selvatici utilizzando un portatile rRT-PCR sistema. Il metodo si avvale di liofilizzati reagenti per lo screening degli uccelli selvatici in un non-laboratorio di impostazione, tipica di uno scenario di un'epidemia. L'uso di strumenti molecolari fornisce alternative accurata e sensibile per la diagnosi rapida.
Abstract
Gli uccelli selvatici sono stati implicati nella diffusione dell'influenza aviaria altamente patogena (HPAI) del sottotipo H5N1, spingendo la sorveglianza lungo le rotte migratorie. Campionamento degli uccelli selvatici di virus dell'influenza aviaria (AIV) è spesso condotto in regioni remote, ma i risultati sono spesso in ritardo a causa della necessità di trasportare i campioni a un laboratorio attrezzato per i test molecolari. In tempo reale della trascrittasi inversa reazione a catena della polimerasi (RRT-PCR) è una tecnica molecolare che offre uno dei metodi più accurati e sensibili per la diagnosi di AIV. I protocolli di laboratorio precedentemente indispensabile per rRT-PCR sono ora adattato per il campo. Sviluppo di reagenti liofilizzati (liofilizzato) che non richiedono catena del freddo, con sensibilità a livello di reagenti bagnato ha portato il collaudo in loco remoto ad un obiettivo pratico.
Qui vi presentiamo un metodo per la diagnosi rapida di AIV nei volatili selvatici utilizzando un rRT-PCR unità (Ruggedized Advanced Device identificazione dei patogeni o RAPID, Tecnologie Idaho, Salt Lake City, UT), che impiega reagenti liofilizzati (Influenza A Obiettivo 1 Taqman; Asay -ASY-0109, Tecnologie Idaho). I reagenti contengono tutti i componenti necessari per il test a concentrazioni appropriate in un unico tubo: primer, sonde, enzimi, tamponi interni e controlli positivi, eliminando gli errori associati alla conservazione impropria o la manipolazione di reagenti bagnato. L'unità portatile esegue uno schermo per l'influenza A colpire il gene matrice rendimenti e dei risultati in 2-3 ore. Tipizzazione genetica è possibile anche con innesco H5 e H7 fissa che colpiscono il gene emoagglutinina.
Il sistema è adatto per l'uso su campioni cloacali e orofaringeo raccolti da uccelli selvatici, come dimostrato qui sulla specie migratrice shorebird, il piro-piro occidentale (Calidrus mauri) catturato nel nord della California. Trattamento degli animali seguiti protocolli approvati dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo del Centro geologico degli Stati Uniti occidentali Survey Research ecologica e permette il Geological Survey degli Stati Uniti Uccello Banding laboratorio. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di accelerare la diagnosi degli uccelli selvatici, aumentando le probabilità di contenere un focolaio in una postazione remota. Sul posto la diagnosi sarebbe rivelarsi utile anche per individuare e studiare gli individui infetti nelle popolazioni selvatiche. La possibilità di raccogliere informazioni sulla biologia dell'ospite (risposta immunologica e fisiologica alle infezioni) e l'ecologia spaziale (prestazioni migratorie degli uccelli infetti) fornirà intuizioni sulla misura in cui gli uccelli selvatici possono fungere da vettori per AIV su lunghe distanze.
Protocol
1. La cattura di uccelli selvatici con reti mist
- Per la cattura shorebird, istituito reti nebbia in un sito attivo foraggiamento come una palude, litorale, o fango piatto.
- Far scorrere la linea tramagli anelli di una delle estremità della rete nebbia attorno al palo e inserire palo verticalmente nel fango.
- Stendi la rete, inserire il secondo polo attraverso cicli tramagli all'altra estremità della rete di nebbia e verticalmente inserire palo in fango, assicurandosi che le linee tramaglio viene insegnato.
- Una volta un uccello viene catturato, estrarre l'uccello dalla rete e tornare alla stazione di bande.
2. Cloacali tampone di campionamento
- Raccogliere tamponi cloacali subito dopo la cattura
- Individuare la cloaca e l'uso punta delle dita per spingere indietro le piume circostanti
- Scartare una sterile in dacron o in poliestere con punta tampone, gambo fine prima, e inumidire la punta con sterili mezzi di trasporto virale per una maggiore facilità di tampone. Dopo umidificazione, l'intera testa del tampone viene delicatamente inserito nella cloaca. Tampone la circonferenza interna della cloaca lentamente twirling il tampone e rimuovere il tampone da cloaca.
- Inserendo la punta del tampone direttamente nella fiala di trasporto campione virale media; ruotare l'albero tampone tra il pollice e l'indice, mentre il tampone è nella media. Sono un assistente completare la procedura di tirando la punta del bastoncino indietro dal fondo della fiala ~ 1 cm e tagliare l'albero del tampone con un paio di forbici in modo da la punta del tampone rimane nel flaconcino e l'albero non interferisce con tappo di chiusura. Cap fiala ermeticamente. Disinfettare le forbici con l'alcol tra taglio alberi tampone.
- Mettere le fiale in una scatola congelatore contenente ghiaccio secco o impacchi di ghiaccio.
3. Orofaringea tampone di campionamento
- Aprire delicatamente il becco in modo che la fessura delle coane è visibile
- Scartare un tampone pulito dal pacchetto, gambo fine prima, e inumidire la punta con mezzi di trasporto virale per una maggiore facilità di tampone
- Senza toccare la punta di altre superfici, inserirlo nella bocca e tamponare l'apertura delle coane sul tetto della bocca e proseguire verso la regione orofaringea o della gola
- Posizionare la punta del tampone direttamente nel flacone virale mezzi di trasporto. Ruotare l'albero tampone tra il pollice e l'indice, mentre il tampone è nella media. Come sopra, sono un assistente tirare la punta del bastoncino indietro dal fondo della fiala ~ 1 cm e tagliare l'albero del tampone con un paio di forbici in modo da la punta del tampone rimane nel flaconcino e l'albero non interferisce con cappuccio chiusura. Cap fiala ermeticamente. Disinfettare le forbici con l'alcol tra taglio alberi tampone.
- Mettere le fiale in una scatola congelatore contenente ghiaccio secco o impacchi di ghiaccio.
4. Uccello gestione e il rilascio
- Ritorno degli uccelli al sito di catturare e rilasciare in modo tempestivo (<20 minuti). I gestori devono essere consapevoli dei principi di benessere degli animali e stare attenti per i segni di sofferenza durante il campionamento degli uccelli (per esempio abrasioni, la cattura miopatia e ipo-o ipertermia). Un kit di base di primo soccorso dovrebbe essere incluso nella lista allegata.
5. Collaudo impianti
- I campioni possono essere testati in uno spazio chiuso come un rimorchio di ricerca o tenda, con un alimentatore (tensione regolata generatore di corrente) per eseguire l'unità di PCR e computer collegato.
6. Estrazione di RNA
- Estrazione di RNA è stata effettuata con il kit RNeasy Mini con piccole modifiche alle istruzioni del produttore seguenti Spackman et al 1.
- Vortex mezzo tampone per 3-5 s ed il trasferimento 350 microlitri di una provetta da 2 ml. Nota: tenere campione resto sul ghiaccio in caso di PCR-positivi i campioni devono essere ricontrollati, H5 o test deve essere eseguito.
- Aggiungere 350 ml di tampone RLT (con β-me) e vortex per 5 s.
- Aggiungere 350 ml di etanolo RNA grado 70%.
- Centrifugare a 5000 xg per 5 min.
- Aggiungere 600 ml di supernatante a una colonna di spin posto in un tubo di raccolta da 2 ml. Conservare il campione rimanente in rack provetta.
- Centrifugare per 20 s a 10.000 xg ed eliminare flow-through.
- Ripetere i passaggi 17-18 fino a tutto il campione è stato passato attraverso colonna.
- Luogo Spin Column in un ambiente pulito 2 ml di tubo di raccolta.
- Aggiungere 700 ml di tampone RW1 alla colonna e centrifugare rotazione 25 s a 10.000 x g. Gettare il flow-through.
- Aggiungere 500 microlitri di buffer RPE alla colonna di spin e centrifugare per 25 s a 10.000 x g. Gettare il flow-through.
- Ripetere il punto 22 per un totale di due lavaggi con tampone RPE.
- Centrifugare la colonna girare per altri 2 minuti a 14.000 x g. Eliminare Collection Tube.
- Posizionare la colonna girare in un ambiente pulito microcentrifuga 1,5 ml di tubo e aggiungere 50μl di acqua priva di nucleasi. Incubare a temperatura ambiente per 60 s.
- Eluire RNA dal giro per 60 s a 10.000 XGFo 60 s. Luogo purificato campione sul ghiaccio.
7. Preparazione controlli negativi
- Reagenti liofilizzati sono stati predisposti per essere utilizzati nel test PCR in base alle istruzioni del Technologies Idaho Freeze-Dried kit reagenti di rilevamento per l'influenza A sonde TaqMan Obiettivo 1 (Asay-ASY-0109).
- Centrifuga fiala reagente di controllo negativo (rosso) per 3 s per assicurarsi pellet sono in fondo.
- Togliere il tappo, visivamente fare pellet che sono in fondo.
- Aggiungere 20 ml di tampone di ricostituzione X 2 e 20 l di acqua grado reagente.
- Riassunto e vortex per 5 s alla massima velocità.
- Centrifugare per 3 s per portare liquidi a fondo del flacone.
- Controllare visivamente il pellet è reidratato, se non ripetere i passaggi 31-32.
- Pipettare 19 ml di miscela idratata in un tubo capillare LightCycler, ripetere il passaggio in una pipetta capillare secondo per ottenere un duplicato.
8. Preparazione di campioni
- Centrifugare le provette sconosciuto reagente (blu) per 3 secondi per assicurare pellet sono in fondo.
- Togliere il tappo, visivamente fare pellet che sono in fondo.
- Aggiungere 40 ml di RNA purificato.
- Riassunto e vortex per 5 s alla massima velocità.
- Centrifugare per 3 s per portare liquidi a fondo del flacone.
- Controllare visivamente il pellet è reidratato, se non ripetere i passaggi 38-39.
- Pipettare 19 ml di miscela idratata in un tubo capillare LightCycler, ripetere il passaggio in una pipetta capillare secondo per ottenere un duplicato.
9. Preparazione di controlli positivi
- Centrifugare il positivo fiala reagente di controllo (verde) per 3 s per assicurarsi pellet sono in fondo.
- Togliere il tappo, visivamente fare pellet che sono in fondo.
- Aggiungere 20 ml di tampone di ricostituzione X 2 e 20 l di acqua grado reagente.
- Riassunto e vortex per 5 s alla massima velocità.
- Centrifugare per 3 s per portare liquidi a fondo del flacone.
- Controllare visivamente il pellet è reidratato, se non ripetere i passaggi 45-46.
- Pipettare 19 ml di miscela idratata in un tubo capillare LightCycler, ripetere il passaggio in una pipetta capillare secondo per ottenere un duplicato.
10. Centrifugazione dei tubi capillari
- Una volta che tutti i tubi capillari per la partita sono stati preparati caricarli nel mini-centrifuga dotati di adattatori capillare.
- Centrifugare a valore più basso tenendo premuto il pulsante di impulsi verso il basso per 1 s. Questo trasferimento di liquido sul fondo, in preparazione per il test.
11. Funzionamento del RAPID
- Creare un nuovo file. Etichetta di controllo positivo, controllo negativo, e campioni (per il loro numero ID).
- Programma 1: Tenere campioni di RNA di preparazione
- Cicli = 1
- Modalità di analisi = Nessuno
- Temperatura target = 40
- Tempo di incubazione = 30 min
- Temperatura di transizione Rate = 20 ° C / s (default)
- Obiettivo secondario di temperatura = 0 (default)
- Step Size = 0 (default)
- Ritardo passo = 0 (default)
- Modalità di acquisizione = Nessuno (default)
- Programma 2: RNA Denaturazione
- Cicli = 1
- Modalità di analisi = Nessuno
- Temperatura target = 94
- Tempo di incubazione = 120s
- Temperatura di transizione Rate = 20 ° C / s (default)
- Obiettivo secondario di temperatura = 0 (default)
- Step Size = 0 (default)
- Ritardo passo = 0 (default)
- Modalità di acquisizione = Nessuno (default)
- Programma 3: Amplificazione dell'RNA
- Cicli = 45
- Modalità di analisi = Auto Analisi
- Obiettivo di temperatura, Segmento 1 = 94; Segmento 2 = 60
- Tempo di incubazione, Segmento 1 = 0 s, Segmento 2 = 20 s
- Vota la temperatura di transizione, Seg 1 & 2 = 20 ° C / s (default)
- Temperatura target secondarie, Seg 1 & 2 = 0 (default)
- Dimensione passo, Seg 1 & 2 = 0 (default)
- Passo di ritardo, Seg 1 & 2 = 0 (default)
- Modalità di acquisizione, Segmento 1 = Nessuno; Segmento 2 = singolo
- Parametri fluorescenza
- Modalità di visualizzazione: fluorescenza canale 2 (CH2 / 1)
Guadagni:- Cap. 1 (F1) = 1
- Cap. 2 (F2) = 8
- Cap. 3 (F3) = 1
- Per visualizzare i dati di fluorescenza in tempo reale per ogni campione, selezionare il campione di interesse e clicca sul pulsante 'Grafico Show' nella parte inferiore dello schermo
- Modalità di visualizzazione: fluorescenza canale 2 (CH2 / 1)
- Per ogni capillare, i risultati sono i seguenti:
- # - Identifica la posizione carosello della giostra
- Nome del campione - fornisce il nome del campione
- Controllo - identifica il tipo di campione per ogni campione
- Score - calcolato con il rapporto tra fluorescenza del campione e il livello di fluorescenza di fondo nel campione
- Risultato - visualizza il risultato complessivo per il campione
12. Rappresentante dei risultati:
Presenti: Un rosso chiamata 'presente' per un test / campione incognito indica che l'obiettivo è stato identificato nel campione e che i controlli sono stati positivi.Non rilevato: un verde 'non rilevato' appello per una prova / campione incognito indica che l'obiettivo non è stato identificato nel campione e che i controlli di test hanno avuto successo.
Si prega di ripetere: A 'ripetere' indica che il controllo positivo o negativo non è riuscito.
Un esempio di analisi di successo dal RAPID 7200 è mostrata in Figura 4. Il controllo positivo è amplificato e genera fluorescenza rilevabile (asse y) a circa 25 cicli (asse x). Un ciclo soglia (CT)> 35 è il cut-off concordato per la maggior parte dei laboratori di riferimento AIV. Pertanto, i controlli positivi di questo metodo ha prodotto un segnale fluorescente entro il numero accettato di cicli (0-35) per il rilevamento AIV. Al contrario, il controllo negativo non genera un segnale fluorescente, anche dopo 45 cicli. Allo stesso modo, i dodici campioni raccolti da piovanelli occidentale non ha generato un segnale fluorescente che indica che gli uccelli sono risultati negativi per AIV. Follow-up test di tutti i campioni positivi in un laboratorio tradizionale è incoraggiato a garantire che nessun falsi positivi sono erroneamente prodotte.
Figura 1. Shorebird la cattura con reti nebbia.
Figura 2. La raccolta dei campioni cloacali e orofaringei almeno piovanelli.
Figura 3. Programmazione del RAPID 7200 per l'amplificazione di RNA.
Figura 4. Fluorogram generati dal RAPID 7200 portatile rRT-PCR mostra come controlli positivi e negativi dovrebbe comparire in un test di successo. Clicca qui per visualizzare l'immagine full size
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Discussion
Il metodo di diagnosi rapida qui presentati facilita test rapido ed accurato di campioni di uccelli selvatici per la sorveglianza di AIV. Il tanto meno severi requisiti campione di storage portatili rRT-PCR sono adatti per le situazioni in cui la manutenzione a distanza di una catena del freddo può essere impraticabile se spedizionieri azoto liquido o ghiaccio secco non è disponibile. Inoltre, abbiamo riscontrato che l'analisi del campione con i reagenti liofilizzati era abbastanza semplici per essere eseguite da biologi campo con una conoscenza minima di laboratorio basati su analisi molecolare. La tecnica era il momento-efficiente e anche economico. Con un operatore, era possibile eseguire tre lotti, con conseguente in 42 proiezioni per AIV ogni giorno in un ambiente campo. Abbiamo valutato che tutti i materiali necessari al funzionamento di questo sistema potrebbe essere portato in qualsiasi posizione e la metodologia potrebbe essere insegnato a un operatore nel corso di una giornata. Il fattore limitante nelle situazioni di campo remoto è l'alimentazione necessaria per eseguire il portatile rRT-PCR unità e computer collegato, ma questo può essere mitigato attraverso l'utilizzo di una tensione regolata generatore portatile di energia elettrica. Inoltre, la sequenza del RNA estratto o il campione originale è possibile solo nei casi in cui la catena del freddo può essere temporaneamente mantenuto fino alla consegna ad un laboratorio.
La nostra analisi precedente ha indicato che il portatile rRT-PCR unità aveva specificità identica (100%) e sensibilità paragonabile (98%) per l'isolamento del virus eseguito in un laboratorio setting2. Precedenti studi di validazione hanno dimostrato che i falsi negativi sono l'errore più comune con rRT-PCR per l'ampio potenziale di impropria preparazione del campione, la presenza di inibitori della PCR nel materiale fecale o la degradazione del reagente liofilizzato tallone 1,3-4. Un altro difetto della tecnica è la sensibilità dei reagenti liofilizzato in vista di ceppi emergenti di AIV. Il virus è in uno stato costante di rimpasto genomica dovunque eserciti si sovrappongono, ipotesi supportata da numerosi studi filogenetici 5-8. Quindi primer e sonde rilasciato per l'uso con portatili rRT-PCR richiedono costante ri-convalida. Per esempio, i reagenti specifici per linee americane ed eurasiatici dei sottotipi H5 e H7 raccomandati sono ora a causa della divergenza del virus a seconda della regione biogeografica 9. Come per tutti gli altri test sul campo, sospettato positivi HPAIV devono essere trasportati ad un impianto autorizzato a effettuare test conferma definitiva con la VI per la massima sensibilità e specificità 10.
In conclusione, questo studio ha dimostrato che portatile rRT-PCR è adatto allo scopo di screening campioni cloacali dagli uccelli selvatici per l'AIV nei non-laboratorio impostazioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di accelerare la diagnosi degli uccelli selvatici, aumentando le probabilità di contenere un focolaio in una postazione remota con un tempo di risposta più veloci. Portatile rRT-PCR rappresenta anche una svolta per i ricercatori che cercano di svelare il ruolo degli uccelli selvatici nella diffusione di AIV. La capacità di diagnosticare lo stato ospite al momento del campionamento permette di raccogliere informazioni biologiche di affrontare le questioni chiave sulle risposte immunologiche e fisiologiche da 11 a infezioni, o le caratteristiche genetiche associate alla resistenza naturale negli uccelli selvatici 12. Moreover, la distribuzione trasmettitori satellitari costosi su host confermato per seguire i loro movimenti sarebbe stato prezioso per identificare le specie che fungono da lunga distanza portatori di AIV e valutare le loro prestazioni migratori, preferenze ambientali e livelli di interazione con il pollame. Future test operativi in aree di interesse internazionale per HPAIV, come Asia centrale e meridionale 13, in maniera conclusiva determinare in che modo rapido rRT-PCR unità di eseguire nell'ambito di scenari di scoppio quando la diagnosi di un gran numero di campioni positivi è time-critical.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Desideriamo ringraziare M. Scullion e R. Crisp delle Tecnologie Idaho per il supporto tecnico e la USGS occidentale Centro di Ricerca Ecologica per il finanziamento (S. Schwarzbach) e assistenza (K. Spragens, T. Graham). Questa ricerca è stata effettuata sotto l'egida del Centro per la Tecnologia Innovativa - Istituto per la Difesa e Sicurezza Nazionale (www.idhs.org), a sostegno del Dipartimento della Difesa e Air Force Research Laboratory. Trattamento degli animali seguiti protocolli approvati dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo del Centro geologico degli Stati Uniti occidentali Survey Research ecologica e permette il Geological Survey degli Stati Uniti Uccello Banding laboratorio. Qualsiasi utilizzo di nomi commerciali, prodotti o società in questa pubblicazione è solo a fini descrittivi e non implica approvazione da parte del governo degli Stati Uniti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy mini spin column | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Collection tubes (1.5 & 2 mL) | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RLT | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RW1 | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RPE | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| RNase-free water | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| 14.3 M β-mercapt–thanol solution | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) | Idaho Technologies | ASAY-ASY-0109 | |
| Lightcycler 20ml capillary tubes | Roche Group | 04929292001 | |
| Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Pentium-based laptop with Windows XP Professional | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Lightcycler Data Analysis software | Idaho Technologies | Included in RAPID kit |
References
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Takekawa, J. Y. Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents. J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).
- Das, A., Spackman, E., Senne, D., Pedersen, J., Suarez, D. L. Development of an internal positive control for rapid diagnosis of avian influenza virus infections by real-time reverse transcription-PCR with lyophilized reagents. J Clin Microbiol. 44, 3065-3073 (2006).
- Spackman, E., Suarez, D. L. Avian influenza virus RNA extraction from tissue and swab material. Methods Mol Biol. 436, 13-18 (2008).
- Chen, R., Holmes, E. C. Frequent inter-species transmission and geographic subdivision in avian influenza viruses from wild birds. Virology. , 383-3156 (2009).
- Macken, C. A., Webby, R. J., Bruno, W. J. Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus. J Gen Virol. 87, 2803-2815 (2006).
- Dugan, V. G. The evolutionary genetics and emergence of avian influenza viruses in wild birds. PLoS Pathog.. 4, e1000076-e1000076 (2008).
- Spackman, E. Phylogenetic analyses of type A influenza genes in natural reservoir species in North America reveals genetic variation. Virus Res. 114, 89-100 (2005).
- Pasick, J. Advances in the molecular based techniques for the diagnosis and characterization of avian influenza virus infections. Transbound Emerg Dis. 55, 329-338 (2008).
- OIE Manual of diagnostics tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees). 1, 258-269 (2004).
- Weber, T. P., Stilianakis, N. I. Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds. Emerg. Infect. Dis. 13, 1139-1143 (2007).
- Kim, J. -K., Negovetich, N. J., Forrest, H. L., Webster, R. G. Ducks: the "Trojan Horses" of H5N1 influenza. Influenza and Other Respiratory Viruses. , 121-128 (2009).
- Gilbert, M. Flying over an infected landscape: distribution of highly pathogenic avian influenza H5N1 risk in South Asia and satellite tracking of wild waterfowl. Ecohealth. , (2010).
